CN115927112B - 一株污染物降解菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
一株污染物降解菌及其应用，它涉及微生物领域。本发明的一株污染物降解菌为产脲节杆菌(Paenarthrobacterureafaciens)ZY，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏时间：2022年12月23日，保藏编号：CCTCCNO:M20222041。该菌株用于治理土壤或水中阿特拉津污染。产脲节杆菌(Paenarthrobacterureafaciens)ZY的分离及应用进一步丰富了该领域的菌种资源，有效填补了该方面的研究短板，并为治理阿特拉津、菲和四环素污染环境的实践工作提供了一套可行的方案，展现出巨大的研究价值与应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株污染物降解菌及其应用。
背景技术
阿特拉津(Atrazine，C8H14N5Cl) 是全球范围内广泛使用的一种三嗪类农药除草剂，主要用于控制小麦、玉米、果树等农田中阔叶杂草的生长。事实上，施用的农药只有1%左右作用在目标杂草上，大部分会残留在土壤中，通过沉降、径流、挥发、淋溶等从土壤进入水体，污染地下水和地表水，对生态环境和人类饮用水安全构成严重威胁。此外，阿特拉津具有致癌、致畸、致突变等毒性作用，可以通过食物链进入人体，直接危害人体健康。
目前，常用的阿特拉津污染修复方法主要有物理修复、化学修复和生物修复。生物修复技术由于环境友好、投资运行费用低等特点，已发展成为当前的主要处理方法之一。生物法是基于真菌、细菌的自然代谢过程去除污染物的技术，可将污染物彻底降解为CO2、H2O和无机氯化物，从而使土壤和水中的污染物得到彻底去除。目前已分离得到多种能够利用磺胺类化合物作为碳源的单菌或混合菌群，主要来自于变形菌门、放线菌门和厚壁菌门，已经报道的属有无色杆菌属（Achromobactersp.）、节杆菌属（Arthrobactersp.）、芽孢杆菌属（Bacillussp.）、螯合杆菌属（Chelatobactersp.）、柠檬球菌属（Citricoccussp.）、剑菌属（Ensifersp.）、弗兰克氏菌属（Frankiasp.）、诺卡氏菌属（Nocardiasp.）和类诺卡氏菌属（Nocardioidessp.）等。
阿特拉津在微生物降解过程中，充当着氮源，为微生物的生长代谢提供必要养分。杨立杰等在土壤中分离得到一株污染物降解菌Arthrobacter sp.ATR3，将其加入到土壤后，阿特拉津的去除效率明显提高。14天后，阿特拉津（4 mg·kg-1）土壤中的去除率为98.75%。范作伟等从玉米田土壤中分离出1株污染物降解菌Paenarthrobactersp. W24。污染土壤的生物修复结果表明，菌株Paenarthrobactersp. W24在培养35天时对污染土壤中阿特拉津（50 mg·kg-1）的降解率为83.5%，菌株W24表现出很好的应用潜力。Chen等发现Paenarthrobactersp. W11菌株培养49天后对阿特拉津污染土壤（50 mg·kg-1）的降解率高达96.0%。目前，由于工矿业、农业等人为活动以及土壤环境背景值高等因素已经造成了环境中农药的严重污染，并且农田土壤农药不断积累并长期保持在较高含量，影响动植物生长、微生物群落结构和酶活性，进而影响农产品安全和土壤功能。因此，筛选出能有效降解高浓度阿特拉津的菌株更具应用价值。
菲，结构式，化学式：C14H10，CAS：85-01-8，菲(PHE)是一种具有 3 个环状结构的多环芳烃 (PAHs)，是一种在环境中广泛分布的有机污染物，性质稳定、残留时间长，且具有致癌、致畸和致突变 作用，对人体健康和生态环境构成潜在危害。目前，已经报道的多环芳烃降解菌主要有Aeribacillus、Acinetobacter、Bacillus、Castellaniella、Geobacter、Lutimaribacter、Pontibacillus、Pseudomonas、Rhodanobacter和Sphingomonas等。
盐酸四环素，结构式，化学式：C22H25ClN2O8，CAS：64-75-5，是由放线菌产生的一种广谱抗生素，在使用过程中，四环素仅有部分被动物体吸收并发生代谢，其余抗生素仍然以活性形式 (母体或代谢产物) 随粪便和尿液排出体外，对生态系统和人类的健康造成极大的危害。目前，已经报道的四环素降解菌主要有Alcaligenes、Arthrobacter、Bacillus、Klebsiella、Serratia、Sphingobacterium和Stenotrophomonas等。
由此可见，对生态环境中的菲和盐酸四环素的微生物降解是目前研究的热点之一。目前，由于工业和农业的迅速发展，环境往往面临着多种污染物共同存在所形成的复合污染。因此，筛选一株具备多种污染物降解能力的菌株对于复合污染场地修复具有十分广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种有效降解高浓度阿特拉津的菌株。本发明另一个目的是提供一株产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY在治理阿特拉津、菲和四环素污染中的应用。
本发明的一株污染物降解菌，所述的污染物降解菌为产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏时间：2022年12月23日，保藏编号：CCTCC NO:M20222041。
本发明的一株污染物降解菌应用，所述的产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY用于降解浓度为10~100 mg·kg-1的阿特拉津。
进一步地，所述的产脲节杆菌（Paenarthrobacterureafaciens）ZY用于降解土壤或水中的阿特拉津。
本发明的一株污染物降解菌应用，所述的产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY用于降解菲。
