CN112175882B

CN112175882B - 菌株ky331、菌剂及包含其的产品和应用

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Publication number: CN112175882B
Application number: CN202011142047.3A
Authority: CN
Inventors: 康耀卫; 黄燕菲; 梁韵玲; 苑莹; 唐珏晖
Original assignee: Kangshengyuan Zhaoqing Bio Tech Co ltd
Current assignee: Kangshengyuan Zhaoqing Bio Tech Co ltd
Priority date: 2020-10-21
Filing date: 2020-10-21
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2040-10-21
Also published as: CN112175882A

Abstract

本发明提供了一种菌株KY331、菌剂及包含其的产品和应用，涉及微生物技术领域，本发明提供的菌株KY331在培养40h后，对1000mg/L(即1000ppm)阿特拉津的降解率高达97.97％。其能够有效实现对阿特拉津的降解，改良被阿特拉津污染的土壤或水体环境，且具有降解时间短、效率高等优点。同时，本发明还通过实验证实，菌株KY331还具有促进作物发芽的功能，施用了菌株KY331的作物种子的发芽指数显著提高。此外，菌株KY331还具有良好的抗逆性，使得该菌株在复杂环境中仍能够保证较高的生存率，有效发挥阿特拉津降解或促进作物发芽的功能。

Description

菌株KY331、菌剂及包含其的产品和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种菌株KY331、菌剂及包含其的产品和应用。

背景技术

自从化学除草剂问世以来，除草剂的应用对提高农作物产量和质量发挥了重要的作用。阿特拉津(atrazine，ATR)又名莠去津，化学名称：2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-1,3,5-三嗪，分子式：C₈H₁₄CLN₅，分子结构式：

1957年由瑞士的H.盖辛和E.克努斯利发现，并于1958年由瑞士的Geigy开发生产，是一种具有选择性内吸传导型的三嗪类除草剂，以根吸收为主，茎叶吸收很少，迅速传导到植物分生组织及叶部，干扰光合作用，使杂草叶片干枯致死。阿特拉津是除草剂种类中的一个重要品种，作为除草剂投入商业化生产以来，因其生产成本低且除草效果好，得到了世界各国的普遍认可和使用，已成为国际除草剂行业中销售量最大的重要除草剂之一，广泛应用于多种一年生禾本科作物(玉米、高粱田等)及甘蔗、林地等阔叶杂草的防除，例如狗尾草、马唐、十字花科、苍耳属植物等，是世界上玉米生产中最重要的除草剂品种之一。美国、瑞典和日本等发达国家每年都使用大量的阿特拉津用于保障农业生产，中国作为农业大国，农药的施用量逐年增加，中国从20世纪80年代初开始使用阿特拉津除草剂，1996-2000年阿特拉津的使用量每年以20％的速度递增。

近年来，因不合理使用，农药常伴随着地表径流、干沉降和湿沉降等途径进入地表水和地下水，造成严重污染。根据统计，大约1％～5％的农业除草剂被地表径流所转移。由于阿特拉津的使用量大，其残留期长(4～57周)，不易挥发，不易吸附在土壤或沉淀物上，移动性较强，溶解性较好的特点使阿特拉津可以通过地表径流、淋溶等途径污染地表水和地下水，对水生生态系统和饮用水源构成威胁，进而危害人类健康。目前世界上许多具有多年阿特拉津使用历史的国家在雨水、大气、地表水及地下水中均能检测出阿特拉津；另外，阿特拉津还可通过挥发和浮尘进入大气，并通过干沉降和湿沉降等方式返回地面，许多未曾施用过阿特拉津的国家的高山和湖泊中也有阿特拉津被检出，其对生态环境的影响具有全球性。据报道，美国、法国等国对其国内的河流、地下水、土壤、饮用水等进行阿特拉津残留及其衍生物的检测，发现其残留量均超出规定标准。我国的湖泊河流均已被阿特拉津污染，长江、黄河、辽河均检测到阿特拉津，太湖梅梁湾水体和北京官厅水库中等多地阿特拉津的含量均很高。

