CN102260641B

CN102260641B - 一株高效降解有机污染物多菌灵的细菌及其用途

Info

Publication number: CN102260641B
Application number: CN2011101972312A
Authority: CN
Inventors: 孙建光
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-07-14
Filing date: 2011-07-14
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2031-07-14
Also published as: CN102260641A

Abstract

本发明公开了一株高效降解有机污染物多菌灵的细菌及其用途。所述降解有机污染物多菌灵的细菌是分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.5041。本发明提供的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22 CGMCC No.5041在无机盐培养基中5d对100mg/L多菌灵的降解率达到84.79％，15d对600mg/L多菌灵的降解率达到62.77％，这表明该菌株能够高效降解多菌灵，在修复土壤多菌灵污染方面具有广阔的应用前景。

Description

一株高效降解有机污染物多菌灵的细菌及其用途

技术领域

本发明涉及一株高效降解有机污染物多菌灵的细菌及其用途。

背景技术

多菌灵(carbendazim)化学名称为N-(2-苯骈咪唑基)-氨基甲酸甲酯，英文化学名称为methyl benzimidazol-2-ylcarbamate。分子式为C₉H₉N₃O₂，结构式如下所示。

多菌灵能够干扰核酸合成和细胞有丝分裂过程，对多种作物的真菌病害有防治效果，是目前农业上防治植物病害的主要杀菌剂，使用范围非常广，主要作用于水稻、花生、棉花、烟草、甜菜、以及多种蔬菜，可防治瓜类白粉病、西红柿早疫病、豆类炭疽病、疫病、油菜菌核病、大葱、韭菜灰霉病、茄子、黄瓜菌核病，瓜类、菜豆炭疽病、豌豆白粉病等，对控制花生旺长也有一定作用。但多菌灵在土壤中的残留期比较长，能引起人肝病，导致染色体畸变的作用，存在潜在的致癌、致畸、致突变作用，对哺乳动物有毒害作用，所以研究多菌灵的降解就显得尤为重要。

目前国内外对多菌灵降解菌的研究报道相对较少。如，国外，Holtman等分离到了6株革兰氏阳性的红城红球菌(Rhodococcus erythropolis)，其中5株菌15d后能降解完无机盐培养液中16mg/L的多菌灵，平均降解速率为1.07mg/(L.d)。国内，张桂山在2004年分离到的罗尔斯通氏菌(Ralstonia sp.)在无机盐培养基中24d对500mg/L多菌灵的降解率为19.16％。如能发现对多菌灵降解能力更高的菌株将会使多菌灵得到更有效的降解。

发明内容

本发明的目的是提供一株可以高效降解有机污染物多菌灵的细菌。

本发明所提供的细菌是分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22，该菌株已于2011年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.5041。

本发明的另一个目的是提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为所述的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22 CGMCC No.5041。

所述菌剂为下述1)或2)所述菌剂：

1)用于降解多菌灵的菌剂；

2)用于修复土壤多菌灵污染的菌剂。

所述的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22 CGMCC No.5041或以分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22 CGMCC No.5041为活性成分的菌剂在降解多菌灵中的应用也属于本发明的保护范围。

所述的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22 CGMCC No.5041或以分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22 CGMCC No.5041为活性成分的菌剂在修复土壤多菌灵污染中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的再一个目的是提供一种培养分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22CGMCC No.5041的方法，该方法包括将分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22 CGMCCNo.5041在用于培养分枝杆菌的培养基中培养的步骤。

本发明的又一个目的是提供一种以分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22 CGMCCNo.5041为活性成分的菌剂的制备方法，包括如下步骤：将所述的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22 CGMCC No.5041作为活性成分，得到所述菌剂。

本发明是从长期受到多菌灵污染的菜地、农田、池溏、农药厂等地点采集土样，并从中分离、筛选得到的多菌灵降解菌DJL22。实验证明，该菌株在无机盐培养基中5d对100mg/L多菌灵的降解率达到84.79％，15d对600mg/L多菌灵的降解率达到62.77％。这表明，该菌株能高效降解多菌灵，在修复土壤多菌灵污染方面具有广阔的应用前景。

保藏说明

菌种名称：分枝杆菌

拉丁名：(Mycobacterium sp.)

菌株编号：DJL22

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2011年7月6日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.5041

附图说明

图1为多菌灵测定标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

富集培养基：K₂HPO₄ 5.71g/L，KH₂PO₄ 1.70g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.63g/L，MgSO₄·7H₂O 0.095g/L，MnSO₄ 0.05g/L，FeSO₄ 0.05g/L，CaCl₂ 0.003g/L，pH值7.0。

分离培养基：富集培养基加2％琼脂。

无机盐培养基：NH₄CL 1.0g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，MgSO₄ 0.2g/L，NaCl 0.5g/L，pH7.0。

牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏5.0g/L，NaCl 5.0g/L，pH7.2。

实施例1、多菌灵降解菌DJL22的分离与鉴定

一、多菌灵降解菌DJL22的分离

在100ml多菌灵浓度为100mg/L的富集培养液中加入10g土样(采自中国北京受到多菌灵污染的农田土壤)，25℃、200r/min振荡培养3d，吸取5ml培养液转接至多菌灵浓度为200mg/L富集培养液中，培养3d，依次连续富集，转接5次，使多菌灵浓度依次为100、200、400、500、800和1000mg/L。富集完毕后，取培养液均匀涂布于相同浓度的多菌灵分离培养基和无机盐培养基上，25℃恒温培养，待平板上出现单菌落后，挑取较大单菌落转接至牛肉膏蛋白胨培养基上，25℃恒温培养，反复纯化至纯培养后备用。