本发明的一株污染物降解菌应用，所述的产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY用于降解盐酸四环素。
本发明的一株污染物降解菌制备的降解阿特拉津菌剂。
本发明包含以下有益效果：
本发明的产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY在25℃孵育下，在7日内能够降解土壤中100%（10 mg· kg-1）、100%（30 mg· kg-1）、95.96（50 mg· kg-1）、95.21%（70 mg· kg-1）和85.31%（100 mg· kg-1）的阿特拉津，与目前报道污染物降解菌株相比，本发明的产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY展现出更强的阿特拉津降解能力。因此，一株产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY可应用于土壤阿特拉津污染的修复。
本发明的产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY除了具有降解阿特拉津外，还具有降解菲，以及盐酸四环素的性能。12 h降解率接近100%（污染物浓度50 mg L-1）。
附图说明
图1为本发明的一株产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY的系统发育分析树图；
图2为本发明的一株产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY在显微镜观察下的革兰氏染色图；
图3为本发明的一株产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY在LB培养基中的菌落图；
图4为本发明的一株产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY在扫描电镜下观察图；
图5为本发明的一株产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY在不同pH下的阿特拉津降解情况图；
图6为本发明的一株产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY在不同温度下的阿特拉津降解情况图；
图7为本发明的一株产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY在不同阿特拉津浓度下的降解情况图；
图8为本发明的一株产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY在土壤中对不同浓度阿特拉津的降解情况图；
图9为本发明的一株产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY对菲和盐酸四环素的降解情况图。
具体实施方式
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述清楚说明本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1：一株产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY分离与鉴定
1. 菌株的驯化与选育
筛选自黑龙江省哈尔滨市的玉米种植土壤（126°49'40" E, 45°40'60" N），土壤样品在无菌收集后，经低温运送至实验室进行下一阶段研究工作。
在超净工作台中，将10.0 g前述土壤样品加入到100 mL灭菌后的MSMG液体培养基中（其中阿特拉津浓度为100mg·L-1），重新封口后，置于30℃恒温摇床内180 rpm震荡培养7天。随后取10 mL 上述混悬液重新接种在90 mL MSMG液体培养基中，继续置于30℃恒温摇床内180 rpm震荡培养7天。该接种过程重复5次，每次将MSMG培养基中的阿特拉津浓度提高100 mg·L-1，直至最终接种的MSMG培养基中阿特拉津浓度为500 mg·L-1。每次接种过程所产生的悬浊液即为梯度稀释的原液。该原液以10倍等比稀释，以10-4、10-5、10-6为稀释终浓度，均匀涂布于MSMG固体平板上，固体平板中包含相同浓度的阿特拉津，后将平板倒置于30℃恒温培养箱培养约72 h。经反复分离纯化，最终得到纯净的产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY。
2. 培养基
LB固体培养基组分为：蛋白胨10g、酵母浸粉5.0 g、氯化钠10.0 g、琼脂粉17.0 g、1000 mL去离子水，pH 6.9～7.1，高压灭菌。LB液体培养基组分为：蛋白胨10g，酵母浸粉5.0g，氯化钠10.0 g，琼脂粉15.0 g，去离子水1000 mL，pH 6.9～7.1，高压灭菌。补充葡萄糖作为碳源的无机盐液体培养基(标记为MSMG)组分为：2.4 g K2HPO4、0.2 g MgSO4·7H2O、1.2g KH2PO4、0.025 g CaCl2·2H2O、0.008 g Fe2(SO4)3、1.0 g glucose、1000 mL去离子水，调pH至7.0～7.2，高压灭菌。MSMG固体培养基组分为：2.4 g K2HPO4、0.2 g MgSO4·7H2O、1.2g KH2PO4、0.025 g CaCl2·2H2O、0.008 g Fe2(SO4)3、1.0 g glucose、琼脂粉17.0 g、1000mL去离子水，调pH至7.0～7.2，高压灭菌。
3.菌株形态及分子生物学鉴定
采用16S rDNA通用引物1492r进行16S rDNA的PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性30s；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。将PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收纯化测序，根据获得的16S rDNA序列在GenBank中Blast搜索同源序列并进行同源序列分析对比，建立系统发育树（图1）。
