CN105154365A

CN105154365A - 分枝杆菌yc-rl4及其应用

Info

Publication number: CN105154365A
Application number: CN201510601716.1A
Authority: CN
Inventors: 闫艳春; 任磊; 贾阳; 王俊欢
Original assignee: Graduate School of CAAS
Current assignee: Graduate School of CAAS
Priority date: 2015-09-18
Filing date: 2015-09-18
Publication date: 2015-12-16
Anticipated expiration: 2035-09-18
Also published as: CN105154365B

Abstract

本发明提供一种能够降解多种邻苯二甲酸酯类物质的分枝杆菌(Mycobacterium？sp.)YC-RL4，其保藏编号为CGMCC？No.10993。该菌能够在5天内将无机盐培养基中含有的100mg/L邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)100％降解。另外，该菌对于盐离子浓度、pH和温度具有较宽的耐受范围。本发明的分枝杆菌株YC-RL4能够应用于邻苯二甲酸酯类物质环境污染的生物修复，同时对于上述污染物的高盐高碱工业生产废水处理具有良好的应用潜质，具有较好的经济价值和应用前景。

Description

分枝杆菌YC-RL4及其应用

技术领域

本发明涉及微生物学及生物降解领域，具体地说，涉及分枝杆菌YC-RL4及其应用。

背景技术

邻苯二甲酸酯(PhthalateAcidEsters，简称PAEs)，又称酞酸酯，是邻苯二甲酸形成的酯类统称。邻苯二甲酸酯主要用于制备聚氯乙烯材料，起到增塑剂的作用。作为增塑剂，PAEs在塑料制品中的含量占20％～30％左右，甚至高达50％。自上世纪50年代聚氯乙烯(PVC)面世以来，PAEs就得到大规模的生产。目前，它占据全球增塑剂市场80％份额以上。除了作为增塑剂外，PAEs还广泛用于油漆、粘合剂、驱虫剂、化妆品、香料和润滑剂的生产原料。在德国，每年PAEs的消耗达到四十万吨，全球每年PAEs的使用量在820万吨以上，其中1％以上通过渗漏进入环境。目前，PAEs在全球主要工业国的生态环境中已普遍检出。PAEs已成为全球最常见的污染物之一。因此，如何实现对环境中邻苯二甲酸酯类污染物的高效降解，成为亟待解决的问题。

邻苯二甲酸酯共有30多种，大多是无色透明的油状液体,一般难溶于水,易溶于有机溶剂,属中等极性物质,可通过呼吸、饮食和皮肤接触进入人和动物体内。邻苯二甲酸酯对人体健康的影响是一个慢性的过程,需要较长的时间才会出现,而且可能通过胎盘和授乳产生跨代影响,所以目前主要通过动物实验对其毒性进行研究。动物实验表明,邻苯二甲酸酯急性毒性不大,对Ames试验(污染物致突变性检测)呈阴性反应,但在大剂量情况下,对动物有致畸、致癌和致突变作用。其亚急性毒性主要表现为损害肝、肾、睾丸,抑制精子形成,影响生殖机能等。邻苯二甲酸酯含有较弱的雌性荷尔蒙活性成分。近来的研究指出，PAEs主要的危害在于环境激素作用，可在极低的浓度下干扰人和动物的内分泌系统。其对内分泌系统的扰乱是通过雌激素受体(Estrogenreceptor)介导的反应，通过与雌激素受体结合，作用于DNA中雌激素反应元件(Estrogenrespoponsiveelement)激活基因的转录，产生雌激素效应。动物实验表明，作为内分泌干扰物，PAEs的生化效应表现为过氧化酶体增生、足细胞毒性、肝脏促进作用、抗雄激素、体外雌激素活性等。对动物生殖方面的扰乱主要是使精囊萎缩、精子数量减少以至于精子形成中止、生殖能力下降、后代数量减少、体重下降、子宫粘膜组织增生等。具有环境激素作用的邻苯二甲酸酯类物质有十几种，其中邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丙酯(Dipropylphtalate，DPP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二辛酯(DioctylPhthalate，DOP)和邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(DEHP)属于美国环保局认定的优先污染物。

PAEs在环境中的水解、光解的速率十分缓慢，微生物降解是其矿化的主要途径。近年来，PAEs的细菌降解已经得到广泛的研究，大量高效降解PAEs的菌株已经从各类环境中分离得到。同时，细菌对PAEs的代谢途径和邻苯二甲酸降解的遗传机制也得到深入的研究。但是对其降解的遗传机制的研究主要集中在对参与从邻苯二甲酸到原儿茶酚降解的酶基因进行克隆和鉴定，尚未深入到蛋白方面的研究。而且目前缺少在实际环境中应用的报道，例如工业废水的环境条件比较苛刻，高盐，极端pH，污染物种类丰富等，这些都对微生物的耐受性提出了更高的要求。因此，寻找在高盐浓度下依然保持对多种邻苯二甲酸酯类污染物的降解能力的菌株对于治理环境污染具有重要的经济价值和现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株降解底物谱广的分枝杆菌YC-RL4及其在邻苯二甲酸酯类物质降解中的应用。