阿特拉津的生理生态毒理学研究表明，阿特拉津具有很强的生态毒性，能够干扰人和动物的内分泌系统，同时具有潜在的致癌和致畸特性，长期接触可降低哺乳动物体内雄激素的含量、提高雌激素、改变性成熟时间，甚至导致人乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌的发生率增加；另外，阿特拉津只对玉米地等的阔叶杂草有效，而其在土壤中长期残留，容易对下一季作物，如小麦、大豆、水稻等后茬敏感的作物产生药害，因此施用阿特拉津的土壤只能种植单一作物，不利于土地的轮作，从而阻碍农业生产的发展。近年来在我国北方地区，施用过阿特拉津的土壤毒死水稻幼苗的事件屡屡发生。因此阿特拉津早在1997年被世界野生动物基金会列为环境荷尔蒙物质，先后被许多国家和组织列为优先控制污染物或禁止使用。因此，如何有效降解土壤及水体中阿特拉津残留物污染日益受到关注。目前降解阿特拉津的方法主要有物理、化学、生物等处理技术。由于化学和物理方法对阿特拉津的降解反应不彻底，并且成本较高、操作难度较大等缺点，导致其应用于污染治理受到较多的限制；而生物修复因低成本，且具有不破坏植物生长所需要的土壤环境，对污染物氧化比较完全，不产生二次污染，处理效果好，可原地处理，操作简单等特点被广泛应用于土壤及水体中阿特拉津的降解。

生物处理技术中微生物降解途径是其降解的主要过程，目前国内外对阿特拉津降解菌株的报道大多以真菌、细菌为主，及少量放线菌、藻类等。冉治霖等通过对取自城市污水处理厂的污泥进行驯化培养分离菌株L-1(Arthrobacter sp.)，接种于阿特拉津无机盐培养基(阿特拉津浓度为500mg/L)96h后降解率达94.8％；韩鹏等分离出一株细菌ADH-2(Arthrobacter sp.)，该菌在10h内对100mg/L阿特拉津的降解率为99.9％；刘春光等分离出一株细菌T3AB1，初步鉴定为节杆菌属(Arthrobacter sp.)，该菌株在72h内对500mg/L阿特拉津(pH8.0)的降解率高达99％；杨晓燕等从河北省某农药厂排污河中的废水中分离出一株CS3菌株(Arthrobacter ureafaciens)在48h内完全降解50mg/L的阿特拉津，在6d内将500mg/L的阿特拉津完全降解；李阳阳等分离出一株LY-2菌株(肠杆菌属，Enterobactersp.)在48h内对100mg/L阿特拉津降解率为98.7％；江群等用玉米秸秆制备生物炭，并以其作为固定化菌剂的廉价载体，与阿特拉津降解菌Acinetobacter lwoffii DNS32制备成具有吸附-降解性能的新型菌剂，用以降解水溶液中阿特拉津，其固定化菌剂可在40h内将100mg/L的阿特拉津降解94％；李明锐等筛选到1株高效降解阿特拉津的菌FM326(Arthrobacter sp.)，该菌株培养96h后对1000mg/L阿特拉津降解效率达到97％；李红梅等分离到一株阿特拉津降解菌SD41(Arthrobacter sp.)，该菌在48h内对1000mg/L的阿特拉津(pH 7.0)降解率为94.95％；刘丹丹等和郭火生等的研究结果表明，随着底物浓度升高，阿特拉津的降解率呈下降趋势，当阿特拉津浓度低于100mg/L时，阿特拉津的降解率均较高；当阿特拉津浓度高于200mg/L时，生长和降解率均受到一定抑制，当高于500mg/L时降解率低于50％，生长也受到抑制，当达到1000mg/L时，降解率仅为2.13％，当高于1200mg/L时，菌株几乎不降解阿特拉津，出现抑制菌株生长的现象。

综上，目前国内对阿特拉津生物学降解的研究主要集中于节杆菌属(Arthrobacter sp.)，是现大部分研究中分离到的阿特拉津降解菌中最常见的种类，而这些研究中阿特拉津的普遍浓度为100mg/L-500mg/L(即100ppm-500ppm)，降解时间均在10h-96h之间，降解率才可达95％以上。自然界中微生物资源巨大，寻找更加高效的阿特拉津降解菌株是有可能的，而现有研究中的微生物细菌对阿特拉津的降解效率较低，为了更好的商业用途，所以亟需筛选出一株既可高效降解阿特拉津同时具有其它应用功能的微生物菌株。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的主要目的在于提供菌株KY331(Paenarthrobacter ureafaciens)，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。

