CN103333835B - 一株降解除草剂杂草焚的细菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株降解除草剂杂草焚的细菌及其用途。该降解杂草焚的细菌是肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.7774。本发明提供的肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643CGMCC No.7774在无机盐培养基中7d对25mg/L杂草焚的降解率达到63.47%，这表明该菌株能够高效降解杂草焚，在修复土壤杂草焚污染方面具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株降解除草剂杂草焚的细菌及其用途。
背景技术
杂草焚，又名三氟羧草醚，英文名称acifluorfen，化学名称5-（2-氯-α，α，α-三氟对甲苯氧基）2-硝基苯甲酸，结构如式1所示：
杂草焚是二苯醚类除草剂，属接触性除草剂，是原卟啉氧化酶抑制剂。通常采用25%水剂进行大豆苗前表土处理及苗后经叶喷雾，可有效防除大豆田阔叶杂草如苍耳、苘麻、龙葵、苋、藜、蓼、牵牛、豚草、曼陀罗、马齿苋、铁苋菜、鬼针草、鼬瓣花、鸭跖草等，苗后早期处理也可防除包括狗尾草在内的一年生禾本科杂草。喷药后，大豆会不同程度受害，表现为叶片黄化、皱缩、褐变等，但6～7d后恢复正常。
由于劳动力成本的提高，农业生产越来越依赖除草剂。除草剂的大量使用极大地节约了劳动力成本，提高了农业生产效率，但也带来了一些农业生产和环境污染等生态问题。杂草焚半衰期较短，通常被认为是一种低毒的环境友好型农药，但近年来频繁、过量或使用不当，对农田土壤和地下水等造成了不同程度的污染，对后茬作物的危害也越来越严重。研究表明，杂草焚在土壤中可以残留数月，在地下水、地表水中可以残留数年，对土壤微生物有抑制作用，对鱼类有较强的毒性，对环境污染很大。
自然界的除草剂残留的降解主要靠土壤中微生物来完成，但自然降解十分缓慢。因此，有针对性地筛选高效微生物菌株，研制微生物修复剂，通过人工接种加速土壤长残留除草剂的降解消除农田除草剂残留药害是一项十分必要的工作和切实可行的途径。
发明内容
本发明的目的是提供一株可以高效降解除草剂杂草焚的细菌。
本发明所提供的细菌是肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643，该菌株已于2013年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.7774。
本发明的另一个目的是提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为所述的肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643CGMCC No.7774。
所述菌剂为下述1）或2）所述菌剂：
1）用于降解除草剂杂草焚的菌剂；
2）用于修复土壤除草剂杂草焚污染的菌剂。
所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂（如吐温20、吐温80等）、粘合剂、稳定剂（如抗氧化剂）、pH调节剂等。
所述的肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643CGMCC No.7774或以肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643CGMCC No.7774为活性成分的菌剂在降解杂草焚中的应用也属于本发明的保护范围。
所述的肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643CGMCC No.7774或以肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643CGMCC No.7774为活性成分的菌剂在修复土壤杂草焚污染中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的再一个目的是提供一种培养肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643CGMCCNo.7774的方法，该方法包括将肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643CGMCC No.7774在用于培养肠杆菌的培养基中培养的步骤。
本发明的又一个目的是提供一种以肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643CGMCCNo.7774为活性成分的菌剂的制备方法，包括如下步骤：将所述的肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643CGMCC No.7774作为活性成分，得到所述菌剂。
本发明是从长期受到除草剂杂草焚污染的农田采集土样，并从中分离、筛选得到的杂草焚降解菌肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643CGMCC No.7774。实验证明，该菌株在无机盐培养基中7天对25mg/L杂草焚的降解率达到63.47%。这表明，该菌株能高效降解杂草焚，在修复土壤除草剂杂草焚污染方面具有广阔的应用前景。
保藏说明
菌种名称：肠杆菌
拉丁名：(Enterobacter sp.)
菌株编号：ZCF1643
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2013年6月20日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.7774
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的培养基如下：
富集培养液：K2HPO47g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，MnSO40.05g/L，FeSO40.05g/L，CaC120.003g/L，葡萄糖5g/L，用蒸馏水定容至1L，pH7.0；（杂草焚用量按照下文实施例1添加）。
分离培养基：向富集培养液中加琼脂至其质量浓度为2％。
无机盐液体培养基：NH4Cl1.0g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO41.5g/L，MgSO40.2g/L，NaCl0.5g/L，用蒸馏水定容至1L，pH7.0。
无机盐固体培养基：向无机盐液体培养基中加琼脂至其质量浓度为2％。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，琼脂20g/L，用蒸馏水定容至1L，pH7.2。
实施例1、肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643CGMCC No.7774的分离与鉴定
一、杂草焚降解菌ZCF1643的分离
在100mL含杂草焚200mg/L的富集培养液中加入10g土壤样品（采自中国陕西省受到除草剂杂草焚污染的农田），28℃、200r/min振荡培养7d富集杂草焚降解菌。第一轮富集结束后，吸取10ml富集液转移至含杂草焚400mg/L的100ml富集培养液中，继续培养7d进行第二轮富集。如此连续富集、培养5次，杂草焚浓度依次为200、400、600、800和1000mg/L。完成富集后，取富集液均匀涂布在含杂草焚1000mg/L的无机盐培养基上，28℃恒温培养3d，待平板上出现单菌落后，挑取较大单菌落转接至牛肉膏蛋白胨培养基上，4℃保存备用。
经过大量的富集培养，分离到能够在含杂草焚1000mg/L的无机盐固体培养基平板上生长的菌株30余株。进一步筛选后，获得一个编号为ZCF1643的菌株，命名为杂草焚降解菌ZCF1643，该菌株能够将初始浓度25mg/L的杂草焚在7d内降解63.47%。
二、杂草焚降解菌ZCF1643的鉴定
从以下几个方面鉴定步骤一分离并纯化得到的杂草焚降解菌ZCF1643：
1、形态学鉴定
将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的杂草焚降解菌ZCF1643进行单菌落状态观察，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态（是否平坦、突起、褶皱、凹陷等）、菌落边缘状态（是否整齐、不规则、放射状等）。
对于处于对数生长期的所述杂草焚降解菌ZCF1643，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
结果表明，上述步骤一分离并纯化得到的杂草焚降解菌ZCF1643菌落圆形凸起、乳白色、表面光滑、边缘整齐；菌体短杆状，革兰氏染色阴性。
2、生理生化特征分析
参考《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2011.）和《微生物学实验》（沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验(第三版).北京:高等教育出版社,1999.）测定上述杂草焚降解菌ZCF1643的生理生化特征。
所述杂草焚降解菌ZCF1643的生理生化特征测定结果如表1所示：
表1杂草焚降解菌ZCF1643的生理生化特征
注：“＋”表示阳性，“－”表示阴性。
3、16s rDNA序列同源性分析
常规方法培养上述步骤一分离纯化得到的杂草焚降解菌ZCF1643，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌16s rDNA通用引物，27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR反应。反应体系采用上海生物工程有限公司PCR扩增试剂盒。反应程序为：95℃变性30s、55℃退火1min、72℃延伸2min，共30个循环。DNA测序由北京三博远志生物技术公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAStar软件完成，基因比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）和EzTaxon在线完成。
PCR基因扩增得到杂草焚降解菌ZCF1643的16S rDNA基因片段约1.4kb，测定序列后与NCBI和EzTaxon数据库中已公开的16S rDNA序列进行在线同源性比对，结果显示杂草焚降解菌ZCF1643与霍氏肠杆菌Enterobacter hormaechei ATCC49162T（GenBank登录号AFHR01000079）的同源性最高，达到99.288%。
杂草焚降解菌ZCF1643的16s rDNA序列详见序列表中序列1。
4、生长特性分析
进行了杂草焚降解菌ZCF1643的最适温度和最适pH生长实验。采用无机盐液体培养基，分别在4℃、28℃、37℃、60℃培养、观察、记录菌株的温度适应性，每个处理3次重复。调整pH分别为4、5、6、7、8、9、10，每个处理3次重复，培养、观察、记录菌株生长的最适pH。
结果表明，所述杂草焚降解菌ZCF1643的最适生长温度为28℃，最适生长pH为pH7～8。
鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤一分离纯化得到的杂草焚降解菌ZCF1643鉴定为变型细菌γ亚群肠杆菌科（Enterobacteriaceae）肠杆菌属(Enterobacter sp.)。该杂草焚降解菌ZCF1643已于2013年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.7774。
实施例2、肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643CGMCC No.7774降解杂草焚能力定量测定
一、杂草焚测定标准曲线制作
准确称取杂草焚标准品（购自Fluka公司）10.0mg于10mL容量瓶中，用少量甲醇溶解，将容量瓶放在超声波浴槽中振荡10min，然后用甲醇定容至10mL，摇匀，配成1000mg/L杂草焚母液。配制10、20、40、60、80mg/L系列标准溶液。采用高效液相色谱（HPLC）测定不同浓度杂草焚标准品的峰面积，3次重复。以杂草焚浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制杂草焚标准曲线。
检测条件如下：
检测系统：Agilent1100Series。色谱柱：C18DiamosilTM反相柱，250mm×4.6mm，粒径5μm。色谱条件：流动相：乙腈：水（冰乙酸调pH3.0）=70:30（v/v）；检测波长，254nm；流速，0.8mL/min；进样体积，10μL；柱温30℃。
测定结果如表2所示：
表2不同浓度杂草焚HPLC测定峰面积
根据表2数据，得到杂草焚测定标准曲线：y=7.319x+2.130（R2=0.987）。其中，y为峰面积，x为杂草焚浓度。
二、肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643CGMCC No.7774降解杂草焚能力定量测定
在试管中准确加入5mL含杂草焚约25mg/L的无机盐培养基（向无机盐液体培养基中加入杂草焚使杂草焚的浓度为约25mg/L得到的培养基），再加入0.2ml的OD600nm值为1.0的肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643CGMCC No.7774菌液（1×109cfu/ml），28℃、200r/min培养7天，取4mL降解液至50mL离心管中，加入4mL乙腈，振荡2min，静置10min，加入少许无水硫酸钠。准确吸取800μL有机相转移至1.5mL EP离心管中，在氮吹仪上吹干，加入400μL甲醇（色谱级），在超声波作用下使乙草胺完全溶解，用液谱过滤器过滤收集至样品瓶中，按照上述HPLC法测定杂草焚。同时，以没有接种肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643CGMCC No.7774的上述含杂草焚约25mg/L的无机盐培养基作为空白对照，按照上述方法测定杂草焚的浓度。杂草焚降解率：X=(1-A/B)×100%，式中X为降解率(%)，A为接菌处理液中残留的杂草焚浓度，B为未接菌空白对照处理液中残留的杂草焚浓度。
结果显示，杂草焚初始浓度为24.85mg/L，7天后所述肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643CGMCC No.7774对杂草焚的降解率达到63.47%（如表3所示）。这一结果表明，本发明所提供的肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643CGMCC No.7774可高效降解杂草焚。
表3肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643CGMCC No.7774降解杂草焚功效
序列表
Claims (7)
1.肠杆菌(Enterobacter sp.)ZCF1643，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.7774。
2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的肠杆菌ZCF1643。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为下述1)或2)所述菌剂：
1)用于降解杂草焚的菌剂；
2)用于修复土壤杂草焚污染的菌剂。
4.权利要求1所述的肠杆菌ZCF1643、或权利要求2或3所述的菌剂在降解杂草焚中的应用。
5.权利要求1所述的肠杆菌ZCF1643、或权利要求2或3所述的菌剂在修复土壤杂草焚污染中的应用。
6.培养权利要求1所述肠杆菌ZCF1643的方法，包括将所述肠杆菌ZCF1643在用于培养肠杆菌的培养基中培养的步骤。
7.权利要求2或3所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的肠杆菌ZCF1643作为活性成分，得到所述菌剂。
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