CN102485881B - 一种用于阿特拉津工业废水生物处理的中度嗜盐菌 - Google Patents

Abstract

本发明属于工业废水生物处理领域，涉及一种中度嗜盐的盐单胞菌(Halomonas sp.)SY-AD-9，该菌株于2010年09月13日保藏在中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4165，菌株16S rDNA序列的GenBank登陆号为HM627247。该菌株能以阿特拉津为唯一氮源、柠檬酸钠为碳源生长，耐受14％的氯化钠，在低于7％氯化钠条件下能高效降解工业废水中的阿特拉津，可用于高含盐量阿特拉津工业废水的生物处理，使处理过的废水达到国家规定现有企业的排放标准。

Description

一种用于阿特拉津工业废水生物处理的中度嗜盐菌

技术领域

本发明属于工业废水生物处理领域，涉及一种用于阿特拉津工业废水生物处理的中度嗜盐菌。

背景技术

阿特拉津(商品名莠去津)是一种三嗪类除草剂，广泛应用于玉米、高粱和甘蔗地的杂草防除。由于阿特拉津在农业上的大量使用和阿特拉津生产厂的废水排放，造成对土壤、地下水和表面水的污染。为了用生物技术对阿特拉津污染的环境进行治理和修复，最近20多年来科研人员从环境样品中分离和鉴定了大量降解阿特拉津的细菌，它们来自10多个属，其中假单胞菌属(Pseudomonas)和节杆菌属(Arthrobacter)的细菌最为常见，代表性菌株是Pseudomonassp.ADP和Arthrobacter sp.TC1，前者含有atzABCDEF 6个降解基因，能将阿特拉津完全降解成NH₃和CO₂，后者含有trzN-atzBC 3个降解基因，能将有毒的阿特拉津降解成无毒的氰尿酸(Martinez B et al.J Bacteriol，2001，183：5684-5697；Sajjaphan K et al.Appl Environ Microbiol，2004，70：4402-4407)。已知此前分离的菌株最高可耐受4％的盐，然而农药厂的阿特拉津废水一般都含有较高浓度的盐(6％以上)，所以尚不能很好地用于工业废水的生物处理(Shapir Net al.J Ind Microbiol Biotechnol，1998，20：153-159)。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于阿特拉津工业废水生物处理的盐单胞菌，以解决高含盐量的阿特拉津废水的生物处理问题。

为了解决高含盐量的阿特拉津废水的生物处理问题，急需分离盐耐受能力强的高效降解菌株。为此，本发明分离和鉴定了一株能耐受14％氯化钠，在7％氯化钠中能高效降解阿特拉津的菌株盐单胞菌(Halomonas sp.)，并用于阿特拉津工业废水的生物处理。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种盐单胞菌(Halomonas sp.)，2010年09月13日保存于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4165，菌株16S rDNA序列的GenBank登陆号为HM627247。

该菌株是革兰氏阴性菌，名称为SY-AD-9，简称SY-AD-9菌株。菌株的形态特征为：细胞圆形，菌落白色、隆起、边缘圆滑。菌株在生长过程中能耐受14％的氯化钠，菌株的最适生长条件为：pH 7.0，温度30℃。

SY-AD-9菌株分离自生产阿特拉津的农药厂受污染的土壤，经人工富集驯化培养和分离纯化得到。

分离培养基成分为(g/L)：1.5蔗糖，1.5柠檬酸钠，0.9KH₂PO₄，6.5Na₂HPO₄·12H₂O，0.2MgSO₄·7H₂O；每1L培养基加入1mL微量元素溶液[微量元素溶液配制：1g FeSO₄·7H₂O，1g MnSO₄·H₂O，0.25g Na₂MoO₄·2H₂O，0.1g H₃BO₄，0.25g CuCl₂·2H₂O，0.25g ZnCl₂，0.1g NH₄VO₃，0.25g Co(NO₃)₂·6H₂O，0.1g NiSO₄·6H₂O，溶解于900mL蒸馏水中，加5mL浓H₂SO₄，补蒸馏水至1000mL]；阿特拉津配成10g/L的甲醇储液，高压灭菌之前加入，终浓度为200mg/L。

盐单胞菌SY-AD-9能高效降解阿特拉津，在以柠檬酸钠为碳源(3g/L)、阿特拉津(200mg/L)为氮源的无机盐液体培养基中(不含蔗糖，其它成分同分离培养基)接种SY-AD-9菌株以后，在30℃，pH为6.5～9.0范围内，含盐量在1％～7％时能高效降解阿特拉津，48h内将200mg/L的阿特拉津降解98％以上。