为此，本发明提供了菌株KY331(Paenarthrobacter ureafaciens)，于2020年07月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.20407。

本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂包括权利要求1所述的菌株KY331(Paenarthrobacter ureafaciens)。

本发明还提供了上述的菌株KY331(Paenarthrobacter ureafaciens)或菌剂在降解阿特拉津中的应用。

本发明还提供了上述的菌株KY331(Paenarthrobacter ureafaciens)或菌剂在制备降解阿特拉津的产品中的应用。

本发明还提供了上述的菌株KY331(Paenarthrobacter ureafaciens)或菌剂在促进作物发芽中的应用。

本发明还提供了上述的菌株KY331(Paenarthrobacter ureafaciens)或菌剂在制备促进作物发芽的产品中的应用。

进一步的，所述作物包括大豆和玉米。

此外，本发明还提供了一种用于降解阿特拉津和/或促进作物发芽的产品，所述产品包括上述的菌株KY331(Paenarthrobacter ureafaciens)或菌剂。

进一步的，所述产品包括土壤改良剂、水体改良剂或肥料。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的菌株KY331(Paenarthrobacter ureafaciens)在培养40h后，对1000mg/L(即1000ppm)阿特拉津的降解率高达97.97％。其能够有效实现对阿特拉津的降解，改良被阿特拉津污染的土壤或水体环境，且具有降解时间短、效率高等优点。同时，本发明还通过实验证实，菌株KY331(Paenarthrobacter ureafaciens)还具有促进作物发芽的功能，施用了菌株KY331(Paenarthrobacter ureafaciens)的作物种子的发芽指数显著提高。此外，菌株KY331(Paenarthrobacter ureafaciens)还具有良好的抗逆性，使得该菌株在复杂环境中仍能够保证较高的生存率，有效发挥阿特拉津降解或促进作物发芽的功能。

基于菌株KY331(Paenarthrobacter ureafaciens)的上述性能，本发明提供的包含其的菌剂或产品，以及对菌株KY331(Paenarthrobacter ureafaciens)应用也具有上述有益效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A为本发明实施例1提供的菌株KY208在阿特拉津-M9固体培养基生长及其阿特拉津降解情况；

图1B为本发明实施例1提供的菌株KY331在阿特拉津-M9固体培养基生长及其阿特拉津降解情况；

图1C为本发明实施例1提供的菌株KY333在阿特拉津-M9固体培养基生长及其阿特拉津降解情况；

图2为本发明实施例1提供的菌株降解阿特拉津的HPLC检测结果对比图；

图3为本发明实施例2提供的菌株KY331与Paenarthrobacter ureafaciens的同源对比分析图；

图4为发明实施例2提供的菌株KY331在显微镜下观察结果图；

图5A为发明实施例3提供的菌株92068、KY208抗逆性实验结果；

图5B为发明实施例3提供的菌株92068、KY331抗逆性实验结果；

图5C为发明实施例3提供的菌株92068、KY333抗逆性实验结果；

图6为本发明实施例4提供的用不同菌液包衣的大豆种子的发芽情况；

图7为本发明实施例4提供的用不同菌液包衣的玉米种子的发芽情况。

具体实施方式

除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种产脲节杆菌菌株KY331(Paenarthrobacter ureafaciens)。该菌株的保藏日期为2020年07月20日，保藏号为CGMCCNo.20407，分类命名为产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编100101。

本发明的发明人通过富集和高通量相结合的筛选方法对采集到的268个不同省市的土样中的微生物进行可降解除草剂阿特拉津的微生物菌株的筛选，从大约25万株微生物菌株中筛选得到约20株对阿特拉津具有降解作用的菌株，其中菌株KY331在培养40h后，对1000mg/L(即1000ppm)阿特拉津的降解率高达97.97％。其能够有效实现对阿特拉津的降解，改良被阿特拉津污染的土壤或水体环境，且具有降解时间短、效率高等优点。同时，本发明还通过实验证实，菌株KY331还具有促进作物发芽的功能，施用了菌株KY331的作物种子的发芽指数显著提高。此外，菌株KY331还具有良好的抗逆性，使得该菌株在复杂环境中仍能够保证较高的生存率，有效发挥阿特拉津降解或促进作物发芽的功能。

