CN108753647B - 一种除砷固载化小球及其用途 - Google Patents

一种除砷固载化小球及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种除砷固载化小球，其制备步骤包括台湾假单胞菌（保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为Pseudomonas taiwanensis 11 CCTCC M 2016700）的活化、扩培与菌体收集、包埋材料的制备、除砷固载化小球的获得。本发明还公开了所述的除砷固载化小球在降低水体砷含量中的用途。运用本发明提供的除砷固载化小球降低水体砷含量，具有效率高、成本低、反应易控制、细胞密度高、固液分离效果好、对环境(如pH值、温度、有机溶剂、有毒物质)的耐受力强等优点。在处理废水时将废水调整pH值接近中性时，除砷效果最好。本发明在处理砷含量超标废水领域，具有广阔的市场前景。

Description

一种除砷固载化小球及其用途
技术领域
本发明涉及环境修复技术领域，具体涉及一种除砷固载化小球及其用途。
背景技术
土壤、水环境砷污染来源十分广泛，主要由一些人为活动导致，包括杀虫剂的使用、除草剂和磷酸盐肥料的施放、半导体工业的发展、采矿和冶炼、制造业、燃煤、木材保存剂等，使得土壤中砷浓度日益增加，引起了世界范围内不同程度的土壤、水环境砷污染，我国已经将砷列为第一类重点防控污染物。因此防治砷污染成为亟需解决的社会问题。
从60年代后期快速发展的固定化微生物技术是一种高效率的废水生物处理技术，弥补了传统悬浮生物方法的许多缺点，具有环境承受力强、反应易被操控、固液分离功效显著等优势。固定化微生物是一种通过化学或物理方法将游离细胞或者酶定位在有限空间区域的方法，以使它们能够被重复使用并能保持微生物活性。包埋法是比较常见的细胞固定方法，即用水不溶性的聚合物凝胶或膜把微生物细胞包埋固定在内，通过聚合作用将菌体截留，但是小分子量的代谢产物与底物能自如进出。其操纵简便，可以维持菌体的多酶体系，制作的包埋小球强度高，对微生物菌体活性的影响小，成为废水治理的热点之一。
目前砷污染环境的修复有传统的化学氧化、沉淀和物理吸附、离子交换等方法。化学和物理方法的优点是效果好，起效快，但有产生的废渣难处理、产生二次污染、不能大规模处理、成本高等缺点，在我国现有条件和环境下实行较为困难。生物修复主要有植物修复和微生物修复两种。一种是利用大型植物，如娱蛤草吸收高浓度的砷并富集在体内，大量种植收集后处理，但工程量大且产生废渣难处理。另外一种是利用微生物经代谢后吸附砷作用，这种方法虽然具有无害的优点，但工程量较大，效率也有待提高。
本发明采用的固载化微生物为Pseudomonas taiwanensis，可以将毒性强的三价砷氧化成毒性弱的五价砷，三价砷毒性约为五价砷毒性的100倍，且五价砷带负电荷更易被吸附沉降，因此大大降低了环境中砷的毒性。将其采用包埋法制备成固载化小球，能给砷污染废水处理提供新的思路和技术基础。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中的上述缺陷，提供一种能高效率、低成本、环保地降低废水中砷含量的除砷固载化小球。
本发明的另一目的是提供上述除砷固载化小球的用途。
为实现上述目的，本发明提供了一种除砷固载化小球，其特征在于制备方法包括如下步骤：
(1)台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为Pseudomonas taiwanensis 11CCTCC No:M 2016700)的活化：取50μLPseudomonas taiwanensis菌液(OD600值为0.6～0.8)接种到5mLTSB液体培养基中，放置在37℃、180r/min摇床中培养12h后，得到活化菌液Ⅰ，于 4℃冰箱保藏备用；
(2)Pseudomonas taiwanensis的扩培与菌体收集：以体积百分比为1％的接种量接种步骤(1)中得到的活化菌液Ⅰ到TSB液体培养基中，放置在30℃、180 r/min摇床中培养12h后，得到菌液Ⅱ，在4℃、6000r/min的条件下离心10min，收集菌体，菌体于4℃冰箱保藏备用；
(3)包埋材料的制备：向蒸馏水中加入载体材料PVA、海藻酸钠和硅藻土，按照质量百分比，PVA、海藻酸钠和硅藻土的浓度分别为1.5％、0.625％和0.5％， 90℃搅拌溶解，完全溶解后再慢慢冷却到30℃，得到包埋材料；
(4)除砷固载化小球的获得：将步骤(2)得到的所述菌体注入步骤(3) 得到的所述包埋材料内，再将其倒入1.5mm直径针头的注射器内，加压注射到含有2％质量百分比浓度的CaCl2的饱和硼酸溶液中，使之交联成球，静置6～ 12h，用无菌水冲洗2次后得到所述除砷固载化小球，置于冰箱中保存备用；
其中，步骤(1)、(2)所述TSB液体培养基为1×TSB培养基，配制方法为称取30g胰蛋白胨大豆肉汤，加蒸馏水溶解定容至1L，121℃灭菌20min。
本发明还提供了所述的除砷固载化小球在降低水体砷含量中的用途。
优选地，在处理废水时调整pH值接近中性。
