CN113215036B

CN113215036B - 一种三硝基甲苯降解菌株及其筛选方法与应用

Info

Publication number: CN113215036B
Application number: CN202110501321.XA
Authority: CN
Inventors: 廖晓勇; 罗俊鹏; 李尤; 朱勇兵; 刘晓东
Original assignee: Institute Of Chemical Defense Chinese Academy Of Military Sciences; University of Science and Technology of China USTC; Institute of Geographic Sciences and Natural Resources of CAS
Current assignee: Institute Of Chemical Defense Chinese Academy Of Military Sciences; University of Science and Technology of China USTC; Institute of Geographic Sciences and Natural Resources of CAS
Priority date: 2021-05-08
Filing date: 2021-05-08
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2041-05-08
Also published as: CN113215036A

Abstract

本发明属于微生物修复技术领域，具体涉及一种三硝基甲苯降解菌株及其筛选方法与应用。本发明提供了一种可高效、快速降解三硝基甲苯的微生物菌株，并将其应用于三硝基甲苯的降解。本发明的微生物菌株从三硝基甲苯污染场地内土壤中筛选获得，于2021年3月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.22050。本发明的菌株为治理被三硝基甲苯污染的水体和土壤提供了一种新的微生物种质资源。

Description

一种三硝基甲苯降解菌株及其筛选方法与应用

技术领域

本发明属于微生物修复技术领域，具体涉及一种三硝基甲苯降解菌株及其筛选方法与应用。

背景技术

三硝基甲苯(Trinitrotoluene，TNT)是一种分子结构中含有含能基团C-NO₂的硝基苯类化合物，其在受到激发时，能够在极短的时间内释放出大量的能量，为典型的含能化合物之一。三硝基甲苯自发明以来即被用于制造各类弹药和爆炸物，广泛应用于各类军事活动和矿山开采活动。三硝基甲苯对生物的毒性主要集中在血液、肝脾和其他免疫系统方面，可以使血红蛋白氧化或络合，造成血红蛋白血症，并引起头痛、恶心、呕吐等症状，导致肝功能异常、贫血、严重可致癌。此外，亦有研究表明三硝基甲苯会对男性的生殖功能造成不良影响，导致男性不孕不育。

由于军事活动、矿山开采活动以及炸药生产的管理和处置不当，许多三硝基甲苯和它们的副产物被大量释放进入生态环境中，对环境造成严重污染，威胁人类、牲畜、野生动物和生态系统的健康。据不完全统计，我国仅兵器行业火炸药类含能化合物导致的严重污染土壤总量就在200万方以上，其中大部分受三硝基甲苯污染；美国有数百个受三硝基甲苯污染的场地，大约5000万英亩的土地受到爆炸和其他训练活动的影响；在欧洲和亚洲等地区可能存在更多这类受污染土地。三硝基甲苯对环境的污染已逐步成为全世界广泛关注的问题。

目前，对于炸药污染物的修复方法主要包括热处理(焚烧)、物理化学方法(化学还原、原位化学反应、电化学方法、石灰处理和化学氧化)和生物降解/修复三类方法。然而诸如焚烧、吸附、高级氧化等物理及化学修复技术往往成本较高，且易引起其他的环境问题。而生物修复技术，尤其是微生物修复，以其“绿色”、高效、成本低廉等优点，得到了人们的广泛关注。然而，鉴于三硝基甲苯的敏感性，国内致力于三硝基甲苯污染物修复的研究团队较少，相关的公开报道极其有限。随着我国对于军事污染场地的日益重视，针对三硝基甲苯污染修复技术研究，尤其是微生物修复技术的研究，已刻不容缓。

因此，找出适合我国国情，能够高效、快速降解三硝基甲苯的菌株，对促进我国三硝基甲苯的微生物修复技术研究，丰富我国微生物种质资源显得十分重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种三硝基甲苯降解菌株及其筛选方法与应用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种三硝基甲苯降解菌株BJ2(Pantoea wallsii)，所述三硝基甲苯降解菌株BJ2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC NO.22050。