本发明提供的菌株KY331的16sDNA部分序列如SEQ ID NO.1所示，对菌株KY331进行16sDNA序列测定的结果表明，该菌株1377的碱基序列与Paenarthrobacter ureafaciensSS7菌株具有100％的高度同源。此外，KY331菌株的16sDNA序列与数据库里的不同的Paenarthrobacter ureafaciens菌株和相近的Arthrobacter sp.的菌株进行16sDNA序列同源对比分析结果也表明菌株KY331菌株与Paenarthrobacter ureafaciens种更为接近。

菌株KY331的特征为：在R2A培养基上培养生长2d，显微镜下观察菌株呈短杆状，菌落在培养基上呈圆形状，较小，乳黄绿色，不透明，菌落边缘光滑整齐，略有凸起，不粘稠，经显微镜测定其直径约1-3μm左右。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种包括上述菌株KY331的菌剂，所述菌剂由于包含上述菌株KY331，因此具有菌株KY331的所有有益效果，在此不再赘述。需要说明的是，本发明提供的菌剂，可以仅含有菌株KY331，或者在含有菌株KY331的同时还含有其他种类的微生物。菌株KY331在该菌剂中可以作为主要活性成分，也可以作为辅助活性成分，本发明对此不做限定。

此外，本发明提供的菌剂还可以包括常规可应用于菌剂的辅料，所述辅料指的是不影响菌剂正常生理功能，同时对菌剂起辅助作用的成分，所述辅料的实例包括但不限于载体、用于为微生物成分提供营养的物质和助剂等。所述载体的实例包括但不限于活性炭、沸石、麦饭石、海泡石、高岭土、硅藻土、蒙脱石、稻壳、淀粉、聚乙烯醇和聚乙二醇中的一种或多种。所述用于为微生物成分提供营养的物质包括但不限于为盐、蛋白胨、水解蛋白、酵母提取物、葡萄糖、氨基酸和维生素中的一种或多种；所述助剂包括但不限于为pH调节剂、分散剂、干燥剂、溶剂、崩解剂、填充剂和稳定剂中的一种或多种。

基于本发明提供的菌株KY331具有降解阿特拉津的能力，本发明还提供了菌株KY331或包括菌株KY331的菌剂在降解阿特拉津中的应用。将菌株KY331或包括菌株KY331的菌剂应用于降解阿特拉津，能够有效改良被阿特拉津污染的土壤或水体环境，且具有降解时间短、效率高等优点。

基于本发明提供的菌株KY331具有促进作物发芽的能力，本发明还提供了菌株KY331或包括菌株KY331的菌剂在促进作物发芽中的应用。将菌株KY331应用于促进作物发芽，能够使得施用了菌株KY331的作物种子的发芽指数显著提高。

需要说明的是，本发明对作物的具体种类不做限定，例如可以为，但不限于玉米或大豆。

基于本发明提供的菌株KY331具有的降解阿特拉津能力和促进作物发芽能力，本发明还提供了菌株KY331或包含菌株KY331的菌剂在制备用于降解阿特拉津和/或促进作物发芽的产品中的应用。将菌株KY331或包含菌株KY331的菌剂应用于制备产品中，可以赋予产品降解阿特拉津能力和促进作物发芽，将产品用于降解阿特拉津和/或促进作物发芽中，可取得菌株KY331或包含菌株KY331的菌剂在降解阿特拉津和/或促进作物发芽中应用时的有益效果，在此不再赘述。

基于上述应用，本发明还提供了一种用于降解阿特拉津和/或促进作物发芽的产品，所述产品包括菌株KY331或包含菌株KY331的菌剂。本发明提供的产品可以单纯用于降解阿特拉津，也可以单纯用于促进作物发芽，并且，也可以同时用于降解阿特拉津和促进作物发芽。

