CN110982756B

CN110982756B - 一株弗留明拜叶林克氏菌菌株及其在砷氧化中的应用

Info

Publication number: CN110982756B
Application number: CN201911389984.6A
Authority: CN
Inventors: 孙蔚旻; 孙晓旭; 李宝琴; 黄裕青; 孔天乐; 王小雨; 张苗苗; 裘浪
Original assignee: Institute of Eco Environmental and Soil Sciences of Guangdong Academy of Sciens
Current assignee: Institute of Eco Environmental and Soil Sciences of Guangdong Academy of Sciens
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2039-12-30
Also published as: CN110982756A; WO2021135237A1; US20230055742A1

Abstract

本发明公开了一株弗留明拜叶林克氏菌菌株及其在砷氧化中的应用，所述的菌株是AS‑56，已于2019年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20191014。本发明的弗留明拜叶林克氏菌(Beijerinckia fluminesis)菌株AS‑56能把As(III)氧化为毒性较低的As(V)，能将0.15g/L的As(III)溶液全部氧化成As(V)，大大降低砷的毒性，因此该菌株在环境修复方面具有广泛的应用前景。

Description

一株弗留明拜叶林克氏菌菌株及其在砷氧化中的应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株弗留明拜叶林克氏菌菌株，该菌株可氧化砷，从而降低砷对环境的不利影响。

背景技术

近年来，随着矿冶、化工、农药等行业的发展，我国湖南、广东、贵州和云南等省份的部分地区土壤砷污染十分严重。

砷是一种典型的人体致癌物，毒性较大。目前，国内外砷污染土壤的治理方法包括物理、化学和生物修复方法。电动修复技术、换土法等物理方法工程量大、耗时长、处理费用高；固化/稳定化法、土壤淋洗法等化学方法使用范围窄、局限性强，且容易引起其他环境风险；植物修复法治理周期长，植物在不同区域条件的生长差异使此技术难以形成标准化；同时，以上方法均在大面积砷污染土壤的治理中难以推广。

微生物修复是通过自然环境中的土著微生物或者人为添加的功能微生物，使污染物产生氧化还原、吸收、降解等作用，以此降低土壤中污染物毒性的方法，具有安全、高效、低成本、环境友好、能大面积应用等优点，是最具发展和应用前景的环境修复新技术。

自然环境中的砷主要以两种化合价存在：As(V)和As(III)，在大多数环境条件下，As(III)的毒性是As(V)的25～60倍。因此，如果能将毒性较强的As(III)氧化成毒性较弱的As(V)，可以减少砷的迁移性与毒性，具有实际的环境修复意义。

自然界中的微生物广泛地参与了砷的地球化学循环，微生物对砷的适应性极强，有的微生物甚至可以通过氧化As(III)来获取能量以供生长，使环境中的As(III)氧化成As(V)，减轻了砷的毒性。同时，微生物驱动的砷氧化作用，能够明显提高砷的氧化速度。因此，可以利用微生物驱动的砷氧化作用，来减轻自然生境中的砷污染问题。

微生物驱动的砷的氧化过程，能够降低砷在环境中的毒性和迁移能力，在砷污染修复方面起到重要作用。目前研究发现的砷氧化菌主要属于假单胞菌属(Pseudomonas)、硫单胞菌属(Thiomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、无色杆菌属(Achromobacter)等，至今暂未发现拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)氧化砷的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株弗留明拜叶林克氏菌(Beijerinckia fluminesis)菌株AS-56，该菌株具有氧化砷的功能，可以将毒性较强的As(III)氧化为毒性较低的As(V)，大大降低了砷在环境中的毒性，可应用于矿区等砷污染环境的修复。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一株弗留明拜叶林克氏菌(Beijerinckia fluminesis)菌株AS-56，已于2019年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国湖北省武汉市武汉大学内)，保藏编号为CCTCC NO：M 20191014。

菌株AS-56的筛选、分离过程为：采集湖南省石门县雄黄矿区尾矿砷污染土壤，在液体培养基中培养一周后，取培养液均匀涂布于固体培养基上，置于生化培养箱30℃培养，待菌长出后挑取不同形态的菌落采用划线法进行分离，连续分离纯化得到单一菌落，此菌落为具有三价砷氧化能力的高效砷氧化菌。

该单一菌落中的菌株为杆状，革兰氏阴性，大小为0.1-0.3×0.06-1.0μm，细菌不具有运动性。采用Biolog鉴定后发现，在94种不同物质的代谢性和耐受性测试中，该菌株能代谢乙酸、D-葡糖酸、D-麦芽糖等43种碳源，对1％NaCl、醋竹桃霉素、四唑紫等8种物质显示出耐受性。

