CN112522167A - 一株高效降解丁草胺的变栖克雷伯氏菌wx-01及其应用 - Google Patents

一株高效降解丁草胺的变栖克雷伯氏菌wx-01及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株高效降解丁草胺的变栖克雷伯氏菌WX‑01及其应用，该菌株已于2020年11月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为CDMCC NO：61301。本发明提供的变栖克雷伯氏菌WX‑01在丁草胺初始浓度为1000mg/L时，4天内降解率可达94.22％，并在较广的pH和温度范围内有较好的降解效果。本发明提供的菌株在水体、土壤等环境中的农药残留去除方面具有非常重要的应用价值，也可用于农药厂废水处理系统，同时为转基因抗性作物提供了基因资源库。

Description

一株高效降解丁草胺的变栖克雷伯氏菌WX-01及其应用
技术领域
本发明涉及应用环境微生物和农业领域，更具体地，涉及一株高效降解丁草胺的变栖克雷伯氏菌WX-01及其应用。
背景技术
1965年开始孟山都公司正式推广酰胺类除草剂，酰胺类包括苯氧丙酰胺、烃基酰胺、苯基酰胺、磺酰胺、氯代酰胺等，近年来酰胺类除草剂发展迅速，其应用几乎遍及所以作物，是仅次于有机磷类除草剂的第二大除草剂。其中用量最大的是氯代酰胺类，以除草剂丁草胺为典型代表。
作为稻田用量最大的芽前除草剂，丁草胺的半衰期长，甚至可达几年，在环境中具有持久的稳定性，对鱼类和两栖类水生动物毒害大，不仅影响鱼类等的胚胎发育，还会影响成年鱼类和两栖类的内分泌系统及生殖系统。丁草胺残留对人类和其他哺乳动物也具有很大风险，它被怀疑具有致癌性，可导致线粒体功能障碍，染色体断裂，氧化性DNA损伤，还能破坏内分泌系统诱导体外恶变。
随着人们生活水平的提高，人们迫切需要无农药残留污染的绿色食品和清洁环境。而在农业生产过程中农药的使用也必不可少。因此，寻求高效、安全、经济的农药残留处理新技术，解决病虫害防治用药与农药残留的矛盾，显得尤为必要。微生物降解农药的研究始于20世纪40年代，微生物降解安全，成本低，操作便利且无二次污染。但微生物降解的特异性较强，需要针对不同的农药筛选不同的降解菌株。目前关于丁草胺降解菌的研究较少，且多为低效，低耐受性菌株。公开号为CN103320364A的中国发明专利提供了一株降解低浓度的丁草胺的代尔夫特氏菌，CN101845401A提供了一株丁草胺降解菌胶红酵母，但这些菌株要么对丁草胺的降解率较低，要么降解周期过长。因此，非常有必要提供一种能高效降解丁草胺的降解菌株。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一株高效降解丁草胺农药的变栖克雷伯氏菌WX-01。本发明提供的变栖克雷伯氏菌WX-01在丁草胺初始浓度为1000mg/L时，4天内降解率可达94.22％，并在较广的pH和温度范围内有较好的降解效果，在水体、土壤等环境中的农药残留去除方面具有非常重要的应用价值。
本发明另一目的是提供以上所述变栖克雷伯氏菌WX-01在去除水体中氯代酰胺类农药残留中的应用。
本发明另一目的是提供以上所述变栖克雷伯氏菌WX-01在去除土壤中氯代酰胺类农药残留中的应用。
本发明另一目的是提供以上所述变栖克雷伯氏菌WX-01在修复氯代酰胺类农药环境污染中的应用。
本发明另一目的是提供以上所述变栖克雷伯氏菌WX-01在降解氯代酰胺类农药或制备降解氯代酰胺类农药的制剂中的应用。
本发明再一目的是提供一种降解氯代酰胺类农药的生物制剂。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一株降解丁草胺的变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)WX-01，所述变栖克雷伯氏菌WX-01于2020年11月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为CDMCC NO：61301。
所述变栖克雷伯氏菌WX-01是通过富集培养法对野生型菌株进行反复筛选复壮得到的，具有高度耐药、降解稳定的能力。
所述变栖克雷伯氏菌WX-01在LB固体平板中生长较快，菌落形态为乳白色、中央凸起、边缘扁平。
本发明通过研究发现，变栖克雷伯氏菌WX-01能有效降解氯代酰胺类农药丁草胺，因此本发明要求保护变栖克雷伯氏菌WX-01在制备降解丁草胺农药的制剂中的应用。
因此，以下方面的应用也应在本发明的保护范围之内：
所述变栖克雷伯氏菌WX-01在去除水体中氯代酰胺类农药残留中的应用。
