CN104004689B

CN104004689B - 能降解2,4–滴丁酯和敌敌畏的菌株及其制备修复菌剂的方法

Info

Publication number: CN104004689B
Application number: CN201410256536.XA
Authority: CN
Inventors: 李同祥; 孙会刚; 黄天姿; 候进慧; 王陶; 懂玉玮; 高兆建; 刘全德; 王庆芝
Original assignee: Xuzhou University of Technology
Current assignee: Xuzhou University of Technology
Priority date: 2014-06-10
Filing date: 2014-06-10
Publication date: 2016-05-18
Anticipated expiration: 2034-06-10
Also published as: CN104004689A

Abstract

本发明公开了一种能降解2,4–滴丁酯和敌敌畏的菌株及其制备修复菌剂的方法，所述菌株为革兰氏阴性菌，显微镜下可见菌株菌体为短杆状。透射电镜下，具有极生鞭毛。在LB平板上培养菌落呈圆形、油滴状、黄色、不透明，表面湿润、粘稠，边缘整齐。在短时间内对2,4-滴丁酯和敌敌畏降解率分别为99.82%和99.65%，该菌株为<i>Pseudomonas？sp.</i>LT1菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC？No.？7947。该菌株可用于上述农药的生物降解，以及农药污染的土壤及农产品的生物修复和生物净化。

Description

能降解2,4–滴丁酯和敌敌畏的菌株及其制备修复菌剂的方法

技术领域

本发明属于化学农药生物降解技术领域，涉及一株土生细菌Pseudomonassp.LT1菌株，及其对农药2,4–滴丁酯和敌敌畏的降解作用，可用于土壤农药污染的原位修复工程。

背景技术

农、兽药是目前世界各国防治农作物病虫害和养殖业病害的有效手段。大量化学农、兽药,特别是高毒、高残留农兽药的使用,成为食品安全和危害人们健康的主要“杀手”。

目前，主要使用的化学农药按其功能不同,主要分为杀虫剂(Insecticide)、除草剂(Herbicide)和杀菌剂(Fungicide)三大类。依据化学结构不同,可分为有机氯类、有机磷类、拟除虫菊脂类、氨基甲酸脂类和无机农药等多种类型。这些化学农药的共同特点是:①有毒性,且靶向性差；②残留性,一般分为高残留、中残留和低残留等；③迁移性和累积性,可通过空气、土壤或地下水发生迁移,甚至在生物体内累积。有机磷类杀虫剂成为目前使用量最大的农药之一,多属于高效农药。目前,有机磷农药包括甲拌磷、乙拌磷、内吸磷、对硫磷、甲胺磷、乙酰甲胺磷、杀螟硫磷、特普、敌百虫、乐果、马拉硫磷、甲基对硫磷、二甲硫吸磷、敌敌畏、甲基内吸磷、氧化乐果、久效磷等。有机氯农药有滴滴涕、六六六、林丹、甲氧、高残毒DDT、硫丹。常用的拟除虫菊脂类农药有溴氰菊脂、氯氰菊脂、氯菊脂、胺菊脂、甲醚菊脂等。氨基甲酸酯类有西维因、叶蝉散、涕灭威、呋喃丹和异索威等。

在我国的农药品种结构中，具有高毒和“三致性”的杀虫剂占全部农药的40％以上，我国农药剧毒、高毒农药品种居多，存在着“3个70％”，即：农药中杀虫剂占70％；杀虫剂中有机磷类品种占70％；有机磷类中少数几个高毒品种占70％。

目前，世界上有机磷农药(Organophosphoruspesticides,OPs)的种类已达150多种，成为使用量最大的农药之一，我国生产的有机磷农药的品种就有20余种，年产量超过100kt，占我国农药总产量的80％以上。

据统计，我国施用农药面积在218亿hm²以上，每年用量50～60万吨。这些施用的农药，有50％～60％残留于土壤。目前,我国约有87～107万hm²的农田土壤受到有机磷农药严重污染，危害也越来越大。主要表现为：

一是有机磷农药在杀死靶标生物的同时,也或多或少地杀死非靶标生物,对周围环境乃至整个生态环境造成严重的破坏。

二是土壤中有机磷的成分含量过高，通过粮食、蔬菜、水果等间接影响人体和动物的健康。有机磷农药对人体的危害不仅表现在干扰人体化学信息的传递，破坏身体的酶，而且它阻碍器官发挥正常的生理功能，导致神经系统功能失调。癌症、不孕症、内分泌紊乱等疾病均与有机磷农药污染有关。