结合16S rRNA等相关生物信息学鉴定结果，确定该菌株是弗留明拜叶林克氏菌(Beijerinckia fluminesis)，命名为弗留明拜叶林克氏菌AS-56。

利用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光(HPLC-HG-AFS)技术定量分析，发现本发明的菌株AS-56具有砷氧化能力，能够将As(III)氧化成As(V)；

尤其地，在含有0.15g/L As(III)的溶液中，本发明的菌株AS-56能够将其中的As(III)全部氧化为As(V)；

尤其地，本发明的菌株AS-56能够用于修复砷污染土壤，能够将其中的As(III)氧化成As(V)。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明发现了一株具有砷氧化能力的弗留明拜叶林克氏菌(Beijerinckiafluminesis)菌株AS-56，该菌株能把As(III)氧化为毒性较低的As(V)，能将0.15g/L的As(III)溶液全部氧化成As(V)，大大降低砷的毒性，因此该菌株在环境修复方面具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是Beijerinckia fluminesis AS-56菌株的扫描电镜图。

图2是Beijerinckia fluminesis AS-56菌株的系统发育分析。

图3是Beijerinckia fluminesis AS-56菌株氧化As(III)的曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：菌株的分离、纯化

(1)土壤样品采集于2018年1月5日湖南省石门县雄黄尾矿，取1.5g砷污染土壤样品于50mL锥形瓶中，加入15mL液体培养基，具体组成为：20g/L蔗糖，1.0g/L K₂HPO₄，0.5g/LMgSO₄，0.5g/L NaCl，0.1g/L FeSO₄，0.005g/L MoNa₂O₄，2.0g/L CaCO₃。接种后采用灭菌好氧膜封口，放置于30℃150rpm摇床中振荡培养。

(2)培养一周后，取20μL培养液均匀涂布于固体培养基上(每升培养基加15g琼脂，其它成分同上述液体培养基)，置于生化培养箱30℃培养，待菌长出后挑取不同形态的菌落采用划线法进行分离、纯化，划线接种于固体培养基，重复此步骤四次得到单一菌落，放4℃冰箱待用并用瓷珠菌种保存管保存于-80℃。

实施例2：菌株的鉴定

(1)生理生化性质的鉴定

对实施例1得到的单一菌落进行扫描电镜观察，该菌株菌体为杆状，属于短杆菌，见图1。

对该菌株做革兰氏染色，具体步骤为：在干净的载玻片上滴一滴水，用接种环挑取菌体均匀涂布于水中，将玻片靠近酒精灯火焰，蒸干水分，加入草酸铵结晶紫染1分钟，蒸馏水冲洗，加碘液覆盖涂面染约1分钟，水洗后用吸水纸吸去水分，加95％酒精数滴，并轻轻摇动玻片进行脱色，20秒后水洗，吸去水分，加入蕃红染色液染色1分钟，蒸馏水冲洗，干燥，镜检。染色结果为呈红色，确定菌株为革兰氏阴性。

Biolog微生物鉴定步骤为：确定菌株革兰氏染色呈阴性结果后，挑取单个纯化菌落接种到Biolog专用接种液GN/GP-IF中，制成一定细胞浓度的菌悬液，然后用移液枪将菌悬液按每孔150μL转接Biolog GENⅢ微孔鉴定板的96个孔内，做好标记然后放到30℃恒温生化培养箱培养4-6h和16-24h时在读数仪上读取菌株的代谢指纹特征，在Biolog数据库中进行相似性比对，查找最接近的结果。

Biolog数据库比对步骤为：打开Biolog软件，设置好培养时间、菌株名称、菌株编号、菌株类型等参数，用干净纸巾擦拭培养好的鉴定板底部，放入读数仪，A-1孔位于左上方，点击“Read This”进行读数，得出鉴定结果，见表1。

由表1可以看出，在94种不同物质的代谢性和耐受性测试中，第1-9列为代谢性试验，第10-12列为耐受性试验，结果显示，该菌株能代谢乙酸、D-葡糖酸、D-麦芽糖等43种碳源，对1％NaCl、醋竹桃霉素、四唑紫等8种物质显示出耐受性。

(2)分子生物学鉴定

采用细菌基因组DNA抽提试剂盒对实施例1得到的单一菌落进行DNA提取，然后采用16S rRNA基因通用引物对F27(5'agagtttgatcmtggctcag3')(SEQ.ID.NO.1)和1492R(5'ggytaccttgttacgactt3')(SEQ.ID.NO.2)进行扩增并测序，将获得的DNA序列(SEQ.ID.NO.3)输入GenBank，以Blastn程序对数据库中的所有序列进行比较分析。