所述变栖克雷伯氏菌WX-01在去除土壤中氯代酰胺类农药残留中的应用。
所述变栖克雷伯氏菌WX-01在修复氯代酰胺类农药环境污染中的应用。
所述变栖克雷伯氏菌WX-01在降解氯代酰胺类农药或制备降解氯代酰胺类农药的制剂中的应用。
优选地，以上所述氯代酰胺类农药为丁草胺。
优选地，所述氯代酰胺类农药环境污染为水体或土壤环境中的丁草胺农药残留污染。
本发明还要求保护一种降解氯代酰胺类农药的生物制剂，含有以上所述变栖克雷伯氏菌WX-01。
优选地，所述氯代酰胺类农药为丁草胺。
优选地，所述生物制剂为菌剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一株变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)WX-01菌株，经试验证明，该菌株能在短时间内有效降解丁草胺农药，耐受浓度高，降解能力强。
(2)本发明提供的变栖克雷伯氏菌WX-01环境适应性强，使用方便。因此，该菌株在修复农药残留污染的水体、土壤等环境方面具有非常重要的应用价值。
(3)本发明提供的变栖克雷伯氏菌WX-01具有超高的丁草胺耐受性和高效降解能力，在转基因抗丁草胺作物应用和抗性机理研究上具有重要的价值。
附图说明
图1为变栖克雷伯氏菌WX-01在丁草胺浓度为500mg/kg的MSM固体培养基上培养3天后的菌落形态。
图2为丁草胺的气相色谱图。
图3为变栖克雷伯氏菌WX-01的16S rDNA进化发育树。
图4为变栖克雷伯氏菌WX-01对不同初始浓度丁草胺的降解效果。
图5为变栖克雷伯氏菌WX-01在不同温度下对丁草胺的降解效果。
图6为变栖克雷伯氏菌WX-01在不同pH的LB培养基中的生长曲线。
图7为变栖克雷伯氏菌WX-01在不同pH下对丁草胺的降解效果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1菌株WX-01的分离和鉴定
一、实验方法
1、菌株的分离
从广东广州某农药厂中采集污染的土壤，通过富集培养法对土壤中的野生型菌株进行反复筛选复壮，使具有高度耐药、稳定降解的能力。
用来富集培养的MSM培养基为基础培养基，其配方为：(NH4)2SO4，2g；MgSO4·7H2O，0.2g；CaCl2·2H2O，0.01g；FeSO4·7H2O，0.001g；Na2HPO4·12H2O，2.0g；KH2PO4，1.5g；蒸馏水1000mL，pH 7.0。
同时在培养基中加入丁草胺原药母液(甲醇为溶剂)，使丁草胺初始质量浓度为100mg/L，于30℃、180r/min摇床下进行富集培养；培养7d后，按2％的接种量转接到第二批含200mg/L丁草胺的基础培养基中；相同条件下培养7d后，再按2％的接种量转接到丁草胺为400mg/L的基础培养基中，相同条件下继续培养7d；相同条件下培养7d后，再按2％的接种量转接到丁草胺为600mg/L的基础培养基中，相同条件下继续培养7d；相同条件下培养7d后，再按2％的接种量转接到丁草胺为800mg/L的基础培养基中，相同条件下继续培养7d；相同条件下培养7d后，最后再按2％的接种量转接到丁草胺为1000mg/L的基础培养基中，相同条件下继续培养7d后，取0.2mL基础培养基发酵液均匀涂抹到含丁草胺的MSM固体平板中反复进行划线分离，直至得到单菌落，挑取生长旺盛的单菌落，使用气相色谱仪进行丁草胺残留量的测定。
2、分子生物学鉴定
用Tsingke公司TSP101 DNA提取试剂盒对分离筛选得到的菌株的总基因组进行提取，以提取的总DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1429R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)经行PCR扩增。通过1％琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，对单一条带PCR产物经行ExoSAP-IT纯化，对有非特异条带的PCR产物经行切胶纯化，将纯化后的产物用Sanger测序法经行双向测序。测序完成后，利用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)对菌株的同源性进行同源性对比。
二、实验结果
1、菌株的筛选分离
图1为菌株在丁草胺浓度为500mg/kg的MSM固体培养基上培养3天后的菌落形态，菌落形态为乳白色、中央凸起、边缘扁平；图2为残留的丁草胺的气相色谱图。
2、分子生物学鉴定结果