需要说明的是，本发明对该产品的具体形式不做限定，其例如可以为，但不限于土壤改良剂、水体改良剂或肥料等。所述产品还可以包括其他功能成分，包括但不限于其他微生物类或非微生物类的活性成分，如蛋白、水解蛋白、氨基酸、微生物、无机盐或小分子化合物药物等；所述产品还可以含有本领域的常规辅料。产品的剂型例如可以为但不限于为颗粒剂、乳液剂、粉剂、悬浮剂或液体制剂等。

具体地，所述产品可以为土壤改良剂。土壤改良剂中的菌株KY331可以有效降解阿特拉津污染土壤中的阿特拉津，避免该土壤对小麦、大豆、水稻等后茬敏感的作物产生药害，提高土地利用率。

具体地，所述产品可以为水体改良剂。土壤改良剂中的菌株KY331可以有效降解阿特拉津污染水体中的阿特拉津，避免人类或其他哺乳动物接触污染水体后导致癌症或畸形等。

具体地，所述产品可以为肥料。在肥料中添加菌株KY331或包含菌株KY331的菌剂，施用后可以有效促进作物发芽。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。试剂及药品的来源如下：

实施例1

1.利用液体富集高通量法筛选阿特拉津高效降解菌

1.1土样的采集

从全国各地不同省份选择具有代表性的土壤进行采集，比如沙土、粘土、黑土等，样品可以来源于农田、牧草地、森林土等不同的区域，尤其是对种植玉米、甘蔗等的土壤进行采样，每个点采集15-20克样品，同时标明来源地(省，县)、采集年月、土壤的来源(植物，沙土、或其他)，放于冰箱保藏，共采集到来源于全国各个省市的土样268个。

1.2利用富集法筛选具有解阿特拉津功能微生物菌株

第一步富集：取0.5g土样于50mL纯净水中摇匀，取其中500μL混合液于0.25％阿特拉津液体培养基中(磷酸氢二钾1.79g，磷酸二氢钾0.45g，氯化铵0.5g，氯化钠0.1g，七水硫酸镁0.2g，葡萄糖0.05g，酵母粉0.05g，阿特拉津2.5g，水1L)，在30℃下200r/min震荡培养7天，观察记录液体培养基颜色、浑浊度等的变化。

第二步富集：取上一步富集的菌液500μL于0.25％阿特拉津液体培养基中，在30℃下，200r/min震荡培养7天，观察记录液体培养基颜色、浑浊度等的变化。

第三步富集：取第二步富集的菌液500μL于0.25％阿特拉津液体培养基中，30℃，200r/min震荡培养7天，观察记录液体培养基颜色、浑浊度等的变化。

1.3涂布法筛选具有解阿特拉津的功能微生物菌株

1)取最后一次富集的菌液各100μL涂布于含0.4％阿特拉津M9选择性培养基(5*M9盐溶液200mL，1M MgSO₄ 2mL，20％葡萄糖溶液20mL，1M CaCl₂ 0.1mL，阿特拉津4g，水1000mL；5*M9盐溶液：NaHPO₄ 32g，KH₂PO₄ 7.5g，NaCl 1.25g，水500mL)，观察记录M9选择性培养基菌株生长及水解阿特拉津情况。

2)从上述培养基中挑取具有解阿特拉津水解圈的功能的菌株于R2A培养基(蛋白胨0.5g，酵母粉0.5g，葡萄糖0.5g，胰蛋白胨0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸二氢钾0.3g，硫酸镁0.05g，丙酮酸钠0.3g，琼脂粉15g，水1L)上划线培养纯化。

1.4重复验证

为了确保菌株解阿特拉津能力，将具有可降解阿特拉津能力的菌株，再次接种于0.4％阿特拉津-M9固体培养基培养，验证所挑取的菌落是否具有降解阿特拉津功能，排除假阳性菌落。

1.5结果

通过上述方法对所采集到的268个不同省市的土样进行可降解除草剂阿特拉津的微生物菌株的筛选，从大约25万株微生物菌株中筛选得到约20株对阿特拉津具有降解作用的菌株，其中3株可在阿特拉津-M9固体培养基稳定生长且具有较强的高效快速降解阿特拉津的功能，分别命名为KY208(Arthrobacter sp.)、KY331(Paenarthrobacterureafaciens)、KY333(Arthrobacter ureafaciens)(图1A、1B和1C分别对应菌株KY208、KY331、KY333在阿特拉津-M9固体培养基生长及其阿特拉津降解情况，枯草芽孢杆菌92068为对照菌株)。