利用16S rRNA基因序列构建了系统发育树(如图2所示)，发现实施例1单一菌落的16S rRNA与Beijerinckia fluminesis聚在一簇，相似度达到99％。

综合上述两方面的结果，确定实施例1分离得到的菌株是弗留明拜叶林克氏菌(Beijerinckia fluminesis)，命名为弗留明拜叶林克氏菌AS-56。

实施例3：菌株AS-56对As(III)的氧化性能

As(III)的氧化性能研究设置了接菌组和不接菌组，具体操作如下：

接菌组：在固体培养基中刮取半个平板表面的AS-56菌落接种到50mL西林瓶中，加入25mL液体培养基，培养基组成为：1.5g/L KH₂PO₄，10.55g/L Na₂HPO₄·12H₂O，0.3g/LNH₄Cl，0.1g/L MgCl₂，0.672g/L NaHCO₃，0.13g/L NaAsO₂。接种后采用橡胶塞封口，置于30℃摇床中，以150rpm震荡培养。于0h，6h，12h，24h，48h分别取一次样品，并过滤保存于4℃备用；将样品稀释500倍后，用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光(HPLC-HG-AFS)测As(Ⅲ)和As(Ⅴ)浓度。

不接菌组：向50mL西林瓶中加入25mL液体培养基，培养基组成为：1.5g/L KH₂PO₄，10.55g/L Na₂HPO₄·12H₂O，0.3g/L NH₄Cl，0.1g/L MgCl₂，0.672g/L NaHCO₃，0.13g/LNaAsO₂。接种后采用橡胶塞封口，置于30℃摇床中，以150rpm震荡培养。于0h，6h，12h，24h，48h分别取一次样品，并过滤保存于4℃备用；将样品稀释500倍后，用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光(HPLC-HG-AFS)测As(Ⅲ)和As(Ⅴ)浓度。

将接菌组和不接菌组的As(Ⅲ)和As(Ⅴ)浓度绘制砷氧化曲线图，如图3所示。图3中：X轴为时间(h)，取样时间为0h，6h，12h，24h，48h；Y轴为砷浓度(g/L)。

从图3可知，在不接菌的培养基中，As(III)浓度基本维持在0.14g/L左右，也检测不到As(V)的存在；而在接菌的培养基中，溶液中As(III)浓度从0.15g/L不断下降至0g/L，而As(V)浓度则从0g/L上升至0.15g/L左右，表明砷氧化反应的发生来自于菌株的接入，在含砷的培养基中接入菌株Beijerinckia fluminesis AS-56，可以将全部的As(III)氧化为As(V)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东省生态环境技术研究所

<120> 一株弗留明拜叶林克氏菌菌株及其在砷氧化中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F27

<400> 1

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1492R

<400> 2

ggytaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1386

<212> DNA

<213> 弗留明拜叶林克氏菌(Beijerinckia fluminesis)

<400> 3

gcgggcggca ggcttacaca tgcagtcgaa cgccccgcaa ggggagtggc agacgggtga 60

gtaacgcgtg ggaacatacc ctttcctgcg gaatagctcc gggaaactgg aattaatacc 120

gcatacgccc tacgggggaa agatttatcg gggaaggatt ggcccgcgtt ggattagcta 180

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cgcacgtagg cggatattta agtcaggggt gaaatcccgc agctcaactg cggaactgcc 540

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attcgtagat attcggagga acaccagtgg cgaaggcggc ttactggtcc attactgacg 660

ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 720

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ttccgcctgg ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac 840

aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgcag aaccttacca gctcttgaca 900

ttcggggtat gggcattgga gacgatgtcc ttcagttagg ctggccccag aacaggtgct 960

gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1020

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gagaggaagg tggggatgac gtcaagtcct catggccctt acgggctggg ctacacacgt 1140

gctacaatgg tggtgacagt gggcagcgag acagcgatgt cgagctaatc tccaaaagcc 1200

atctcagttc ggattgcact ctgcaactcg agtgcatgaa gttggaatcg ctagtaatcg 1260

cagatcagca tgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1320

tgggagttgg ttttacccga aggtagtgcg ctaaccgcaa ggaggcagct aaccacgtag 1380

ttacgt 1386

Claims

1.一株弗留明拜叶林克氏菌(Beijerinckia fluminesis)菌株AS-56，其特征在于：已于2019年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20191014。

2.权利要求1所述的弗留明拜叶林克氏菌菌株AS-56在将As(III)氧化成As(V)中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：在含有0.15g/L As(III)的溶液中，所述的菌株AS-56将As(III)氧化为As(V)。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的菌株AS-56用于修复砷污染土壤。