CN102041290A - 植物叶际农药降解菌的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种能适应植物叶际环境的农药降解菌的筛选方法。该方法主要是以植物叶片为营养物制作培养基，从植物叶片分离微生物，将农药加入培养基，筛选其降解微生物，步骤包括：叶际微生物培养基的制备、叶际微生物的分离培养和保存、农药降解菌的筛选。该方法筛选到的农药降解微生物能够适应叶际生存环境，在活体植物表面高效降解农药残留。

Description

植物叶际农药降解菌的筛选方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种能适应植物叶际环境的农药降解菌的筛选方法。

背景技术

植物地上部分(包括叶、茎、花、果等)的表面和内部存在有大量的各种类型的微生物。这些在叶际生存的微生物称为叶际微生物。这些叶际微生物既有阻碍植物生长、发育的病原微生物，又有拮抗病原物的生防微生物，还有固氮作用和对叶面农药残留有降解作用的微生物，而更多的是尚不明确其生态功能的微生物，而植物的叶际环境对于叶际微生物而言，是一种极端环境，主要表现在：(1)温度和湿度波动大；(2)受到的阳光紫外线辐射强；(3)营养有限、分布不均；(4)植物种类繁多，叶际结构和性质多种多样。由于叶际环境的复杂性，为了适应在叶际环境中生存，叶际微生物的群落特征也很可能非常复杂而别具特色，这些微生物也可能为我们提供许多编码具有很强耐受特性的基因资源。

农药在现代化农业发展过程中发挥了重要作用，据估计如果不使用农药，农作物受病虫害的影响将减产一半以上。但是大量施用的农药，仅有很少一部分作用于靶标，大部分残留于植物上或散落入土壤，不仅污染环境而且影响食品安全。一些发达国家以保护环境和健康的名义向我国多种农副产品树起“绿色壁垒”，农药残留问题一直是影响我国农副产品出口的主要障碍之一。生物降解技术是削减作物上农药残留有效而且安全的方法，目前有许多文献报道了从土壤、污泥、废水等不同环境介质中分离出农药降解菌的报道。例如：中国发明专利(申请号：200610090054.7)公开了一株降解有机磷农药的施氏假单胞菌，是从农药厂排污口土壤样品中分离的；中国发明专利(申请号：200410081019.X)公开了一株降解有机磷农药的苍白杆菌，是从长期农药污染的土壤中分离获得；中国发明专利(申请号：申请号：200610127951.0)公开了一株降解菊酯类农药的不动杆菌，也是从农药厂排污口土壤样品中分离获得；等等。由于作物的叶际环境比较特殊，分离自其他环境的微生物在植物叶际环境下，其活性不易保持，农药残留的降解效率往往会受到显著影响。而从植物的叶际分离农药降解微生物还未见文献报道。能够在叶际长期生存的微生物对多变的叶际环境比较适应，从叶际分离的农药残留降解菌也就更适合原位降解作物表面的农药残留。

发明内容

本发明的目的在于针对植物的叶际环境比较极端，提供一种直接从植物的叶际筛选农药残留降解菌的方法，从而克服其他来源的微生物因不能适应叶际多变的环境而导致的农药残留降解效率不稳定的缺点。

所述的植物叶际农药降解菌的筛选方法，包括以下步骤：

1、叶际微生物培养基的制备：取新鲜植物叶片，分装入三角瓶中，加入3-10倍重量的水，在灭菌器中105-126℃灭菌10-30分钟，无菌条件下取出叶片，剩下的液体就是液体培养基；灭菌前加入1.5-2％的琼脂粉，同样处理就可以得到固体培养基，制备固体培养基平板和斜面。

2、叶际微生物的分离培养：将植物叶片样品置于三角瓶中，浸泡在液体培养基中，并加入0.05％-0.3％的吐温，摇床震荡处理10-30分钟，然后在超声波清洗器中处理2-8min，使叶片上附生的微生物与叶片分离，进入培养基。然后，梯度稀释，涂布固体培养基平板，20-40℃培养24-96小时；待平板上生长出明显的单菌落后，挑取单菌落，划线分离纯化，转接入固体培养基斜面保存。

3、农药降解菌的筛选：向液体培养基中按照农药的使用浓度加入农药或原药，必要时加入助剂使其能均匀溶解或分散在液体培养基中，接种叶际微生物，培养6-48小时，以不接种的加农药的培养基做对照，用标准方法检测液体培养基在接种前后的农药含量，与对照相比，如果接种后农药含量明显降低，证明所接种的微生物为农药降解微生物。

以下通过具体实施例详细说明发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的实质，但不作为对本发明实施范围的限定。

实施例1：

油菜叶际微生物培养基的制备：取新鲜油菜叶片200克，分装入4个500毫升三角瓶中，加入5倍重量的水，在灭菌锅中，115℃灭菌15分钟，无菌条件下取出叶片，剩下的液体就是液体培养基；灭菌前加入2％的琼脂粉，同样处理就可以得到固体培养基，制备固体培养基平板和斜面。