为了实现本发明目的，本发明从山东省菏泽市东明县油田附近土壤中分离到一株能够降解邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)等多种邻苯二甲酸酯的细菌。该菌可将无机盐离子培养基中各100mg/L的DEHP、DCHP、DBP、DEP和DMP完全降解，对菌株进行连续转接测定降解能力，表明该菌降解能力稳定。该菌对于盐离子浓度、pH和温度具有较宽的耐受范围，能在NaCl浓度为0～80g/L的无机盐离子培养基中含有的100mg/L的DEHP在5天内100％降解；在pH6～9的范围内能够高效降解DEHP，当pH7.0时，对无机盐离子培养基中100mg/L的DEHP在5天内的降解率为100％，能在20～40℃温度范围内高效降解DEHP，30℃条件下，5天内可完全降解无机盐离子培养基中100mg/L的DEHP。当NaCl浓度大于100g/L，或温度高于40℃，或pH大于11或小于6时，DEHP降解被显著抑制。

在电镜下观察(图1)，该菌为杆状，无鞭毛，无芽孢。菌落呈圆形，边缘光滑，表面突起，产生黄色素(图2)。基于形态特征、16SrDNA序列和Biolog结果(图3)，将该菌株鉴定为分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)，命名为YC-RL4。该菌株于2015年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.10993，分类名为分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)。

本发明还提供含有所述分枝杆菌YC-RL4的菌剂。

本发明还提供由所述分枝杆菌YC-RL4或所述菌剂制备的生物清洁剂。

本发明还提供所述分枝杆菌YC-RL4、所述菌剂或所述生物清洁剂在有机污染物生物降解中的应用。

其中，所述有机污染物为邻苯二甲酸酯类物质。所述邻苯二甲酸酯类物质包括邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯等。

本发明还提供所述分枝杆菌YC-RL4、所述菌剂或所述生物清洁剂在邻苯二甲酸酯类环境污染的生物修复中的应用。

所述邻苯二甲酸酯类包括但不限于邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯等。

本发明进一步提供所述分枝杆菌YC-RL4在制备邻苯二甲酸酯类物质的生物降解剂中的应用。

本发明的分枝杆菌YC-RL4在模拟废水处理中，可将无机盐离子培养基(含50g/LNaCl)中同时含有的DEHP、DCHP、DMP、DBP和DEP高效降解，7天内降解率均在90％以上。

本发明提供的分枝杆菌YC-RL4及其菌剂在使用过程中无污染，无公害，能够应用于多种邻苯二甲酸酯类环境污染的生物修复及具有较高盐浓度邻苯二甲酸酯生产废水的处理，可在较低和较高温度下进行生物修复，可广泛应用于环境土壤清洁领域及工业废水的清洁处理，具有较好的经济价值和应用前景。

附图说明

图1为本发明分枝杆菌YC-RL4在电镜下的形态结构图。

图2为本发明分枝杆菌YC-RL4在LB固体培养基上的菌落形态。

图3为本发明分枝杆菌YC-RL4的16SrRNA基因系统发育树图。

图4为本发明实施例2中HPLC法检测分枝杆菌YC-RL4对浓度分别为100mg/L的DEHP、DCHP、DBP、DMP和DEP的降解能力。

图5为本发明实施例2中DEHP、DCHP、DBP、DMP和DEP浓度与315nm处吸收峰面积关系标准曲线图。

图6为本发明实施例2中分枝杆菌YC-RL4在不同pH的无机盐离子培养基中对100mg/LDEHP的降解率。

图7为本发明实施例2中分枝杆菌YC-RL4在不同温度条件下，在无机盐离子培养基中对100mg/LDEHP的降解率。

图8为本发明实施例2中分枝杆菌YC-RL4在不同盐浓度的无机盐离子培养基中对100mg/LDEHP的降解率。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明使用的无机盐培养基组成如下：1.0g/LNH₄NO₃，0.5g/LNaCl，0.5g/L(NH₄)₂SO₄，0.5g/LKH₂PO₄，1.5g/LK₂HPO₄和0.005g/L酵母提取物，pH＝7.0±0.2。

斜面培养基组成如下：10.0g/L蛋白胨，5.0g/LNaCl，10.0g/L酵母提取物，pH＝7.0±0.2。

平板固体培养基为相应的培养基中加入1.5％的琼脂。

实施例1分枝杆菌YC-RL4的分离和鉴定

1、菌株的分离

从山东省菏泽市东明县受石油污染物的农田土壤中采集活性污泥样品。在无菌操作条件下，将5g活性污泥样品接种到含100mg/LDEHP的20mL无机盐离子培养基中，在30℃，180rpm条件下培养。每培养7天后，取1mL转接至新鲜无机盐培养基中，连续转接3次。