经鉴定一株产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY，其16S rDNA序列与NCBI已登录菌株Paenarthrobacter ureafacien sNC（accession no. NR_029281.1）相似度为99.19%，且在系统发育树上形成共同一枝，故命名为：一株产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY。NCBI登录号为no. ON878081。
保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏时间：2022年12月23日，保藏编号：CCTCC NO:M20222041。
本发明的一株产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY在30℃、LB培养基中培养过夜（18 h），离心后，收集菌株细胞，在MSMG培养基中悬浮三次。用紫外分光光度计测定最终细胞密度为1 × 108CFU·mL-1(OD600nm= 1.0)，用于后续降解实验。
上述LB固体培养基组分为：蛋白胨10g、酵母浸粉5.0 g、氯化钠10.0 g、琼脂粉17.0 g、1000 mL去离子水，pH6.9～7.1，高压灭菌。LB液体培养基组分为：蛋白胨10g，酵母浸粉5.0 g，氯化钠10.0 g，琼脂粉15.0 g，去离子水1000 mL，pH6.9～7.1，高压灭菌。
本实施例的污染物降解菌命名为产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY，菌株为革兰氏染色阴性菌（图2），其菌落呈圆状，乳黄色，不透明，菌落边缘为锯齿状（图3），直径约2 μm（图4）。
实施例2
本实施例的一株产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY在液体中降解能力评价。
在pH为3.0、5.0、7.0、9.0和11.0的MSMG液体介质中测试（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY降解阿特拉津的能力。
在20、25、30、35和40℃条件下，考察了温度对产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY降解阿特拉津的影响。
在10、30、50、70和100 mg·L-1条件下测试了产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY在不同初始阿特拉津浓度下的降解能力。
每次培养过程中只改变一个参数。将产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY接种于MSMG液体培养基中培养后，将OD600nm=1.0的MSMG悬浮液以1:50（v:v）接种量加入新鲜MSMG培养基中。其中，MSMG液体培养基中含有浓度为100 mg·L-1的阿特拉津。
补充葡萄糖作为碳源的无机盐液体培养基（标记为MSMG）组分为：2.4 g K2HPO4、0.2 g MgSO4·7H2O、1.2 g KH2PO4、0.025 g CaCl2·2H2O、0.008 g Fe2(SO4)3、1.0 gglucose、1000 mL去离子水，调pH至7.0～7.2，高压灭菌。
MSMG固体培养基组分为：2.4 g K2HPO4、0.2 g MgSO4·7H2O、1.2 g KH2PO4、0.025g CaCl2·2H2O、0.008 g Fe2(SO4)3、1.0 g glucose、琼脂粉17.0 g、1000 mL去离子水，调pH至7.0～7.2，高压灭菌。
结果：
产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY的阿特拉津降解特性
1.不同pH条件（3.0-11.0）下产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY降解特性
取上述灭菌后MSMG培养基。用HCl和NaOH溶液调节pH值分别为3.0、5.0、7.0、9.0和11.0，分别置于30℃、180 rpm恒温摇床内连续培养6h后取样分析（结果如图5）。结果表明，接种6 h后，pH 5.0~11.0时，阿特拉津去除率超过64.83%。pH为3.0时，产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY生长缓慢，不能代谢阿特拉津。在pH为5.0~11.0范围内，阿特拉津的降解率分别为11.42、12.11、11.21和10.81 mg·L-1·h-1。产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY生长和降解阿特拉津的pH范围宽且亲碱，这也揭示了产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY对阿特拉津污染场地修复具有很大的潜力，特别是碱性场地的修复。
2.不同阿特拉津浓度下具有很大的潜力的降解特性
将产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY接种到MSMG培养基中（100mg· L-1阿特拉津），将接种后的培养基分别置于20、25、30、35和40℃的恒温摇床内（180rpm）连续培养6h后取样分析。随着温度的升高，阿特拉津降解能力增强，在20、25和30℃处理6 h后，降解速率分别为8.08、8.20和11.95 mg·L-1·h-1。35℃和40℃处理6 h后，阿特拉津的降解能力均受到抑制（图6）。
3.不同阿特拉津浓度下产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY的降解特性分析