本发明的另一个是盐单胞菌SY-AD-9在阿特拉津工业废水生物处理中的应用。具体应用方法为将盐单胞菌SY-AD-9在以柠檬酸钠为碳源(3g/L)、阿特拉津(200mg/L)为氮源的无机盐液体培养基中25～35℃震荡培养40～72h，然后按5％的接种量将菌液接种到阿特拉津含量为33～100mg/L的工业废水中，加入Na₂HPO₄使终浓度为500mg/L，加入柠檬酸钠使终浓度为500mg/L，25～35℃震荡培养48h以后，90％以上的阿特拉津被去除，阿特拉津残留量达到国家标准(GB21523-2008)中关于现有企业的排放标准(＜5mg/L)。

以上述盐单胞菌SY-AD-9为活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围，该菌剂中菌体数量达到10⁹-10¹²CFU/mL。根据需要生物菌剂中可以添加某些该盐单胞菌SY-AD-9可接受的辅料如营养盐等。例如该菌剂含有3g/L柠檬酸钠、0.9g/L KH₂PO₄、6.5g/L Na₂HPO₄·12H₂O、0.2MgSO₄·7H₂O和1‰(V/V)上述微量元素溶液。

本发明的盐单胞菌SY-AD-9能以阿特拉津为唯一氮源、柠檬酸钠为碳源生长，耐受14％的氯化钠，在7％氯化钠条件下能高效降解工业废水中的阿特拉津，属于一种中度嗜盐菌，克服了此前分离的菌株最高只能耐受4％的缺陷，可以很好地解决农药生产厂阿特拉津工业废水生物处理问题，从而实现了本发明的目的。

附图说明

图1为不同盐浓度条件下盐单胞菌SY-AD-9对阿特拉津的降解率。

图2为盐单胞菌SY-AD-9在含盐量6％条件下对阿特拉津的降解曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：SY-AD-9菌株的分离和鉴定

1.SY-AD-9菌株的分离和纯化

SY-AD-9菌株是采用富集培养法从农药厂受污染的土壤样品中分离得到。具体步骤如下：用250mL三角瓶，装50mL阿特拉津无机盐培养基(g/L，1.5蔗糖，1.5柠檬酸钠，0.9KH₂PO₄，6.5Na₂HPO₄·12H₂O，0.2MgSO₄·7H₂O，每1L培养基加入1mL微量元素溶液，阿特拉津配成10g/L甲醇储液，高压灭菌之前加入)。微量元素溶液配方(g/L)：1g FeSO₄·7H₂O，1gMnSO₄·H₂O，0.25g Na₂MoO₄·2H₂O，0.1g H₃BO₄，0.25g CuCl₂·2H₂O，0.25g ZnCl₂，0.1gNH₄VO₃，0.25g Co(NO₃)₂·6H₂O，0.1g NiSO₄·6H₂O，溶解于900mL蒸馏水中，加5mL浓H₂SO₄，补蒸馏水至1000mL。向培养基中接入从辽宁省营口市某农药厂采集的5mL土壤悬浮液，放入30℃、转速为150r/min的摇床中振荡培养5d，取5mL菌液转接到50mL新培养基中，重复转接6次。阿特拉津的起始浓度为100mg/L，NaCl的初始浓度为1％，以后阿特拉津浓度每次增加50mg/L，NaCl浓度每次增加1％。

驯化培养好的菌液按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4和10^-5稀释，取0.1mL 10^-5稀释液涂在含500mg/L阿特拉津和6％NaCl的无机盐固体培养基平板上，30℃倒置培养3～5d，挑取有明显降解圈的菌落，进行3次划线分离纯化，得到纯化的菌株SY-AD-9。

2.SY-AD-9菌株的鉴定

采用16S rRNA基因(16S rDNA)测序法对SY-AD-9菌株进行分类鉴定，具体步骤如下：

(1)细菌总DNA的制备：用天根公司基因组提取试剂盒提取SY-AD-9菌株的基因组DNA，作为PCR反应的模板。

(2)16S rRNA基因的PCR扩增：扩增引物如下：

27F：5’-AgAgTTTgATCMTggCTCAg-3’[M＝C，A]