结果发现，菌落在含相同浓度的多菌灵无机盐培养基上比分离培养基上长势好，选取无机盐培养基上菌落分离纯化。将分离并纯化所得到的一株细菌命名为多菌灵降解菌DJL22。

二、多菌灵降解菌DJL22的鉴定

从以下几个方面鉴定步骤一分离并纯化得到的多菌灵降解菌DJL22：

1、形态学鉴定

将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的多菌灵降解菌DJL22进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。

对于处于对数生长期的所述多菌灵降解菌DJL22，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。

结果表明，上述步骤一分离并纯化得到的多菌灵降解菌DJL22菌落圆形凸起淡黄色表面光滑湿润边缘整齐；菌体短杆状，0.5×1.0μm，革兰氏染色阳性。

2、生理生化特征分析

参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京：科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验(第三版).北京：高等教育出版社，1999.)测定上述多菌灵降解菌DJL22的生理生化特征。

所述多菌灵降解菌DJL22的生理生化特征测定结果如表1所示：

表1 多菌灵降解菌DJL22的生理生化特征

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

3、16s rDNA序列同源性分析

常规方法培养上述步骤一分离纯化得到的多菌灵降解菌DJL22，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌16s rDNA通用引物，27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR反应。反应体系采用上海生物工程有限公司PCR扩增试剂盒。反应程序为：95℃变性30s、55℃退火1min、72℃延伸2min，共30个循环。DNA测序由北京三博远志生物技术公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAStar软件完成，基因比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在线完成。

多菌灵降解菌DJL2216s rDNA的序列详见序列表中序列1。

4、生长特性分析

进行了菌株最适温度和最适pH生长实验。采用无机盐培养基，分别在4℃、28℃、37℃、60℃培养、观察、记录菌株的温度适应性，每个处理3次重复。调整酸度分别为pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11，每个处理3次重复，培养、观察、记录菌株生长的最适pH。

结果表明，所述多菌灵降解菌DJL22的最适生长温度为25℃，最适生长pH为pH7～8。

鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤一分离纯化得到的多菌灵降解菌DJL221鉴定为变型细菌α亚群分枝杆菌科分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)。该多菌灵降解菌DJL22已于2011年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.5041。

实施例2、分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22 CGMCC No.5041降解多菌灵能力定量测定

一、多菌灵测定标准曲线制作

用多菌灵标准品(购自Sigma公司)配制系列标准悬液，根据多菌灵在281nm处有最大吸收峰这一特点，通过紫外分光光度法测定OD281，进而绘制多菌灵测定标准曲线，不同浓度多菌灵的OD281测定结果如表2所示：

表2 不同浓度多菌灵的OD281值

根据表1数据，得到多菌灵测定标准曲线方程为y＝0.0769x+0.0064，R²＝0.999。多菌灵测定标准曲线如图1所示。

二、分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22 CGMCC No.5041降解多菌灵能力定量测定

按照如下两种方案定量测定分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22 CGMCC No.5041降解多菌灵的能力：

1)在上述无机盐培养基中加入100mg/L的多菌灵，接入分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)DJL22 CGMCC No.5041，同时以只含多菌灵，但未接所述分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)DJL22 CGMCC No.5041的培养基作为空白对照。于25℃，200r/min摇床培养，于5d后取样根据步骤一绘制的多菌灵测定标准曲线来测定多菌灵残留量。

2)在无机盐培养基中加入600mg/L的多菌灵，接入分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22 CGMCC No.5041，同时以只含多菌灵，但未接所述分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22 CGMCC No.5041的培养基作为空白对照。于25℃，200r/min摇床培养，于5d、10d、15d后分别取样根据步骤一绘制的多菌灵测定标准曲线来测定多菌灵残留量。

结果显示，多菌灵初始浓度为100mg/L时，5d时所述分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22 CGMCC No.5041对多菌灵的降解率达84.79％(如表3所示)；多菌灵初始浓度为600mg/L时，15d时所述分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22 CGMCC No.5041对多菌灵的降解率达62.77％(如表4所示)。这一结果表明，本发明所提供的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22 CGMCC No.5041可高效降解多菌灵。

表3 分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22 CGMCC No.5041降解多菌灵功效

(初始浓度：100mg/L)

表4分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22 CGMCC No.5041降解多菌灵效

(多菌灵初始浓度：600mg/L)

Claims

1.分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.5041。

2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No.5041的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22。

3.权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No.5041的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22或权利要求2所述的菌剂在降解多菌灵中的应用。

4.权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No.5041的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22或权利要求2所述的菌剂在修复土壤多菌灵污染中的应用。

5.培养权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No.5041的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22的方法，包括将所述保藏编号为CGMCC No.5041的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22在用于培养分枝杆菌的培养基中培养的步骤。

6.权利要求2所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No.5041的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)DJL22作为活性成分，得到所述菌剂。