2.利用液相色谱法(HPLC)挑选最优降解阿特拉津的功能菌株

Ⅰ利用液相色谱(HPLC)法检测菌株降解阿特拉津的效率

1.从筛选得到的KY208、KY331、KY333菌株接种到含50mL R2A液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃下，200r/min培养24小时，将OD600nm调整到一致后(OD600nm＝1)分别接种到含1000mg/L(1000ppm)阿特拉津的50mL阿特拉津液体培养基(磷酸氢二钾1.79g，磷酸二氢钾0.45g，氯化铵0.5g，氯化钠0.1g，七水硫酸镁0.2g，葡萄糖0.05g，酵母粉0.05g，阿特拉津1g，水1L)的250mL锥形瓶中，在30℃下200r/min震荡培养，观察记录液体培养基颜色、浑浊度等的变化；设置不接菌液的阿特拉津液体培养基为空白对照(CK1)，接入调整OD600nm后的枯草芽孢杆菌92068菌液为CK2；

2.待1中锥形瓶内液体培养基液体有颜色、浑浊度等的变化，加入1/2阿特拉津液体培养基体积的氯仿溶液摇匀，室温下静置后进行萃取。

3.取2中下层有机相1000μL液体于1.5mL离心管，16000rpm/min，离心90秒，然后置于恒温金属浴中70℃加热至氯仿完全蒸发。

4.向3中蒸发完全的离心管中加入1mL甲醇溶液，震荡摇匀至沉淀物完全溶解。

5.吸取上述步骤4中800μL液体进行过滤(0.22μm滤膜)后放入HPLC取样瓶中，进行HPLC检测(色谱柱P/NO:00F-4252-E0,TYPE:LUNA 5u C18(2),SIZE:150*4.60mm micron,s/NO:406625，10μL微量进样器)检测滤液中的阿特拉津，观察记录阿特拉津峰及峰面积的变化。阿特拉津测定条件：流动相为甲醇：水＝60：40，柱温25℃，吸收峰254nm，进样量10μL，流速1mL/min，保留时间10min。

ⅡHPLC检测结果

40h后，发现锥形瓶中液体由清亮变成浑浊，且不溶于水的阿特拉津颗粒明显变少甚至变无，进而进行HPLC检测试验。HPLC检测结果如下：

由图2和表1可见，对照菌株92068的阿特拉津峰面积与空白对照阿特拉津峰面积相差不大，其降解率为10.72％，菌株KY208、KY331、KY333峰面积与空白对照阿特拉津峰面积差距较大，40h后降解率分别为94.57％、97.97％、96.36％。

表1菌株降解阿特拉津的HPLC检测结果及其降解率

注：降解率％＝(空白对照CK1的面积-样品的面积)/空白对照CK1的面积。

综上，40h内可稳定快速生长且降解阿特拉津能力较强的菌株为KY331，该菌株在40h内可快速降解浓度为1000mg/L(1000ppm)的阿特拉津，其降解率高达97.97％，因此将菌株KY331作为研究对象对其展开后续试验的研究。本研究发现该菌株还具有抗逆性、促进作物发芽的功能。

实施例2

16sDNA的测定及菌株生理形态分析

Ⅰ菌株16sDNA的测定

1.1 CTAB法提取细菌DNA

1、接种一单菌落于5mL R2A中，30℃培养过夜；

2、取1mL种子培养液接入100mL R2A液体中，37℃、220r/min培养16小时；

3、5000r/min离心10分钟，弃去上清；

4、加入10mL TE离心洗涤后，用10mL TE溶解菌体，混匀，-20℃保存备用；

5、取3.5mL菌悬液，加入184μL 10％SDS，混匀，加入37μL 10mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃温育1小时；

6、加入740μL 5mol/L NaCl，再加入512μL CTAB/NaCl，混匀，65℃温育10分钟；

7、加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10000r/min离心5分钟，保留上清；

8、上清中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，混匀，10000r/min离心5分钟，保留上清；