将驯化后的菌液划线到含有100mg/LDEHP的无机盐培养基平板上，30℃培养箱中培养3天。挑取在平板上的单菌落转接到含浓度为100mg/LDEHP的无机盐培中培养7天。重复3次，直至分离获得纯化的菌株，将菌株命名为YC-RL4。

2、菌株的形态学特征

该菌为革兰氏染色阳性杆菌，菌体直或微弯、无鞭毛，无芽孢(图1)；在LB培养基上菌落为黄色，湿软，圆形凸起，边缘规整，不透明，表面光滑(图2)。

3、16SrDNA鉴定

将菌株YC-RL4接种到LB培养基中，30℃、180rpm条件下培养3天，取1mL菌液，离心收集菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，得到的基因DNA用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，-20℃保存备用。

设计用于扩增16SrDNA序列的一对通用引物：27F5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。用菌株YC-RL4的基因组DNA作为模板，加入PremixTaq^TM，进行PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA纯化回收试剂盒纯化，连接到pGM-T载体上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布到含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，在37℃下培养12h，挑取白色菌落至液体LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，送上海生工生物公司进行测序。将测序结果(GenBank：KR819399)在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行Blast比对分析，并利用MEGA软件(版本:6.0)构建系统发育树(图3)。可见，菌株YC-RL4为分枝杆菌，与目前已发表的分枝杆菌16SrDNA序列具有较高相似性。

4、Biolog鉴定

将菌株YC-RL4接种到LB培养基平板上中，30℃条件下倒置培养5天，挑单菌落到BiologA液中，使液体的透光率由100％降至95％，然后按照每孔100μL将A液加入Biolog培养板中，30℃培养39h，用Biolog微生物鉴定仪进行检测分析，结果显示YC-RL4为分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)。

综合菌体形态、16SrDNA基因序列以及Biolog结果，菌株YC-RL4被鉴定分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)。

实施例2分枝杆菌YC-RL4的降解性能试验

1、分枝杆菌YC-RL4对邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(DEHP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)的降解

气相色谱法(HPLC)检测分枝杆菌YC-RL4分别对无机盐培养基中DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP的降解作用。

将菌株YC-RL4接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到分别含DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP各100mg/L底物的无机盐培养基中，作为处理组；以未接种菌株的含DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP各100mg/L底物的无机盐培养基作为对照组，对照组与处理组各设三个重复。将对照组与处理组在30℃条件下，180rpm摇床振荡避光培养，培5天停止培养并测定每种物质的浓度。

向取得的样品中加入等体积正己烷，超声波充分振荡抽提10min，静置1小时，取上层有机溶剂，将有机溶剂挥发干后，用等体积的甲醇重溶，然后用0.22μm的有机系滤膜过滤，进行HPLC分析。

HPLC分析条件为：Agilent1200高效液相色谱仪，色谱柱：Eclipse-C18(150mm×4.6mm×5μm)，流动相为甲醇:乙腈:水＝45:40:15(v/v)，进样量2μL，流速1.0mL/min，使用DAD检测器进行检测，检测波长为315nm，DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP的保留时间分别为3.463min、7.232min、27.163min、22.194min和15.375min(图4)。利用DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP的标准品绘制浓度与315nm处吸收峰面积之间的标准曲线(图5)。

降解率的计算：根据不同底物的标准曲线计算每种底物每天在无机盐培养基中的残留浓度，再根据降解率计算公式得到菌株YC-RL4对底物的降解率(表1)。

降解率％＝(对照组中底物的终浓度-处理组中底物的终浓度)/对照组中底物的终浓度×100％

自然降解率％＝(底物初始浓度-对照组中底物浓度)/底物初始浓度×100％

表1菌株YC-RL4对各种底物的降解率与底物的自然降解率

2、分枝杆菌YC-RL4对pH耐受能力

分别配制不同pH值(5、6、7、8、9、10、11、12)的无机盐离子培养基，灭菌备用。向配制的无机盐离子培养基中分别加入DEHP至底物浓度100mg/L。将菌株YC-RL4接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到上述培养基中，作为处理组，30℃，180rpm摇床振荡避光培养。

以未接种菌株不同pH的同时加入DEHP至浓度为100mg/L的相同培养基作为对照组，同样在30℃，180rpm摇床振荡避光培养，培养5天后测定溶液中DEHP浓度并计算降解率。