本发明还提供一种用于降解三硝基甲苯的组合物，所述组合物中含有如前所述的三硝基甲苯降解菌株BJ2，或其生物组分，或其代谢产物。

本发明还提供一种用于降解三硝基甲苯的处理装置，所述处理装置中含有如前所述的三硝基甲苯降解菌株BJ2，或其生物组分，或其代谢产物；或者所述处理装置以含有如前所述的三硝基甲苯降解菌株BJ2，其生物组分，或其代谢产物的制剂对三硝基甲苯进行处理。

本发明还提供如前所述的三硝基甲苯降解菌株BJ2，或其生物组分，或其代谢产物在降解三硝基甲苯中的应用。

本发明还提供如前所述的三硝基甲苯降解菌株BJ2，或其生物组分，或其代谢产物在制备用于降解三硝基甲苯的制剂，用于降解三硝基甲苯的处理装置或用于降解三硝基甲苯的处理系统中的用途。

上述三硝基甲苯降解菌株BJ2的筛选方法，包括以下步骤：

1)将三硝基甲苯污染土壤置于M9培养基中，培养得悬浊液；

2)将所述悬浊液按比例转移至以三硝基甲苯为唯一氮源的改良M9培养基中，培养得菌悬液；

3)按步骤2)所述的培养条件进行传代培养三至五次，取最后一个传代周期的培养液稀释后涂布于固体培养基中，培养至菌落长出；所述固体培养基为以三硝基甲苯为唯一氮源的改良M9固体培养基；

4)将步骤3)所得菌落在所述固体培养基上划线纯化后，获得所述三硝基甲苯降解菌株。

上述三硝基甲苯降解菌株BJ2的筛选方法中，优选地，步骤1)中，1g三硝基甲苯污染土壤对应的M9培养基的体积为10mL。

上述三硝基甲苯降解菌株BJ2的筛选方法中，优选地，步骤1)中，所述培养为振荡培养，所述振荡培养的条件为：温度30℃、转速120rpm、时间48h。

上述三硝基甲苯降解菌株BJ2的筛选方法中，优选地，步骤2)中，所述比例为1：9的体积比。

上述三硝基甲苯降解菌株BJ2的筛选方法中，优选地，步骤2)中，所述培养为振荡培养，所述振荡培养的条件为：温度30℃、转速120rpm、时间48h。

上述三硝基甲苯降解菌株BJ2的筛选方法中，优选地，步骤3)中，所述培养至菌落长出的培养温度为30℃。

上述三硝基甲苯降解菌株BJ2的筛选方法中，优选地，步骤2)中，所述以三硝基甲苯为唯一氮源的改良M9培养基为使用三硝基甲苯替换原有的氮源。

上述三硝基甲苯降解菌株BJ2的筛选方法中，优选地，步骤3)中，所述固体培养基为在所述以三硝基甲苯为唯一氮源的改良M9培养基制备中加入琼脂粉。

上述三硝基甲苯降解菌株BJ2的筛选方法中，优选地，步骤2)中，所述以三硝基甲苯为唯一氮源的改良M9培养基、步骤3)中所述固体培养基中三硝基甲苯的浓度均为100mg/L。

上述三硝基甲苯降解菌株BJ2的筛选方法中，优选地，步骤1)中，所述M9培养基的制备方法为：取2mL 1mol/L MgSO₄水溶液，0.1mL 1mol/LCaCl₂水溶液，20mL 20w/v％葡萄糖水溶液，12.8g Na₂PO₄·7H₂O，3.0gKH₂PO₄，0.5g NaCl，1g NH₄Cl，用无菌蒸馏水定容至1L。

上述三硝基甲苯降解菌株BJ2的筛选方法中，优选地，步骤2)中，所述以三硝基甲苯为唯一氮源的改良M9培养基为将所述M9培养基的制备方法中用0.1g三硝基甲苯替代1gNH₄Cl。