叶际微生物的分离培养：将油菜叶片样品40克置于500毫升三角瓶中，浸泡在200毫升液体培养基中，并加入0.1％的吐温，摇床震荡处理20分钟，然后在超声波清洗器中处理5min，使叶片上附生的微生物与叶片分离，进入培养基。然后，梯度稀释，涂布固体培养基平板，30℃培养48小时；待平板上生长出明显的单菌落后，挑取单菌落，划线分离纯化，转接入固体培养基斜面保存。

农药降解菌的筛选：向液体培养基中加入80％敌敌畏乳油，使培养基中敌敌畏的浓度达到800毫克/升(较高的使用浓度)，接种分离纯化的叶际微生物，培养24小时，以不接种的加农药的培养基做对照。培养液用水适当稀释，用水系微滤膜过滤后进行液相色谱分析，高效液相色谱仪器型号：AGILENT 1100，色谱柱：ODS C18(4.6毫米×250毫米)，柱温30℃；测定波长215纳米；流动相：V甲醇∶V水＝80∶20；流速0.6毫升/分钟；进样量10微升，外标法定量。检测液体培养基在接种前后的敌敌畏含量，与对照相比，接种后敌敌畏含量明显降低的微生物菌种包括：Bacillus cereus、Novosphingobium sp.、Caryophanon sp.、Xanthomonas campestris、Bacillus licheniformis、Bacillus samanii、Agrobacterium larrymoorei、Microbacterium sp.、Janibacter sp.等。这些微生物既能够降解敌敌畏，又能够在油菜叶际生存，具有一定的应用价值。

实施例2：

油菜叶际微生物培养基的制备：取新鲜油菜叶片200克，分装入4个500毫升三角瓶中，加入5倍重量的水，在灭菌锅中，115℃灭菌15分钟，无菌条件下取出叶片，剩下的液体就是液体培养基；灭菌前加入1.5％的琼脂粉，同样处理就可以得到固体培养基，制备固体培养基平板和斜面。

叶际微生物的分离培养：将油菜叶片样品置于三角瓶中，浸泡在液体培养基中，并加入0.2％的吐温，摇床震荡处理30分钟，然后在超声波清洗器中处理3 min，使叶片上附生的微生物与叶片分离，进入培养基。然后，梯度稀释，涂布固体培养基平板，28℃培养72小时；待平板上生长出明显的单菌落后，挑取单菌落，划线分离纯化，转接入固体培养基斜面保存。

农药降解菌的筛选：向液体培养基中按照农药的使用浓度加入2.5％高效氯氟氰菊酯乳油农药，接种叶际微生物，培养48小时，以不接种的加农药的培养基做对照，用标准方法(GB/T19648-2006)检测液体培养基在接种前后的高效氯氰菊酯含量，与对照相比，接种后农药含量明显降低的能降解高效氯氰菊酯的微生物包括：Bacillus subtilis、Pseudomonas aeruginosa等。这些微生物能够有效降解油菜叶际高效氯氰菊酯残留。

Claims (4)

1.一种植物叶际农药降解菌的筛选方法，其特征在于，以植物叶片为营养物制作培养基，从植物叶片分离微生物，将农药加入培养基，筛选其降解微生物，步骤包括：叶际微生物培养基的制备、叶际微生物的分离培养和保存、农药降解菌的筛选。

2.权利要求1所述的叶际微生物培养基的制备，其特征在于，取新鲜植物叶片，分装入三角瓶中，加入3-10倍重量的水，在灭菌器中105-126℃灭菌10-30分钟，无菌条件下取出叶片，剩下的液体就是液体培养基；灭菌前加入1.5-2％的琼脂粉，同样处理就得到固体培养基，制备固体培养基平板和斜面。

3.权利要求1所述的叶际微生物的分离培养，其特征在于，将植物叶片样品置于三角瓶中，浸泡在液体培养基中，并加入0.05％-0.3％的吐温，摇床震荡处理10-30分钟，然后在超声波清洗器中处理2-8min，使叶片上附生的微生物与叶片分离，进入培养基。然后，梯度稀释，涂布固体培养基平板，20-40℃培养24-96小时；待平板上生长出明显的单菌落后，挑取单菌落，划线分离纯化，转接入固体培养基斜面保存。

4.权利要求1所述的农药降解菌的筛选，其特征在于，向液体培养基中按照农药的使用浓度加入农药或原药，必要时加入助剂使其能均匀溶解或分散在液体培养基中，接种叶际微生物，培养6-48小时，以不接种的加农药的培养基做对照，用标准方法检测液体培养基在接种前后的农药含量，与对照相比，如果接种后农药含量明显降低，证明所接种的微生物为农药降解微生物。