三是有机磷农药对土壤微生物数量、种群结构和生物活性产生严重影响，造成土壤生产力下降。土壤微生物是调节土壤肥力的重要因素。高毒性有机磷农药的不断使用，破坏了土壤微生物的繁殖，使敏感性的菌种受到抑制，土壤微生物的多样性遭到破坏，种群趋于单一化，引起原有的平衡紊乱功能失调从而影响土壤物质和能量的循环，影响土壤微生物的氨化硝化和呼吸作用等，由此破坏了土壤结构和理化性质，土地肥力持续下降。

为治理有机磷农药对生态环境的危害，各国的研究人员做了大量的农药降解方法研究，建立了生物降解、化学降解、光化学降解、超声波、洗涤剂和电离辐射等。而土壤中有机磷农药污染的治理主要是通过微生物降解有机磷农药。从上个世纪60年代开始，在污染物降解菌的分离、污染土壤微生物多样性以及微生物中污染物降解基因的克隆等方面均有一定的研究。到目前为止，已分离到多种降解有机磷农药微生物，包括细菌、放线菌、真菌及藻类，其中细菌和真菌最多，细菌研究的较为透彻。细菌中优势菌主要为假单胞菌、芽胞杆菌、产碱杆菌、无色杆菌、黄杆菌等，真菌主要是霉菌。有的微生物专一降解某种农药，表现出降解惰性，如节杆菌和气杆菌等。有的能同时降解多种农药，比较典型的有假单胞菌和芽胞杆菌等，可降解同类农药的多种品种或不同类型农药品种。有的不直接降解农药，而是通过共代谢完成降解过程。许多研究者从自然土壤和环境中分离或筛选了大量的农药降解菌，如从长期使用毒死蜱的土壤中分离了一株可降解毒死蜱的真菌曲霉和一株可降解毒死蜱和甲胺磷的真菌木霉；通过富集培养和亚硝基肌诱变处理得到一株降解甲胺磷活性较高的华丽曲霉，它同时能降解乐果和对硫磷等有机磷农药；分离得到一株能以甲胺磷为唯一碳源、氮源和能源生长的曲霉M-2；从农药厂污泥中分离得到一株具有较高降解氧乐果活性的黑曲霉；从污泥中分离得到一株可降解乐果的不动菌属菌株，它以共代谢方式降解乐果，还能降解敌敌畏和对硫磷等农药；还分离得到一株能降解甲胺磷、敌敌畏和对硫磷的地衣芽抱杆菌。这些研究大大丰富了有机磷农药降解菌阵营。但是，据《国际微生物学会联盟通讯》有关专家估计，全球约有50万～60万种微生物，而今已被研究和记载的还不到5％，在如此丰富的微生物资源库中，由于自然环境及其它理化条件的差异，尤其是长期受农药胁迫的环境中，仍有很多能降解农药的微生物未被发现，现在分离到的还只是沧海一粟。因此，降解农药的微生物还需进一步的发现和研究。

研究发现新的农药降解菌，可丰富降解农药微生物的种类，为土壤生物修复技术的研究和应用提供依据，为构建有机磷降解高效工程菌提供新的资源，推进生物修复工程的发展，造福人类具有重要意义。

发明内容

本发明从土壤样本中分离筛选得到一株对2,4–滴丁酯和敌敌畏具有高效降解能力的细菌菌株；本发明提供该菌株的鉴定特征和16SrDNA序列、菌株的分离筛选、菌株的生理生化特征、菌株对2,4–滴丁酯和敌敌畏的降解作用。本发明在发现和确定该菌株对2,4–滴丁酯和敌敌畏具有高效降解特性的基础上，还提供应用该菌株降解土壤中2,4–滴丁酯和敌敌畏菌剂发酵的方法。

本发明的技术方案概述如下:

能降解2,4–滴丁酯和敌敌畏的菌株，该菌株为革兰氏阴的假单胞菌属，命名为Pseudomonassp.LT1菌株，于2013年7月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；保藏号为CGMCCNo.7947。