菌株的16S rDNA基因的PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，显示菌株的16S rDNA基因片段大小在1500bp左右，纯化后的PCR产物经行双向测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，将测序的序列结果上传到GenBank数据库进行对比分析，显示菌株的16SrDNA核苷酸序列与在线数据库中的Klebsiella variicola(GenBank登录号为KM275664.1)相似性达到99.93％，因此将其鉴定为变栖克雷伯氏菌。
基于菌株序列构建系统发育进化树，发现其与变栖克雷伯氏菌Klebsiellavariicola(KT3593420)归于一支，如图3所示。
综上所述，鉴定该菌株属于变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)，将该菌株命名为变栖克雷伯氏菌WX-01，并于2020年11月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为CDMCC NO：61301，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
实施例2菌株WX-01降解丁草胺的效果试验
1、不同初始浓度对菌株WX-01降解丁草胺的影响
在基础培养基(同实施例1)中加入丁草胺原药，使其最终浓度为500mg/L，800mg/L，1000mg/L；挑取实施例1中生长旺盛的单菌落用于丁草胺降解活性测定，菌株的接种量为2％，转速为150r，并设不接菌的丁草胺浓度为500mg/L的培养基为对照，30℃培养4d后取样，应用气相色谱检测丁草胺的残留量并计算降解率。
结果如图4所示，菌株WX-01在短时间内可有效降解丁草胺，4d内对500mg/L，800mg/L，1000mg/L的丁草胺的降解率均可达90％以上，其中对1000mg/L的丁草胺的降解率高达94.22％，且对照组降解率在15％以下，说明WX-01具有良好的生物降解效果。
2、不同温度对菌株WX-01降解丁草胺的影响
在丁草胺浓度为500mg/L的基础培养基(同实施例1)中按2％的接种量接种菌株WX-01，并将其分别放置在培养温度分别设定为20℃、30℃、37℃、45℃的培养箱中培养，转速为150r，4d后取样，应用气相色谱检测丁草胺的残留量并计算降解率。
结果如图5所示，菌株WX-01对温度的耐受范围较广，在20～45℃均有较好的降解效果，其对丁草胺的降解率分别为均超过80％，但以在30℃的条件下降解效果最佳。
3、不同pH对WX-01降解丁草胺的影响
在丁草胺浓度为500mg/L、pH分别为5，6，7，8，9的基础培养基(同实施例1)中按2％的接种量接种WX-01，转速为150r，30℃培养4d后取样，应用气相色谱检测丁草胺的残留量并计算降解率；并使用pH分别为5，6，7，8，9的LB培养基在酶标仪中测定菌株WX-01的生长曲线。
结果如图6和图7所示，菌株WX-01在pH为5～9时都具有良好的降解效率，其对丁草胺的降解率分别为94.13％，93.91％，93.96％，94.96％，94.13％，但在pH为5～7的中性和偏酸性的条件下生长情况更佳。
以上：降解率＝(对照样品残留量－处理样品残留量)/对照样品残留量×100％
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一株高效降解丁草胺的变栖克雷伯氏菌WX-01及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1340
<212> DNA
<213> 变栖克雷伯氏菌WX-01
<400> 1
cttgctctcg ggtgacgagc ggcggacggg tgagtaatgt ctgggaaact gcctgatgga 60
gggggataac tactggaaac ggtagctaat accgcataac gtcgcaagac caaagtgggg 120
gaccttcggg cctcatgcca tcagatgtgc ccagatggga ttagctggta ggtggggtaa 180
cggctcacct aggcgacgat ccctagctgg tctgagagga tgaccagcca cactggaact 240
gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgcaa 300