本发明运用的包埋固定化技术，是将微生物包埋在凝胶的微小格子或微胶囊等的有限空间内，微生物被限制在该空间内不能离开，而底物和产物能自由地进出这个空间。包埋法是最常见的细胞固定化方法，其操作简单，对细胞活性影响小且制备的固定化细胞球强度高，被广泛用于废水处理研究。聚乙烯醇(PVA)是一种新型的微生物包埋固定化载体，具有机械强度高、化学稳定性好、抗微生物分解性能强、对微生物无毒、价格低廉等一系列的优点，是一种具有实用潜力的包埋材料。
因此，本发明技术方案至少具备以下有益效果：效率高、成本低、反应易控制、细胞密度高、固液分离效果好、对环境(如pH值、温度、有机溶剂、有毒物质)的耐受力强等。
附图说明
图1为本发明所用菌Pseudomonas taiwanensis显微镜(1000X)观察照片图；
图2为本发明所用菌Pseudomonas taiwanensis平板菌落形态图；
图3为进化树图；
图4为本发明所用菌Pseudomonas taiwanensis三价砷氧化曲线；
图5为污水处理中As浓度变化图。
具体实施方式
实施例1本发明所用菌Pseudomonas taiwanensis的检测
(1)形态
本发明所用菌Pseudomonas taiwanensis显微镜(1000X)观察照片见图1，平板菌落形态图见图2。
(2)16S rRNA基因序列分析
①16S rRNA基因序列
Figure RE-GDA0001716644630000031
Figure RE-GDA0001716644630000041
②16S rRNA基因测序BLAST结果
16S rRNA基因测序BLAST结果见表1。
表1本发明所用菌Pseudomonas taiwanensis 16S rRNA基因测序BLAST结果
Figure RE-GDA0001716644630000042
Figure RE-GDA0001716644630000051
Figure RE-GDA0001716644630000061
Figure RE-GDA0001716644630000071
③进化树
进化树见图3。
(3)本发明所用菌Pseudomonas taiwanensis生理生化特性
本发明所用菌Pseudomonas taiwanensis生理生化特性检测结果见表2、表3，结果为革兰氏阴性菌。
表2菌株生理生化特性–酶活、碳源氧化
Figure RE-GDA0001716644630000081
+：阳性反应；‐：阴性反应；
表3菌株生理生化特性—利用碳源产酸
Figure RE-GDA0001716644630000082
Figure RE-GDA0001716644630000091
+：阳性反应；‐：阴性反应；w：弱阳性反应
实施例2Pseudomonas taiwanensis三价砷氧化能力
取Pseudomonas taiwanensis菌液(OD600值为0.6～0.8)以1％的接种量吸取 100μL到10mL新鲜TSB培养基中，28℃摇床中震荡培养12小时备用。取10mL 新鲜TSB培养基添加NaAsO2母液，使其终浓度为10mM，接种上述扩培菌液100μL，28℃摇床中震荡培养，每隔两个小时取一次样，每次取1.5mL，用分光光度法分别测细胞密度(OD600)和五价砷浓度(OD838)。具体做法如下：一是测细胞密度(OD600)，以空白培养基为参照，直接用1mL的样测定其在波长 600nm处的吸光值。二是用砷钼蓝法(周月雯.砷钼蓝法测定三价砷和五价砷. 环境保护科学.1990，16(4)：45-47)测定五价砷浓度(OD838)。0.5mL的样 6000r离心10min，取0.3mL上清于10mL容量瓶中，再加入4mL dd H2O，0.4 mL 50％H2SO4(W/V)，0.4mL 3％钼酸铵(W/V)，0.2mL 2％抗坏血酸(W/V)。 90℃水浴中保温20min并冷却至室温，用dd H2O定容至10mL。对照空白不含 0.3mL上清。测定其在波长838nm处的吸光值，再根据标准曲线或公式计算出五价砷浓度。绘制的Pseudomonas taiwanensis的砷氧化曲线见图4。
由图4可知，Pseudomonas taiwanensis对三价砷有很强的氧化能力，在培养 8小时时氧化率最大，接近92％。
实施例3除砷固载化小球的制备
(1)Pseudomonas taiwanensis的活化：取50μL Pseudomonas taiwanensis菌液(OD600值为0.6～0.8)接种到5mL TSB液体培养基中，放置在37℃、180r/min 摇床中培养12h后，得到活化菌液Ⅰ，于4℃冰箱保藏备用。实验中均采用1×TSB 培养基，配方如下：称取30g胰蛋白胨大豆肉汤，加蒸馏水溶解定容至1L，121℃灭菌20min。
(2)Pseudomonas taiwanensis的扩培与菌体收集：以体积百分比为1％的接种量接种步骤(1)中得到的活化菌液Ⅰ到TSB液体培养基中，放置在30℃、180 r/min摇床中培养12h后，得到菌液Ⅱ，取250mL所述菌液Ⅱ，在4℃、6000r/min 的条件下离心10min，收集菌体，菌体于4℃冰箱保藏备用。
(3)包埋材料的制备：将载体材料聚乙烯醇(PVA)、海藻酸钠、硅藻土按表4配比，采用正交试验设计实验组别(表5)配制，各配制100mL，在90℃左右边搅拌边溶解，直至完全溶解后再慢慢冷却到30℃。