所述的能降解2,4–滴丁酯和敌敌畏的菌株，该菌株16SrDNA序列为SEQIDNO.1所示。

所述的能降解2,4–滴丁酯和敌敌畏的菌株制备修复菌剂的方法，步骤如下：

步骤一，将Pseudomonassp.LT1菌株接种于LB培养基中，振荡培养至对数期；

步骤二，将步骤一培养好的种子液按照体积比为10％接种于种子罐的培养基中，通入无菌空气，振荡培养至对数期；

步骤三，将步骤二培养后的种子液以体积比10％接种入生产罐发酵培养至菌体数量达到8亿个/ml以上。

所述的能降解2,4–滴丁酯和敌敌畏的菌株制备修复菌剂的方法，步骤一中振荡培养条件可以为30℃，100转/小时。

所述的能降解2,4–滴丁酯和敌敌畏的菌株制备修复菌剂的方法，步骤二中振荡培养条件可以为30℃，180转/分钟。

所述的能降解2,4–滴丁酯和敌敌畏的菌株制备修复菌剂的方法，步骤二中无菌空气的通入量可以为0.55-0.65m³/分钟。

所述能降解2,4–滴丁酯和敌敌畏的菌株制备修复菌剂的方法，步骤二中的培养基组分以及含量可以如下：可溶性淀粉3％，KNO₃0.1％，NaCl0.05％，K₂HPO₄0.05％，MgSO₄0.05％和FeSO₄0.001％；以上均为质量比。

附图说明

图1为菌株Pseudomonassp.LT1的透射电镜照片(1μm)；

图2为菌株Pseudomonassp.LT1的透射电镜照片(0.2μm)；

图3为菌株Pseudomonassp.LT1菌落形态；

图4为2,4-滴丁酯为唯一碳源的固体培养基形成的水解圈(浓度为300mg/L)；

图5为敌敌畏为唯一碳源的固体培养基形成的水解圈(浓度为300mg/L)；

图6为菌株Pseudomonassp.LT1的系统发育地位分析。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1:菌株分离与纯化

菌株Pseudomonassp.LT1从甘肃省张掖市大弓农药厂污水处理池的活性污泥中分离得到，具体驯化、筛选、分离步骤为:取50g污泥，置于装有100mL培养基A的500mL三角瓶中，先后加入100mg/L敌敌畏和相同量2,4-滴丁酯，30℃，100r/min,振荡培养14d。取上层浊液10mL，置于含有40mL培养基A的250mL三角瓶中，加入300mg/L敌敌畏和相同量2,4-滴丁酯，30℃，100r/min,振荡培养14d。再取上层浊液10mL，同法培养3次，在这3次中，敌敌畏和2,4-滴丁酯逐级分别提高到500mg/L、800mg/L、1200mg/L。分别取1mL菌液于灭菌的平皿中，加入15mL含300mg/L的敌敌畏和2,4-滴丁酯，再加入冷却至45℃左右的培养基B，30℃，培养3d。挑取有透明降解圈的单菌落，在同样的培养基上纯化3次，得到纯化菌株。

所述的各培养基的组分及配比为：

培养基A(g.L^-1)：NH₄NO₃0.5，Na₂HPO₄1.19，KH₂PO₄0.45，MgSO₄0.5，去离子水1000ml，pH6.8。

培养基B(g.L^-1)：在培养基A中加20g琼脂。

富集培养基：即LB液体培养基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，摇动容器直至溶质溶解。用5mol/L的NaOH调pH至7.0。

该菌株为革兰氏阴性菌，显微镜下可见菌株菌体为短杆状。透射电镜下，具有极生鞭毛(图1和图2)。在LB平板上培养24h后菌落形态呈圆形、油滴状、黄色、不透明，表面湿润、粘稠，边缘整齐(图3)。

该菌株在以2,4-滴丁酯(浓度为300mg/L)为唯一碳源的固体培养基平板上培养48h后形成的水解圈示意图(图4)，在以敌敌畏(浓度为300mg/L)为唯一碳源的固体培养基平板上培养48h后形成的水解圈示意图(图5)。

该菌株的理化特征为葡萄糖发酵液体培养基变成了黄色，能够利用葡萄糖，产生有机酸，但是不产生气体；不能产生淀粉酶水解淀粉，为阴性反应。V.P试验中培养基两天内不显现红色，不能产生乙酰甲基甲醇，为阴性反应；甲基红试验中，培养基呈黄色，在糖代谢过程中不能产生丙酮酸，为阴性反应；吲哚试验中，没有吲哚存在，乙醚层没有玫瑰红色环状物生成，不能分解蛋白胨中的色氨酸形成吲哚，此为阴性反应；石蕊牛乳试验，培养48h后，培养基呈现粉色，能够发酵乳糖产酸。氧化酶试验，加盐酸二甲基对苯二铵溶液，呈现粉红色，并逐渐加深，能够产生氧化酶；接触酶试验，滴加1滴3％的过氧化氢后，有气泡产生，具有接触酶活性，能够产生接触酶，为阳性反应；硝酸盐还原试验，能使硝酸盐还原为氮气。其生理生化特征见表1。