gcctgatgca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggccttcg ggttgtaaag cactttcagc 360
ggggaggaag gcggtgaggt taataacctc accgattgac gttacccgca gaagaagcac 420
cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggt gcaagcgtta atcggaatta 480
ctgggcgtaa agcgcacgca ggcggtctgt caagtcggat gtgaaatccc cgggctcaac 540
ctgggaactg cattcgaaac tggcaggcta gagtcttgta gaggggggta gaattccagg 600
tgtagcggtg aaatgcgtag agatctggag gaataccggt ggcgaaggcg gccccctgga 660
caaagactga cgctcaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag 720
tccacgctgt aaacgatgtc gatttggagg ttgtgccctt gaggcgtggc ttccggagct 780
aacgcgttaa atcgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga 840
cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg atgcaacgcg aagaacctta 900
cctggtcttg acatccacag aacttagcag agatggattg gtgccttcgg gaactgtgag 960
acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gttgtgaaat gttgggttaa gtcccgcaac 1020
gagcgcaacc cttatccttt gttgccagcg gttaggccgg gaactcaaag gagactgcca 1080
gtgataaact ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc atggccctta cgaccagggc 1140
tacacacgtg ctacaatggc atatacaaag agaagcgacc tcgcgagagc aagcggacct 1200
cataaagtat gtcgtagtcc ggattggagt ctgcaactcg actccatgaa gtcggaatcg 1260
ctagtaatcg tagatcagaa tgctacggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1320
cgtcacacca tgggagtggg 1340

Claims (10)

1.一株降解丁草胺的变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)WX-01，其特征在于，所述变栖克雷伯氏菌WX-01于2020年11月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为CDMCC NO：61301。
2.权利要求1所述变栖克雷伯氏菌WX-01在去除水体中氯代酰胺类农药残留中的应用。
3.权利要求1所述变栖克雷伯氏菌WX-01在去除土壤中氯代酰胺类农药残留中的应用。
4.权利要求1所述变栖克雷伯氏菌WX-01在修复氯代酰胺类农药环境污染中的应用。
5.权利要求1所述变栖克雷伯氏菌WX-01在降解氯代酰胺类农药或制备降解氯代酰胺类农药的制剂中的应用。
6.根据权利要求2～5任一所述应用，其特征在于，所述氯代酰胺类农药为丁草胺。
7.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述氯代酰胺类农药环境污染为水体或土壤环境中的丁草胺农药残留污染。
8.一种降解氯代酰胺类农药的生物制剂，其特征在于，含有权利要求1所述变栖克雷伯氏菌WX-01。
9.根据权利要求8所述生物制剂，其特征在于，所述氯代酰胺类农药为丁草胺。
10.根据权利要求8所述生物制剂，其特征在于，所述生物制剂为菌剂。
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