以阿特拉津作为产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY生长的氮源，调节MSMG培养基中阿特拉津浓度分别为10、30、50、70和100 mg· L-1。接种6 h后，在10、30、50、70、100 mg· L-1的阿特拉津水平下，阿特拉津降解率分别约为100%、99.57%、82.33%、74.28%和72.17%（图7）。
实施例3
本实施例的一株产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY在土壤中降解阿特拉津能力评价。
将200 g土壤样品（干重）加入甲醇溶解的阿特拉津，使最终浓度达到10、30、50、70和100 mg· kg-1（干重），然后放置在通风柜中4小时，使甲醇挥发。将菌株ZY接种土壤，使其初始浓度达到4 × 106CFU· g-1，然后过筛（80 目）达到均匀，置于营养钵中（Φ 9 cm）进行培养。分别于第1、3、5和7天测取土壤阿特拉津的含量，以评价产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY对土壤阿特拉津污染的修复能力。
结果：
经鉴定产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY在25℃下，在7日内能够降解土壤中100%（10 mg· kg-1）、100%（30 mg· kg-1）、95.96（50 mg· kg-1）、95.21%（70mg· kg-1）和85.31%（100 mg· kg-1）的阿特拉津。因此，产脲节杆菌（Paenarthrobacterureafaciens）ZY可应用于阿特拉津污染土壤的修复。
本发明的产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY在模拟修复过程中对土壤不同浓度阿特拉津的去除能力参见图8。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
实施例4
本实施例的一株产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY在菲降解能力评价。
将产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY接种于MSM液体培养基中培养后，将OD600nm=1.0的MSM悬浮液以1:50（v:v）接种量加入新鲜MSM培养基中培养。其中，MSM液体培养基中含有浓度为50 mg·L-1的菲。考察产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY对菲的降解能力，结果如图9所示。由图9可知，本实施例的产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY在接种12 h后，pH 7.0时，对菲的降解率接近100%。
培养基（MSM液体培养基）：2.4 g K2HPO4、0.2 g MgSO4·7H2O、1.2 g KH2PO4、0.025g CaCl2·2H2O、0.008 g Fe2(SO4)3、1000 mL去离子水，调pH至7.0～7.2，高压灭菌。
实施例5
本实施例的一株产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY在盐酸四环素降解能力评价。
将产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY接种于MSM液体培养基中培养后，将OD600nm=1.0的MSM悬浮液以1:50（v:v）接种量加入新鲜MSM培养基中培养。其中，MSM液体培养基中含有浓度为50 mg·L-1的盐酸四环素。考察产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY对盐酸四环素的降解能力，结果如图9所示。由图9可知，本实施例的产脲节杆菌（Paenarthrobacter ureafaciens）ZY在接种12 h后，pH 7.0时，对盐酸四环素的降解率接近100%。
培养基（MSM液体培养基）：2.4 g K2HPO4、0.2 g MgSO4·7H2O、1.2 g KH2PO4、0.025g CaCl2·2H2O、0.008 g Fe2(SO4)3、1000 mL去离子水，调pH至7.0～7.2，高压灭菌。
Claims (6)
1.一株污染物降解菌，其特征在于所述的污染物降解菌为产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)ZY，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏时间：2022年12月23日，保藏编号：CCTCC NO:M20222041。
2.如权利要求1所述的一株污染物降解菌应用，其特征在于所述的产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)ZY用于降解浓度为10～100mg·kg-1的阿特拉津。
3.根据权利要求2所述的一株污染物降解菌应用，其特征在于所述的产脲节杆菌(Paenarthrobacterureafaciens)ZY用于降解土壤或水中的阿特拉津。
4.如权利要求1所述的一株污染物降解菌应用，其特征在于所述的产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)ZY用于降解菲。
5.如权利要求1所述的一株污染物降解菌应用，其特征在于所述的产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)ZY用于降解盐酸四环素。
6.如权利要求1所述的一株污染物降解菌制备的降解阿特拉津菌剂。
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| 产脲节杆菌DnL1-1与植物联合对阿特拉津的降解;李红梅;李成云;李纪顺;杨凯;魏艳丽;杨合同;Bazhanau Dzmitry;;科学技术与工程;20170618(17);全文 * |
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