9、加入0.6倍的异丙醇，混匀，10000r/min离心5分钟，收集DNA沉淀，用70％乙醇离心洗涤DNA沉淀；

10、用1mL TE溶解DNA，加入终浓度为20μg/mL RNaseA，4℃保存。

1.2扩增与测序

采用16S rDNA通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，SEQ ID NO.2)和1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，SEQ ID NO.3)进行16S rDNA的PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性30s；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。将PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收纯化测序，根据获得的16SrDNA序列在GenBank中Blast搜索同源序列并进行同源序列分析对比，建立系统发育树。

1.3菌株KY331的16S测序结果

结果如SEQ ID NO.1所示：

TTAGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCAACTTTCGTGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTTGGGATTAGCTCCACCTCACAGTATCGCAACCCTTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCAAGACATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCCTATGAGTCCCCGGCCGAACCGCTGGCAACATAGAACGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTAAACCGGCCGCAAGCGGGGCACCTGTTTCCAGGTCTTTCCGGTCCATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGCACTTAATGCGTTAGCTACGGCGCGGAAAACGTGGAATGTCCCCCACACCTAGTGCCCAACGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCATGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTCCAGTCTCCCCTACTGCACTCTAGTCTGCCCGTACCCACTGCAGAACCGGAGTTGAGCCCCGGTCTTTCACAGCAGACGCGACAAACCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTCTGCAAGTACCGTCACCCCCAAAGAGGGCTTCTTCCCTACTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTAGGCCATTACCCCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGAGTCCATCCAAAACCACAAAAAGCTTTCCACCCCCCACCATGCGATGAGGAGTCATATCCGGTATTAGACCCAGTTTCCCAGGCTTATCCCAGAGTCAAGGGCAGGTTACTCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATCCCCGGCGCAAGCACCGGATCATCGTTCGACTGCA。

经过对菌株KY331的16sDNA序列测定结果(SEQ ID NO.1)表明，该菌株与Paenarthrobacter ureafaciens SS7菌株在1377bp的长度对比，具有大于100％的高度同源。此外，KY331菌株的16sDNA序列与数据库里的不同的Paenarthrobacter ureafaciens菌株和相近的Arthrobacter sp.的菌株进行16sDNA序列同源对比分析结果也表明菌株KY331菌株与Paenarthrobacter ureafaciens种更为接近。(图3.菌株KY331与Paenarthrobacterureafaciens的同源对比分析，方法采用的是Fast Minimum Evolution)。

Ⅱ菌株形态观察

将筛选的菌株接种到R2A平板上，室温下培养2d，观察菌落的大小、形状、颜色、光泽度、黏稠度、隆起形状、透明度、边缘特征等。

2.1菌株形态观察结果

经观察菌株在R2A培养基上培养生长2d，显微镜下观察菌株呈短杆状，菌落在培养基上呈圆形状，较小，乳黄绿色，不透明，菌落边缘光滑整齐，略有凸起，不粘稠，经显微镜测定其直径约1-3μm左右(结果如图4所示)。

实施例3菌株抗逆性测定

1、菌株抗逆性测定

将筛选得到的菌株KY208、KY331、KY333，接种到条件为5％KNO₃、10％KNO₃、15％KNO₃、20％KNO₃、pH4.5、pH10的R2A培养基上，观察菌株是否生长，以及生长是否受抑制和生长速度的快慢。设置枯草芽孢杆菌92068菌株为对照。

2、菌株抗逆性测定结果

结果测定(图5A、5B、5C和表2)表明，本发明菌株KY331与对照菌株92068相比，具有很好的耐酸性(pH4.5)，且具有与对照菌株相似的耐盐性及耐碱性。

表2菌株92068、KY208、KY331、KY333抗逆性实验结果

菌株

5％KNO3

10％KNO3

15％KNO3

20％KNO3

pH4.5

pH10

92068

++

弱

+

++

KY208

++

弱

-

++

KY331

++

+

弱

++

KY333

++

弱

-

++

(注：“++”代表菌株在此条件下可生长且不受抑制；“+”代表菌株在此条件下可生长且开始受抑制；“弱”代表菌株在此条件下生长微弱；“-”代表菌株在此条件下不可生长。)