上述三硝基甲苯降解菌株BJ2的筛选方法中，优选地，步骤3)中，所述固体培养基为在所述以三硝基甲苯为唯一氮源的改良M9培养基制备中加入18g琼脂粉制备而成。

上述三硝基甲苯降解菌株BJ2的筛选方法中，优选地，所述20w/v％葡萄糖水溶液通过0.22μm滤膜除菌，制备M9培养基的其他原料于121℃下灭菌30min。

有益效果：

本发明提供的菌株是首次发现的能够以三硝基甲苯为唯一氮源生长的Pantoeawallsii菌株，其对环境中三硝基甲苯的降解快速而高效，10％投加比(体积比)的菌悬液(OD₆₀₀＝0.3)能够使100mg/L的三硝基甲苯24h内的降解效率高达97.85％。本发明为三硝基甲苯污染的修复提供了一种新的优良的微生物种质资源。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。其中：

图1为本发明的三硝基甲苯降解菌株BJ2的镜检形态照片；

图2为本发明的三硝基甲苯降解菌株BJ2的菌落形态图；

图3为本发明的三硝基甲苯降解菌株BJ2的系统发育树；

图4为本发明的三硝基甲苯降解菌株BJ2对三硝基甲苯的降解结果，图中：横坐标为降解时间，纵坐标为三硝基甲苯降解菌株BJ2菌株对三硝基甲苯的降解效率；CK为对照组，不加菌处理，BJ2为实验组，以10％投加比(体积比)加入了OD₆₀₀值为0.3的三硝基甲苯降解菌株BJ2菌悬液。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下述实施例中所用的试剂材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所用的设备，如无特殊说明，均为本领域常规设备。

本发明的三硝基甲苯降解菌株BJ2(Pantoea wallsii)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：中国普通微生物菌种保藏管理中心)，菌种保藏号为：CGMCC NO.22050，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏时间为2021年3月23日。本发明的三硝基甲苯降解菌株BJ2于2020年9月采集自中国北京。

本发明的三硝基甲苯降解菌株BJ2能够以三硝基甲苯为唯一氮源生长。

以下实施例中涉及的培养基，具体为：

(1)M9培养基，配方为：2mL 1mol/L MgSO₄水溶液，0.1mL 1mol/L CaCl₂水溶液，20mL 20w/v％葡萄糖水溶液，12.8g Na₂PO₄·7H₂O，3.0g KH₂PO₄，0.5g NaCl，1g NH₄Cl，用无菌蒸馏水定容至1L。

(2)以三硝基甲苯为唯一氮源的改良M9培养基，配方为：在上述M9培养基的基础上，用0.1g三硝基甲苯替代1g NH₄Cl，在此改良M9培养基中三硝基甲苯浓度为100mg/L。

(3)以三硝基甲苯为唯一氮源的改良M9固体培养基，配方为：在上述以三硝基甲苯为唯一氮源的改良M9培养基的基础上，加入18g琼脂粉制备而成。

(4)LB培养基，配方为：10g蛋白胨，5g牛肉膏，5gNaCl，蒸馏水800mL，调节pH为7.0，用蒸馏水定容至1L，121℃下灭菌30min。

配制以上三种M9培养基时，所用原料具体为：

(1)纯品三硝基甲苯，从北方某军工企业获得，纯度99.8％；

(2)20w/v％葡萄糖水溶液通过0.22μm滤膜除菌，20w/v％葡萄糖水溶液的配制属于现有技术，简述如下：准确称取20g葡萄糖，先用少量水溶解，然后再逐渐加水到100mL刻度线；

(3)其他原料，于121℃下灭菌30min。

以下实施例中涉及的磷酸盐缓冲液，配方为：0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄，8g NaCl，1.44g Na₂HPO₄，蒸馏水800mL，调节pH为7.0，用蒸馏水定容至1L，121℃下灭菌30min。