表4不同配比
Figure RE-GDA0001716644630000101
Figure RE-GDA0001716644630000111
表5正交试验组别
Figure RE-GDA0001716644630000112
(4)除砷固载化小球的获得：向步骤(3)得到的每组包埋材料内均注入按照步骤(2)的方法收集到的菌体，再将其倒入1.5mm直径针头的注射器内，加压注射到含有2％质量百分比浓度CaCl2的120mL饱和硼酸溶液中，使之交联成球，静置过夜，用无菌水冲洗2次后得到所述除砷固载化小球，置于冰箱中保存备用。
实施例4除砷固载化小球模拟除废水中砷以及包埋材料的最适选择
将实施例3中按步骤(3)所述载体材料的不同配比而获得的除砷固载化小球投放到100mL、As(III)终浓度为0.0013g/mL液体培养基中，30℃，180r/min 摇床中培养，6h后取样检测。实验结果如表6：
表6正交实验结果
Figure RE-GDA0001716644630000113
Figure RE-GDA0001716644630000121
注：K表示平均值，R表示极差
由表6可知，聚乙烯醇的最佳配比为1.5g/100mL，海藻酸钠的最佳配比为 0.625g/100mL，硅藻土的最佳配比为0.25g/100mL；由极差RA>RC>RB可知，聚乙烯醇的极差最大，其次是硅藻土，海藻酸钠最小，故聚乙烯醇对As(III)氧化率影响最大，它是实验中主要因素，因此掌握好聚乙烯醇的量至关重要；表中分析结果表明当包埋固定化组合为A2B2C2时，总砷浓度最低。因此实验得出制备除砷固载化小球最佳载体材料配比是：PVA1.5g/100mL、海藻酸钠0.625g/100mL、硅藻土0.5g/100mL(A2B2C2)。
实施例5最佳载体材料配比制备除砷固载化小球模拟除废水中砷
按照实施例3的方法，其中载体材料采用最佳配比A2B2C2即PVA1.5g/100mL、海藻酸钠0.625g/100mL、硅藻土0.5g/100mL制备除砷固载化小球，投放到100mL、 As(III)终浓度为0.0013g/mL液体培养基中，30℃，180r/min摇床中培养，6h 后取样检测。实验同时设置同等条件下未包埋的游离Pseudomonas taiwanensis 做对照，结果如表7：
表7模拟除废水As结果
Figure RE-GDA0001716644630000122
Figure RE-GDA0001716644630000131
由表7可知，固载化小球与未包埋的游离细胞相比，固载化小球在模拟含砷废水中除砷能力较强。在检测废水中游离砷(水溶性砷)含量时，经固载化小球处理后的废水中游离砷较未包埋的游离细胞处理后的废水中游离砷较少，是由于Pseudomonas taiwanensis将三价砷转化为五价砷，五价砷带负电荷被吸附沉降下来，因此溶液中游离砷浓度降低，达到良好的除砷效果。
实施例6除砷固载化小球除污水中砷
按照实施例3的方法，载体材料为PVA1.5g/100mL、海藻酸钠0.625g/100mL、硅藻土0.5g/100mL，制备除砷固载化小球，投放到某污水处理厂取样得到250mL 含砷污水中，0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h分别取样检测。实验同时设置同等条件下未包埋的游离Pseudomonastaiwanensis做对照，同时调整废水pH接近中性另做一组对照，结果如图5。
由图5可知，除砷固载化小球与未包埋的游离细胞相比，除砷固载化小球在含砷废水中(pH 7.05)去除砷的能力最强。由于Pseudomonas taiwanensis生长的最适pH为7，因此在处理废水时调整pH接近中性，能达到最好的除砷效果。
序列表
<110> 湖北师范大学
<120> 一种除砷固载化小球及其用途
<141> 2018-06-12
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1432
<212> DNA
<213> 台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)
<400> 1
tggcggcagc tacacatgca gtcgagcgga tgacgggagc ttgctccttg attcagcggc 60
ggacgggtga gtaatgccta ggaatctgcc tggtagtggg ggacaacgtt tcgaaaggaa 120
cgctaatacc gcatacgtcc tacgggagaa agcaggggac cttcgggcct tgcgctatca 180
gatgagccta ggtcggatta gctagttggt ggggtaatgg ctcaccaagg cgacgatccg 240
taactggtct gagaggatga tcagtcacac tggaactgag acacggtcca gactcctacg 300
ggaggcagca gtggggaata ttggacaatg ggcgaaagcc tgatccagcc atgccgcgtg 360