表1菌株为Pseudomonassp.LT1的生理生化特征

生理生化	鉴定结果
		革兰氏染色	G^-
葡萄糖发酵	产酸不产气
		淀粉水解	-
V.P试验	-
		甲基红试验	-
吲哚试验	-
		石蕊牛乳反应	产酸
氧化酶试验	+
		接触酶试验	+
硝酸盐还原试验	+

经过检测得到该菌株16SrDNA序列为SEQIDNO.1所示。

通过16SrRNA序列分析和生理生化鉴定，确定该菌为Pseudomonassp.(假单胞菌属)，图6为菌株Pseudomonassp.LT1的系统发育地位分析，我们将其命名为Pseudomonassp.LT1。实施例2:菌株对敌敌畏、2,4-滴丁酯的降解能力

在三个100mL灭菌的三角瓶中均加入20mL无机盐培养基A，然后分别添加敌敌畏和2,4-滴丁酯浓度至300mg/L，按10％的接种量接入对数生长期的Pseudomonassp.LT1菌株，然后置于摇床(30℃、160rpm)中振荡培养，相应地配置3个不含该菌剂的对照，对照组同样在上述条件下进行培养。

在培养中定时取样，通过高效液相色谱分别测定敌敌畏和2,4-滴丁酯浓度。该菌对敌敌畏和2,4-滴丁酯的降解率见表2(表中数值为三个重复的平均值)。

高效液相测定敌敌畏色谱条件：色谱柱HypersilC18柱；流动相为甲醇-水＝65:35(V/V)；流速:1.0ml/min；检测波长:215nm；柱温:室温；进样量:20μl。

高效液相测定2,4-滴丁酯色谱条件：色谱柱HypersilC18柱；流动相:V(甲醇)：V(乙腈)：V(柠檬酸缓冲溶液)＝29：21：50；流速：1.5mL/min；检测波长230nm,柱温:室温；进样量:15μ1。

降解率(％)＝(1－处理样品残留量/对照样品残留量)×100％。

表2Pseudomonassp.LT1菌对敌敌畏和2,4-滴丁酯的降解率

在培养2d后，本发明降解菌对300mg/L2,4-滴丁酯和敌敌畏降解率分别为89.73％和92.75％，该菌剂3d后将2,4-滴丁酯和敌敌畏几乎彻底降解，降解率分别为99.82％和99.65％，而所有未加菌的对照在2d和3d后降解率均小于7％，分析这可能是由于在培养过程中农药的挥发损失所致，结果表明该菌剂对敌敌畏有很强的降解能力。

本实施例说明分离得到的Pseudomonassp.LT1可利用2,4-滴丁酯和敌敌畏作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，并具备高效降解2,4-滴丁酯和敌敌畏的能力。

实施例3:菌株降解土壤中的2,4-滴丁酯和敌敌畏

从试验田里取土作为供试土样。将土样过2-mm筛，2,4-滴丁酯和敌敌畏分别用丙酮溶解，硅藻土吸附，干燥硅藻土，拌入无菌土壤中，使农药被完全吸附。使每公斤土壤含农药量为20mg，新鲜培养至对数生长期的菌液，在5000rpm离心5min后，收集菌体，用无菌去离子水洗涤3次后再用无菌水重悬，以10％的接种量接入上述土样中，搅拌均匀，每一种土样各取100g于30℃恒温培养箱中培养，不接菌的作为对照，期间土壤的持水量保持在65％。培养3天和5天后分别取样，按照快速溶剂萃取(ASE)方法制样，环己烷萃取土样中的农药，土壤中残留的2,4-滴丁酯和敌敌畏的高效液相检测方法参照前述。通过样品与对照的比较来确定农药的降解率。降解率(％)＝(1－处理样品残留量/对照样品残留量)×100％。测定结果见表3。