以下，结合具体的实施过程对本发明进行进一步的描述。

实施例1三硝基甲苯降解菌株BJ2 Pantoea wallsii的分离与筛选

本实施例的三硝基甲苯降解菌株BJ2 Pantoea wallsii的分离与筛选方法，具体包括以下步骤：

1)在中国北方某三硝基甲苯污染场地采集受三硝基甲苯污染的土壤，称取5g的土壤加入50mL M9培养基中，在30℃、120rpm条件下恒温振荡培养48h，获得悬浊液；

2)将所得悬浊液按10％(体积比)的比例转移至以三硝基甲苯为唯一氮源的改良M9培养基中，在30℃、120rpm条件下恒温振荡培养48h，获得菌悬液；

3)按照步骤2)所述的培养条件进行传代培养三次，取最后一个继代周期(即传代周期)的培养液梯度稀释后涂布于以三硝基甲苯为唯一氮源的改良M9固体培养基中，于30℃下培养，直至有菌落长出；

4)将步骤3)所得菌落在以三硝基甲苯为唯一氮源的M9固体培养基上多次划线纯化，直至得到形态单一的单菌落，获得三硝基甲苯降解菌，将其命名为三硝基甲苯降解菌株BJ2。三硝基甲苯降解菌株BJ2的镜检照片如图1(单菌落载玻片，400倍)，菌落形态结构如图2。

本发明对培养条件未做特别限制，以上实验均在常规的大气环境中进行。

实施例2纯化菌种的鉴定

本发明实施例2中，三硝基甲苯降解菌株BJ2是根据实施例1所述的筛选方法从三硝基甲苯污染土壤中获得的(实施例2中的菌株选取实施例1最终得到的菌落进行后续操作)，三硝基甲苯降解菌株BJ2的纯化菌种的鉴定步骤如下：

将实施例1所获得的纯化菌种BJ2进行16S rRNA扩增，使用16S rRNA通用引物(F27(SEQ ID NO.1)：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，R1492(SEQ ID NO.2)：5’-TACGYTACCTTGTTACGACT-3’)进行PCR扩增，反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，24个循环。反应体系为：10×Ex Taq buffer 5.0μL，2.5mMdNTPMix 4.0μL，10p Primer1 2.0μL，10p Primer2 2.0μL，5u Ex Taq 0.5μL，Template2.0μL，ddH₂O 34.5μL，Total volume 50μL。将所得PCR产物进行电泳检测，切胶纯化测序，获得序列(如SEQ ID NO.3所示)，与美国国立生物信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)基因库内序列进行比对，发现该降解菌的序列与数据库中Pantoea wallsii的16S rRNA基因序列同源性高达99.86％，结合MEGA7.0软件构件BJ2菌的系统发育树，如图3所示，比对分析结果鉴定菌株BJ2为Pantoea wallsii。

根据系统发育树可知，三硝基甲苯降解菌株BJ2的分类学为：细菌界(Bacteria)；变形菌门(Proteobacteria)；γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)；肠杆菌目(Enterobacterales)；欧文菌科(Erwiniaceae)；泛菌属(Pantoea)。

SEQ ID NO.3所示为：

实施例3三硝基甲苯降解菌株BJ2对三硝基甲苯的降解效果

挑取实施例1中筛选获得的三硝基甲苯降解菌株BJ2单菌落接种于50mL LB培养基中，于30℃、120rpm条件下富集培养18h，所得培养液于4℃，8000g下离心分离10min，收集菌体，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤三次后重悬，调节OD₆₀₀值为0.3，制备菌悬液。将所得菌悬液以10％投加比(体积比)接种至以三硝基甲苯为唯一氮源的改良M9培养基中，培养液中三硝基甲苯浓度为100mg/L；对照组(CK组)中用等量磷酸盐缓冲液替代菌悬液投加。将上述培养液于30℃、120rpm条件下恒温振荡培养72h，每隔一定时间取样检测培养液中三硝基甲苯浓度。实验重复三次。

用GC-MS法测定三硝基甲苯浓度，GC-MS设定参数如下：色谱柱型号DB-5MS，升温程序为初始温度40℃，保持4min，10℃/min从40℃升至300℃，保持2min。不分流进样，进样量1μL，载气为氦气，流速1.0mL/min，进样口温度280℃，EI源，SIM模式。