tgtgaagaag gtcttcggat tgtaaagcac tttaagttgg gaggaagggc agtaagttaa 420
taccttgctg ttttgacgtt accgacagaa taagcaccgg ctaactctgt gccagcagcc 480
gcggtaatac agagggtgca agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc gcgcgtaggt 540
ggtttgttaa gttggatgtg aaagccccgg gctcaacctg ggaactgcat ccaaaactgg 600
caagctagag tacggtagag ggtggtggaa ttttctgtgt agcggtgaaa tgcgtagata 660
taggaaggaa caccagtggc gaaggcgacc acttggactg atactgacac tgaggtgcga 720
aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgtcaac 780
tagccgttgg aatccttgag attttagtgg cgcagctaac gcattaagtt gaccgcctgg 840
ggagtacggc cgcaaggtta aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 900
gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggccttgaca tgcagagaac 960
tttccagaga tggattggtg ccttcgggaa ctctgacaca ggtgctgcat ggctgtcgtc 1020
agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgtaacgag cgcaaccctt gtccttagtt 1080
accagcacgt tatggtgggc actctaagga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg 1140
ggatgacgtc aagtcatcat ggcccttacg gcctgggcta cacacgtgct acaatggtcg 1200
gtacagaggg ttgccaagcc gcgaggtgga gctaatctca caaaaccgat cgtagtccgg 1260
atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagt cggaatcgct agtaatcgcg aatcagaatg 1320
tcgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt 1380
gcaccagaag tagctagtct aaccttcggg aggacggtac cacggtgatc gt 1432

Claims (2)

1.一种除砷固载化小球，其特征在于制备方法包括如下步骤：
（1）台湾假单胞菌（Pseudomonas taiwanensis，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No: M 2016700）的活化：取50 μL Pseudomonas taiwanensis菌液，OD600值为0.6~0.8，接种到5 mL TSB液体培养基中，放置在37℃、180 r/min摇床中培养12 h后，得到活化菌液Ⅰ，于4℃冰箱保藏备用；
（2）Pseudomonas taiwanensis的扩培与菌体收集：以体积百分比为1%的接种量接种步骤（1）中得到的活化菌液Ⅰ到TSB液体培养基中，放置在30℃、180 r/min摇床中培养12 h后，得到菌液Ⅱ，在4℃、6000 r/min的条件下离心10 min，收集菌体，菌体于4℃冰箱保藏备用；
（3）包埋材料的制备：向蒸馏水中加入载体材料PVA、海藻酸钠和硅藻土，按照质量体积比，PVA、海藻酸钠和硅藻土的浓度分别为1.5g/100mL、0.625 g/100mL和0.5 g/100mL，90℃搅拌溶解，完全溶解后再慢慢冷却到30℃，得到包埋材料；
（4）除砷固载化小球的获得：将步骤（2）得到的所述菌体注入步骤（3）得到的所述包埋材料内，再将其倒入1.5 mm直径针头的注射器内，加压注射到含有2% 质量百分比浓度的CaCl2的饱和硼酸溶液中，使之交联成球，静置6～12h，用无菌水冲洗2次后得到所述除砷固载化小球，置于冰箱中保存备用；
其中，步骤（1）、（2）所述TSB液体培养基为1×TSB培养基，配制方法为称取30 g胰蛋白胨大豆肉汤，加蒸馏水溶解定容至1 L，121℃灭菌20 min。
2.如权利要求1所述的除砷固载化小球在降低水体砷含量中的用途，其特征在于：在处理废水时将废水调整pH值接近中性。
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