图6为5天内不同pH条件下分枝杆菌YC-RL4对DEHP降解率。当pH值从5.0增加到7.0，DEHP的降解率逐渐由36％增加到最高值100％。在pH值由7.0逐渐升高到11.0时，YC-RL4对DEHP的降解效率逐渐由100％降低。当pH值大于11时，YC-RL4对DEHP的降解率显著降低，pH＝12时降解率降至8.7％。

3、分枝杆菌YC-RL4对温度耐受能力

将菌株YC-RL4接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种无机盐离子培养基(DEHP浓度为100mg/L)中，分别在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃条件下，180rpm摇床振荡避光培养。

以未接种菌株的含100mg/LDEHP的相同无机盐离子培养基作为对照组，同样在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃条件下，180rpm摇床振荡避光培养5天后测定溶液中DEHP浓度并计算降解率。

图7为5天内分枝杆菌YC-RL4在不同温度条件下对DEHP的降解率。10℃时，降解率为48.3％；随着温度升高至30℃，DEHP降解率能达到最大值100％；当温度超过30℃后，降解率逐渐下降，40℃时为72.7％，当温度为50℃时，降解率仅为5.9％。

4、分枝杆菌YC-RL4对盐浓度耐受能力

分别配制不同NaCl浓度(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110和120g/L)的无机盐离子培养基，灭菌备用。向配制的无机盐离子培养基中分别加入DEHP至底物浓度100mg/L。将菌株YC-RL4接种到液体LB培养基中活化，培养到对数生长期OD₆₀₀＝0.8，按照体积比10％的接种量接种到上述培养基中，作为处理组，30℃，180rpm摇床振荡避光培养。

以未接种菌株的含不同NaCl浓度同时加入DEHP至浓度为100mg/L的相同无机盐离子培养基作为对照组，同样于30℃，180rpm摇床振荡避光培养5天后测定溶液中DEHP浓度，并计算降解率。

图8为5天内不同盐浓度条件下分枝杆菌YC-RL4对DEHP的降解率。NaCl浓度在10～80g/L之间时，DEHP的降解率均为100％，当盐浓度大于80g/L时，DEHP降解率逐渐降低，当盐浓度达到120g/L时，DEHP的降解被完全抑制。

实施例3分枝杆菌YC-RL4对含多种邻苯二甲酸酯废水处理中的应用

本实施例中使用含50g/LNaCl的无机盐离子培养基(未灭菌)作为模拟废水(以下简称“废水”)，利用5.0L的发酵罐(BioFlo115，NewBrunswickScientificCo.,NJ,USA)进行模拟废水处理。将分枝杆菌YC-RL4在LB液体培养基中培养至对数期(OD₆₀₀＝0.8，菌体浓度约为1.6×10⁸CFU/mL)，向废水中加入制备的菌液至终浓度分别为8×10⁷CFU/L、1.6×10⁸CFU/L、3.2×10⁸CFU/L、4.8×10⁸CFU/L、6.4×10⁸CFU/L和8.0×10⁸CFU/L废水(每个处理为2L废水)，并向废水中同时加入DEHP、DCHP、DMP、DEP和DBP至各浓度为100mg/L，作为处理组；同时，以相同条件下加入相同浓度污染物底物且不接菌的废水作为对照组。搅拌转速为150rpm，通气比为0.8(空气)，培养温度为30℃。反应液pH值和溶氧量(DO)通过反应器的操作系统监测。在处理的第7天取样测定各种底物的浓度。对照组与处理组均进行3次重复。

取样方法：每次处理结束后，向发酵罐中加入2L正己烷，利用发酵罐的马达进行搅拌，1小时后静置30分钟(整个过程中关闭发酵罐所有管路)，取20mL上层有机相用于各底物浓度检测。根据最终测定处理组与对照组中底物的浓度计算菌株YC-RL4对废水中各底物的降解率。

分枝杆菌YC-RL4对废水中各底物的降解率如表2所示，随着加入菌体量的增加各种底物的降解率逐渐提高，当接菌量达到6.4×10⁸CFU/L废水时，各底物的降解率基本达到最大值。

表2分枝杆菌菌YC-RL4对废水中各底物的降解率

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)YC-RL4，其保藏编号为CGMCCNo.10993。

2.含有权利要求1所述分枝杆菌YC-RL4的菌剂。

3.由权利要求1所述分枝杆菌YC-RL4或权利要求2所述菌剂制备的生物清洁剂。

4.权利要求1所述分枝杆菌YC-RL4、权利要求2所述菌剂或权利要求3所述生物清洁剂在有机污染物生物降解中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述有机污染物为邻苯二甲酸酯类物质。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯类物质包括邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯。

7.权利要求1所述分枝杆菌YC-RL4、权利要求2所述菌剂或权利要求3所述生物清洁剂在邻苯二甲酸酯类环境污染的生物修复中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯类包括邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯。

9.权利要求1所述分枝杆菌YC-RL4在制备邻苯二甲酸酯类物质的生物降解剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯类物质包括邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯。