CN103820372B - 一株二氯喹啉酸高效降解菌及其用途和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明专利属于环境保护技术领域，具体涉及一株二氯喹啉酸高效降解菌及其用途。本发明二氯喹啉酸高效降解菌代号为MC-05，经鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp.，于2013年11月19日在中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No.8486；该菌可用于二氯喹啉酸污染土壤及水域的治理，有良好的降解效果。该菌在二氯喹啉酸污染的土壤和水域中有良好的定植能力，能充分的降解土壤和水中残留的二氯喹啉酸，而且不会产生二次污染等优点，对原有生态环境中的微生物无不良影响。
Description
技术领域
本发明涉及一株假单胞菌（Pseudomonas sp.）MC-05，及其在微生物降解二氯喹啉酸农药残留中的应用。
背景技术
二氯喹啉酸是德国巴斯夫公司1984年开始推广的一种激素型喹啉酸类除草剂，ISO通用名称：Quinclorac，分子式：C10H5Cl2NO2，化学名称：3，7-二氯喹琳-8-羧酸，其常见的商品名有：神锄(1代、2代)、快杀稗、杀稗灵、稗草净、克稗星和稗草王等。二氯喹琳酸对光、温等外界条件稳定，土壤中二氯喹啉酸的消失与土壤湿度呈线性关系。在田间自然状态下二氯喹啉降解缓慢，主要依靠土壤中的微生物和有关的降解酶类，李晶新等人的研究表明稻田按推荐施用量下，偏酸性土壤，经过269d后才对烟草叶宽的生长没有显著影响，经过342d后，才消除到对烟草根生长没有显著影响的范围。由于南方很多都是稻-烟轮作田块，许多稻田施用二氯喹啉酸防治稗草等多种杂草，下茬又紧接着种植烟草，由于其半衰期较长，其在土壤中的残留给烟草的生长带来严重影响。但目前对于二氯喹啉酸土壤污染问题，并没有很有效的治理和解决措施，只能通过活性炭等具有吸附活性的物质来吸附土壤中残留的二氯喹啉酸；或者在出现药害后使用芸苔素内酯等一些生物调节剂来缓解烟株的受害症状；这些方法都不能从根本上解决二氯喹啉酸的污染为题，而且还容易造成二次污染。所以探寻二氯喹啉酸污染新的高效治理方法显得十分迫切和重要。
微生物降解技术具有去除效率高、处理费用低、能从根本上解决二氯喹啉酸污染问题，且不会产生二次污染问题。但采用微生物降解技术的关键之一便是获得二氯喹啉酸的高效降解菌株。目前，国内外学者已对二氯喹啉酸微生物降解进行了大量的研究，但是由于二氯喹啉酸含有喹啉环，较稳定不易降解，且在土壤中含量较低，迄今为止分离到的降解菌还比较有限，主要包括苍白杆菌属（Ochrobactrum sp.）、Burkholderia cepecia、Alcaligenes sp.、Bordetella sp.、Pantoea sp.、Bordetella sp.等，这些分离到的菌株对低浓度下的二氯喹啉酸降解效果还有待于进一步提高。大量的研究表明从环境中分离筛选高效二氯喹啉酸降解菌，是从根本上解决二氯喹啉酸污染的重要举措。且目前国内外尚未见有关烟草节杆菌属降解二氯喹啉酸的研究报道。
发明内容
本发明目的是提供一株高效、定植能力强的具有二氯喹啉酸降解能力的假单胞菌及其用途。
本发明采用的技术方案是：
一株二氯喹啉酸降解菌假单胞菌（Pseudomonas sp.）MC-05，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国，北京，朝阳区北辰路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.8486，保藏日期：2013年11月19日。
所述二氯喹啉酸降解菌MC-05菌落特征如下：菌落呈淡黄色，圆形，凸起，边缘不整齐，表面光滑；透射电镜下观察该菌体的形态为杆状，两端均生有数根极鞭毛；革兰氏染色阴性，氧化酶甲基红试验均呈阴性，淀粉水解和吲哚试验阳性，能利用葡萄糖和乳糖。
本发明的一个方面，二氯喹啉酸降解菌假单胞菌菌MC-05在降解二氯喹啉酸中的应用。
本发明的一个方面，二氯喹啉酸降解菌假单胞菌菌MC-05在治理二氯喹啉酸污染土壤中的应用。
本发明的一个方面，一种包含二氯喹啉酸降解菌假单胞菌MC-05的菌剂，所述菌剂可以是本领域技术人员所知任何技术手段制备任何形式的菌剂，例如通过发酵培养后进行冻干获得的干菌剂，也可以是液体形式的浓缩液态菌剂。
本发明的一个方面，所述包含二氯喹啉酸降解菌假单胞菌MC-05菌剂在降解二氯喹啉酸中的应用。
本发明的一个方面，所述包含二氯喹啉酸降解菌假单胞菌MC-05菌剂在治理二氯喹啉酸污染土壤中的应用。
所述降解在25-35℃、pH 6-8下进行。
优选的，所述降解在33℃、pH=7下进行。
本发明中的假单胞菌菌MC-05是一种常见的假单胞菌，经检索专利和其他相关文献，尚未发现能够降解二氯喹啉酸的假单胞菌属菌种，且该菌种能够在低浓度下对二氯喹啉酸进行降解，并在土壤中有良好的定植能力。
附图说明
图1为本发明中假单胞菌MC-05的透射电镜照片。
图2为CK测定结果图。
图3为本发明中假单胞菌MC-05的二氯喹啉酸降解效果对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1：假单胞菌菌MC-05的分离、纯化及保存。
所述降解菌经驯化培养和筛选纯化分离得来，具体步骤如下：
驯化培养：将常年施用二氯喹啉酸的稻田土样5g加入到100mg/L的二氯喹啉酸无机盐培养基中，于28℃、150r/min摇床上振荡培养7d；然后以5%的接种量，转接到新的二氯喹啉酸无机盐培养基中，二氯喹啉酸的浓度按100mg/L的梯度增加，转接4次至二氯喹啉酸浓度达到500mg/L。
所述无机盐培养基为：每升无机盐培养基含硝酸铵4g，磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钾0.5g，三氯化铁0.01g，氯化钙0.01g，微量元素母液(EDTA- 二钠0.01g/L,氯化锰39mg/L，硫酸锌 43mg/L,钥酸钠 36mg/L) 10mL。
将最后一次的驯化培养液按浓度梯度稀释至10-9，分别于100mg/L的二氯喹啉酸无机盐培养基上涂板，于34℃培养箱中倒置培养3d，挑取长势旺盛的菌落于LB液体培养基中扩大、纯化培养。
将纯化得到的菌体一份接种于LB斜面培养基中，4℃保存；同时于甘油中保存于-20℃下。
实施例2：假单胞菌菌MC-05的鉴定。
通过16S rDNA序列分析和生理生化实验鉴定，确定菌株MC-05为假单胞菌。具体步骤如下：
采用DNA提取试剂盒（北京全式金生物技术（TransGen Biotech）有限公司）提取和纯化菌株的DNA，4℃保存。选用细菌的16s通用引物由华大基因公司合成：
上游引物为 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；
下游引物为 5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。
扩增反应体系：10XBuffer(Mg2+)2μL，dNTPs2μL，引物各1μL，菌体 DNA 1μL，Taq DNA聚合酶0.5μL,加去离子水至20μL。
PCR反应程序设定为:94°C预变性4min ;然后94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸1.5min，循环35个周期；然后72°C延伸IOmin ;最后4°C保持l0min。将PCR产物进行测序(华大基因公司)。
测序结果与Genbank数据库进行比对，发现其属于Pseudomonas sp.。图1为MC-05菌的电镜照片。
基于测序结果和生理生化试验结果,确定MC-05属于Pseudomonas sp.。因此，将该菌命名为Pseudomonas sp. MC-05,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101)，保藏日期为2013年11月19日，保藏编号为CGMCCNo.8486。
实施例3：降解菌MC-05的降解效果鉴定。
将MC-05菌接种于液体LB中于35℃、180r/min振荡培养至对数期。将5ml培养液于10000r/min离心2min，弃去上清液后用等体积的0.01PBS缓冲液重悬菌体后接种于50mg/L二氯喹啉酸无机盐培养基中，于30℃、150r/min，培养7d后用液相色谱仪进行检测菌体的降解率。降解试验设对照，三个重复。
液相色谱检测条件：色谱柱：Waters Sun FireTM-C18，5.0 μm，4.6 mm ×250 mm。流动相：甲醇/0.01%磷酸水溶液（3:1，V/V），流速0.6 mL/min进样量10 μL，柱温 30 ℃，检测波长为 240 nm。
相对降解率=（CK含量-降解菌降解后含量）/CK含量*100%
由上述公式计算出二氯喹啉酸降解菌MC-05的降解率为91.38%。