三硝基甲苯降解菌株BJ2对三硝基甲苯的降解效果如图4所示。三硝基甲苯降解菌株BJ2对三硝基甲苯的降解6h可达42.87％，12h可达86.59％，24h可达97.85％，48h时降解效率已超99％，几乎完全降解三硝基甲苯。这一结果表明三硝基甲苯降解菌株BJ2可以快速、高效的降解三硝基甲苯。这为三硝基甲苯污染的修复提供了一种新的优良的微生物种质资源。

需要说明的是，尽管在本说明书中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院地理科学与资源研究所

中国人民解放军军事科学院防化研究院

中国科学技术大学

<120> 一种三硝基甲苯降解菌株及其筛选方法与应用

<130> M1ZZCN210316_IV21-0121

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacgytacct tgttacgact 20

<210> 3

<211> 1410

<212> DNA

<213> 三硝基甲苯降解菌(Pantoea rodasii)

<400> 3

acacatgcag tcgacggtag cacagagagc ttgctctcgg gtgacgagtg gcggacgggt 60

gagtaatgtc tgggaaactg cccgatggag ggggataact actggaaacg gtagctaata 120

ccgcataacg tcgcaagacc aaagtggggg accttcgggc ctcacaccat cggatgtgcc 180

cagatgggat tagctagtag gtggggtaat ggctcaccta ggcgacgatc cctagctggt 240

ctgagaggat gaccagccac actggaactg agacacggtc cagactccta cgggaggcag 300

cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag cctgatgcag ccatgccgcg tgtatgaaga 360

aggccttcgg gttgtaaagt actttcagcg gggaggaagg cggtgaagtt aatagcttca 420

ccgattgacg ttacccgcag aagaagcacc ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat 480

acggagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgcag gcggtctgtc 540

aagtcggatg tgaaatcccc gggcttaacc tgggaactgc attcgaaact ggcaggctgg 600

agtcttgtag aggggggtag aattccaggt gtagcggtga aatgcgtaga gatctggagg 660

aataccggtg gcgaaggcgg ccccctggac aaagactgac gctcaggtgc gaaagcgtgg 720

ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgtcg acttggaggt 780

tgttcccttg aggagtggct tccggagcta acgcgttaag tcgaccgcct ggggagtacg 840

gccgcaaggt taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 900

tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac ctactcttga catccagaga acttagcaga 960

gatgctttgg tgccttcggg aactctgaga caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg 1020

ttgtgaaatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttatcctttg ttgccagcgg 1080

ttcggccggg aactcaaagg agactgccag tgataaactg gaggaaggtg gggatgacgt 1140

caagtcatca tggcccttac gagtagggct acacacgtgc tacaatggcg catacaaaga 1200

gaagcgacct cgcgagagca agcggacctc ataaagtgcg tcgtagtccg gatcggagtc 1260

tgcaactcga ctccgtgaag tcggaatcgc tagtaatcgt agatcagaat gctacggtga 1320

atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagtgggt tgcaaaagaa 1380

gtaggtagct taaccttcgg gagggcgcta 1410

Claims

1.一种三硝基甲苯降解菌株，其特征在于，所述三硝基甲苯降解菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC NO.22050。

2.一种用于降解三硝基甲苯的组合物，其特征在于，所述组合物中含有如权利要求1所述的三硝基甲苯降解菌株。

3.一种用于降解三硝基甲苯的处理装置，其特征在于，所述处理装置中含有如权利要求1所述的三硝基甲苯降解菌株；或者

所述处理装置以含有如权利要求1所述的三硝基甲苯降解菌株的制剂对三硝基甲苯进行处理。

4.如权利要求1所述的三硝基甲苯降解菌株在降解三硝基甲苯中的应用。

5.如权利要求1所述的三硝基甲苯降解菌株在制备用于降解三硝基甲苯的制剂，用于降解三硝基甲苯的处理装置或用于降解三硝基甲苯的处理系统中的用途。