实施例4种子萌发实验

1、菌悬液的制备

将92068、KY208、KY331、KY333菌株接种到含50mL R2A液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃下，200r/min培养48小时后分别配制成OD_600nm＝0.1的菌液备用。

2、种子包衣

分别进行大豆种子、玉米种子包衣，每100g种子喷洒300μL菌液，挑选颗粒饱满、大小均匀、未破碎经包衣处理的种子，接种到琼脂浓度为0.5％培养基中(琼脂5g，水1000L)进行发芽试验，每皿10粒，每个处理重复4次，用封口膜密封，避光培养。设置枯草芽孢杆菌92068菌株包衣的种子为阳性对照，设置分别用水和R2A包衣的种子为空白对照。从第2天起，计算大豆种子及玉米种子的发芽指数。

注：大豆种子发芽指数G＝0*N+1*N+2*N+3*N+4*N(N表示该级别的个数)；

玉米种子发芽指数G＝N*(0+X)+N*(1+X)+N*(2+X)+N*(3+X)+N*(4+X)(N表示该级别的个数，X表示该级别种子的侧芽及侧根总数)；

0代表未发芽；1代表芽长为0-0.5cm；2代表芽长为0.5-1.0cm；3代表芽长为1.0-1.5cm；4代表芽长为大于3cm。

3、种子萌发实验结果

表3和图6、图7结果表明，菌株KY208、KY331、KY333对大豆种子以及玉米种子有促进萌发的作用，发芽指数明显高于对照枯草芽孢杆菌菌株92068。其中与对照枯草芽孢杆菌菌株92068、空白对照(水和R2A)相比，KY331菌株对大豆种子以及玉米种子萌发的促进作用在SPSS分析下P<0.05水平上有显著差异性。

表3.不同菌液对大豆种子、玉米种子发芽指数的影响

菌株	大豆种子发芽指数	玉米种子发芽指数
			水	16a	18.50a
R2A营养液	16.75a	24.00ab
			92068菌液	15.50a	17.50a
KY208	28.5b	46.25d
			KY331	31.00b	35.75c
KY333	16a	30.50bc

通过上述各实施例可以说明，本发明通过采用高通量富集筛选方法从河北省赵县采集的土壤中分离到了一株可降解除草剂阿特拉津的微生物菌株KY331，经过对该菌株的16sDNA的序列测定分析，该菌株与Paenarthrobacter ureafaciens具有高度同源。KY331与商业菌株枯草解淀粉菌株92068相比，菌株KY331可在40h内降解1000mg/L除草剂阿特拉津，降解率高达97.97％，同时本发明研究表明KY331菌株具有较好的耐酸，且在抗逆性(耐碱、耐盐)方面具有与商业菌株枯草解淀粉菌株92068相似的作用；在种子萌发实验中，与商业菌株枯草解淀粉菌株92068相比，KY331菌株对大豆种子以及玉米种子萌发的促进作用在SPSS分析下P<0.05水平上有显著差异性。由此可见，KY331是一株可快速高效降解除草剂阿特拉津，兼具抗逆性、促进作物种子发芽的功能性微生物菌株。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)菌株KY331，于2020年07月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20407。

2.菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述的产脲节杆菌(Paenarthrobacterureafaciens)菌株KY331。

3.权利要求1所述的产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)菌株KY331或权利要求2所述的菌剂在降解阿特拉津中的应用。

4.权利要求1所述的产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)菌株KY331或权利要求2所述的菌剂在制备降解阿特拉津的产品中的应用。

5.权利要求1所述的产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)菌株KY331或权利要求2所述的菌剂在促进作物发芽中的应用；

所述作物为大豆和玉米。

6.权利要求1所述的产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)菌株KY331或权利要求2所述的菌剂在制备促进作物发芽的产品中的应用；

所述作物为大豆和玉米。

7.一种用于降解阿特拉津和/或促进作物发芽的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)菌株KY331或权利要求2所述的菌剂；

所述作物为大豆和玉米。

8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述产品包括土壤改良剂、水体改良剂或肥料。