实施例4：外界环境因素对降解菌降解效果的影响。
二氯喹啉酸初始浓度对降解菌MC-05降解率的影响:分别配制10ppm、20ppm、40ppm、50ppm的二氯喹啉酸无机盐培养基各100ml于三角瓶中灭菌待用。分别向上述二氯喹啉酸无机盐中接种5%的活化好的MC-05菌悬液，于30℃、150r/min的恒温摇床上培养7d后，测定各处理的降解效率。
培养温度对降解菌MC-05降解率的影响:向灭好菌的50ppm二氯喹啉酸无机盐培养基中接种5%活化好的MC-05PBS菌悬液，分别于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下培养7d，测定各处理的降解率。
培养基pH对降解菌MC-05降解率的影响:分别配置pH=6、6.5、7、7.5、8的50ppm二氯喹啉酸无机盐培养基，接种5%的MC-05的PBS菌悬液，于30℃、150r/min的恒温摇床上培养7d，测定各处理的降解效果。
培养时间对降解菌MC-05降解效果的影响：向50ppm、pH=7的二氯喹啉酸无机盐培养基中接种5%的MC-05PBS菌悬液，于30℃、150r/min的恒温摇床上培养7d，每个24小时取一次样，测定二氯喹啉酸含量。
结果显示，二氯喹啉酸降解菌MC-05的最佳降解条件为：33°C、pH值7。二氯喹啉酸初始质量浓度在10ppm-50ppm都有较好的降解效果，降解率可达90%以上。培养到第6天时，降解菌对二氯喹啉磷酸的降解已较充分。
实施例5：二氯喹啉酸降解菌MC-05在土壤中的定植效果及对二氯喹啉酸污染土壤的修复能力评估。
以喷雾的方式配置25mg/kg的二氯喹啉酸毒土，将降解菌MC-05培养至对数期，取5ml菌液离心后去掉LB，以20mlPBS缓冲液重悬菌体，接种到配置好的二氯喹啉酸毒土中，于35℃培养箱中培养7d后，测定土壤中二氯喹啉酸的含量。试验设置3个重复和对照。
土壤样品中二氯喹啉酸含量测定方法：准确称取 20.0 g 土壤样品，置于磨口三角瓶中，加 60 mL 甲醇/0.01%磷酸水溶液（3:1，V/V），回旋式振荡器提取 1 h 后，将提取液转移至50 mL 离心管中，4000 r/min 离心 5 min，滤纸过滤，取上清液 30 mL，过 0.22 μm 滤膜，用于测定。测定条件同实施例3。
降解菌MC-05在30℃下7d的降解效果可达79.6%，在土壤中有较好的定植效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精 神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.二氯喹啉酸高效降解菌（Pseudomonas sp.）MC-05，其特征在于：经鉴定为假单胞菌，能够高效的降解土壤和水中残留的二氯喹啉酸，菌种保藏编号为：CGMCC No.8486，2013年11月19日在中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。
2.如权利要求1所述的二氯喹啉酸高效降解菌MC-05，其特征在于：所述二氯喹啉酸高效降解菌MC-05菌落特征如下：在LB培养基上呈淡黄色，圆形，凸起，边缘不整齐，表面光滑；透射电镜下观察该菌体的形态为杆状，两端均生有数根极鞭毛；革兰氏染色阴性，氧化酶甲基红试验均呈阴性，淀粉水解和吲哚试验阳性，能利用葡萄糖和乳糖。
3.如权利要求1所述的二氯喹啉酸高效降解菌MC-05在降解二氯喹啉酸中的应用。
4.如权利要求1所述的二氯喹啉酸高效降解菌MC-05在治理二氯喹啉酸污染土壤中的应用。
5.如权利要求1所述二氯喹啉酸高效降解菌MC-05，其特征在于：所述二氯喹啉酸高效降解菌在低浓度下也能充分降解土壤或水体中残留的二氯喹啉酸，降解菌的降解作用在25-35℃、pH 6-8下进行。
6.一种包含权利要求1所述二氯喹啉酸高效降解菌MC-05的菌剂。
7.如权利要求6所述一种包含权利要求1所述二氯喹啉酸高效降解菌MC-05的菌剂在降解二氯喹啉酸中的应用。
8.如权利要求6所述一种包含权利要求1所述二氯喹啉酸高效降解菌MC-05的菌剂在治理二氯喹啉酸污染土壤中的应用。
9.如权利要求6所述一种包含权利要求1所述二氯喹啉酸高效降解菌MC-05的菌剂，其特征在于：易于保存和运输，能够有效地降解土壤和水体中残留的二氯喹啉酸，降解菌剂的降解作用在25-35℃、pH 6-8下进行，降解条件为33℃、pH=7。
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