表3Pseudomonassp.LT1菌株对土壤中2,4-滴丁酯和敌敌畏降解率

从表可以得出，在实验室条件下，经过3天的培养后，Pseudomonassp.LT1分别对敌敌畏和2,4-滴丁酯的降解率分别达到84.98％和83.03％。5天后，对敌敌畏和2,4-滴丁酯的降解率分别为96.20％和97.06％。以上结果说明，Pseudomonassp.LT1菌株在施入土壤中后，没有出现不产生降解作用或降解率急剧下降的现象，它的降解性能仍然稳定。

实施例4:修复菌剂的发酵

使用上述菌株生产修复菌剂的工艺为:试管斜面种-摇瓶种子液-种子罐-产品(包装剂型为液体菌剂)。

(1)将Pseudomonassp.LT1(CGMCCNo.7947)试管种接种于摇瓶(LB培养基)中，30℃，100r/min，振荡培养至对数期。

(2)将上述培养好的种子液按10％(v/v，以培养液体积计算)的接种量接种入种子发酵罐，种子罐培养条件为无菌空气的通气量为0.55-0.65m³/min，搅拌速度为180转/分，培养温度为30℃，培养至对数期，种子罐所用的培养基配方为:可溶性淀粉3％，KNO₃0.1％，NaCl0.05％，K₂HPO₄0.05％，MgSO₄0.05％，FeSO₄0.001％，余量为水；以上均为质量比。

(3)将种子液按生产罐培养基的10％接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，发酵罐发酵结束后菌体数量达到8亿个/ml以上，发酵完成后培养液分装成瓶。

序列表

<110>徐州工程学院

<120>能降解2,4–滴丁酯和敌敌畏的菌株及其制备修复菌剂的方法

<130>1

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1495

<212>DNA

<213>16SrRNA

<400>1

agagtttgatcctggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagc60

ggatgaagggagcttgctcctggattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatct120

gcctggtagtgggggacaacgtttcgaaaggaacgctaataccgcatacgtcctacggga180

gaaagcaggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcggattagctagtt240

ggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtca300

cactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggaca360

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cactttaagttgggaggaagggttgtagattaatactctgcaattttgacgttaccgaca480

gaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgtta540

atcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggtttgttaagttggatgtgaaatccc600

cgggctcaacctgggaactgcatccaaaactggcaagctagagtatggtagagggtggtg660

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ggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggccctt1200

acggcctgggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgccaagccgcgaggt1260

ggagctaatcccataaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtga1320

agtcggaatcgctagtaatcgcgaatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggccttg1380

tacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaccagaagtagctagtctaaccttc1440

gggaggacggttaccacggtgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggta1495

Claims

1.能降解2,4–滴丁酯和敌敌畏的菌株，其特征在于，该菌株为革兰氏阴的假单胞菌属，命名为Pseudomonassp.LT1菌株，保藏号为CGMCCNo.7947。

2.根据权利要求1所述的能降解2,4–滴丁酯和敌敌畏的菌株，其特征在于，该菌株16SrDNA序列为SEQIDNO.1所示。

3.权利要求1所述的能降解2,4–滴丁酯和敌敌畏的菌株制备修复菌剂的方法，其特征在于，步骤如下：

步骤一，将Pseudomonassp.LT1菌株接种于LB培养基中，振荡培养至对数期；

步骤二，将步骤一培养好的种子液按照体积比为10%接种于种子罐的培养基中，通入无菌空气，振荡培养至对数期；

步骤三，将步骤二培养后的种子液以体积比10%接种入生产罐发酵培养至菌体数量达到8亿个/ml以上。

4.根据权利要求3所述的能降解2,4–滴丁酯和敌敌畏的菌株制备修复菌剂的方法，其特征在于，步骤一中振荡培养条件为30℃，100转/分钟。

5.根据权利要求3所述的能降解2,4–滴丁酯和敌敌畏的菌株制备修复菌剂的方法，其特征在于，步骤二中振荡培养条件为30℃，180转/分钟。

6.根据权利要求3所述的能降解2,4–滴丁酯和敌敌畏的菌株制备修复菌剂的方法，其特征在于，步骤二中无菌空气的通入量为0.55-0.65m³/分钟。

7.根据权利要求3所述能降解2,4–滴丁酯和敌敌畏的菌株制备修复菌剂的方法，其特征在于，步骤二中的培养基组分以及含量如下：可溶性淀粉3%，KNO₃0.1%，NaCl0.05%，K₂HPO₄0.05%，MgSO₄0.05%和FeSO₄0.001%；以上均为质量比。