1492R：5’-CggYTACCTTgTTACgACTT-3’[Y＝T，C]

中间引物：533F：5’-gTgCCAgCMgCCgCggTAA-3’

PCR反应体系：

PCR反应条件：

(3)PCR产物的纯化、克隆、测序和分析：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后与pMD 18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，然后提取重组质粒，测定16S rRNA基因序列，将基因序列登录美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，进行核苷酸序列Blast比对，得到与相关菌株的16S rRNA基因序列同源的若干核苷酸序列，结果表明SY-AD-9菌株与47株盐单胞菌属(Halomonas)的16S rRNA基因序列的同源性在99％以上，所以分离菌株被鉴定为盐单胞菌(Halomonas sp.)。该菌株的16S rRNA基因序列已提交GenBank，登陆号为：HM627247。

实施例2：盐单胞菌SY-AD-9菌株的碳源利用测定

在不同碳源下实施降解实验，发现SY-AD-9菌株在以柠檬酸钠为唯一碳源条件下对阿特拉津有较高的降解率。具体步骤如下：

取处于对数生长期的SY-AD-9菌株的菌液，按5％接种量接入含有200mg/L阿特拉津的无机盐培养基中，并添加3g/L不同碳源(蔗糖、柠檬酸钠、蔗糖+柠檬酸钠、葡萄糖)。结果如表1.1所示，柠檬酸钠效果最好，其次是蔗糖和柠檬酸钠的混合碳源，葡萄糖和果糖虽然是微生物容易利用的碳源，但是并不利于SY-AD-9菌株对阿特拉津的降解。

表1.1盐单胞菌SY-AD-9在不同碳源条件下的阿特拉津降解率

实施例3：盐单胞菌SY-AD-9菌株的耐盐度测定

在pH 7.0，温度30℃，NaCl浓度分别为3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％，阿特拉津浓度为200mg/L条件下，将SY-AD-9菌株的培养物接种于20mL以3g/L柠檬酸钠为唯一碳源的无机盐培养基中，170r/min震荡培养，培养48h后取样，将样品用等体积的二氯甲烷通过液-液萃取的方法萃取出细菌培养液中的阿特拉津，用气相色谱法测定其含量，计算降解率。以NaCl浓度为横坐标，阿特拉津降解率为纵坐标，绘制降解曲线，结果见图1。由图1可见，SY-AD-9菌株在NaCl浓度为3％～7％之间时对阿特拉津有很好的降解效果，对200mg/L的阿特拉津降解率达到98％以上。NaCl浓度大于7％～14％区间时阿特拉津降解率逐渐降低，但仍有一定降解能力。而此前已知的其它阿特拉津降解菌株当NaCl浓度超过4％时完全失去降解能力，这表明SY-AD-9菌株具有很好的盐度耐受力。

实施例4：盐单胞菌SY-AD-9菌株对阿特拉津的降解曲线测定

将SY-AD-9菌株的培养物接种于20mL阿特拉津浓度为200mg/L，NaCl浓度为6％，pH为7.0的无机盐培养基中，于30℃、170r/min震荡培养，定时取样，将样品用等体积的二氯甲烷通过液-液萃取的方法萃取出细菌培养液中的阿特拉津，用气相色谱法测定其含量，以时间为横坐标，阿特拉津残留浓度为纵坐标，绘制降解曲线，结果见图2。由图2可见，SY-AD-9菌株于36h内进入对数生长期，48h内能将培养基中200mg/L的阿特拉津降解98.5％，最终培养液中阿特拉津浓度为3mg/L。

实施例5：盐单胞菌SY-AD-9菌株在阿特拉津工业废水处理中的应用

将盐单胞菌SY-AD-9在以柠檬酸钠为碳源(3g/L)、阿特拉津(200mg/L)为氮源的无机盐液体培养基中30℃震荡培养48h，然后按5％的接种量将菌液接种到阿特拉津含量为45.8mg/L的工业废水中，加入Na₂HPO₄使终浓度为500mg/L，加入柠檬酸钠使终浓度为500mg/L，30℃震荡培养48h以后，91.5％的阿特拉津被去除，阿特拉津残留量为3.9mg/L，达到国标(GB21523-2008)中关于现有企业的排放标准(＜5mg/L)。

表1.2盐单胞菌SY-AD-9用于阿特拉津工业废水生物处理

Claims (4)

1.一种用于阿特拉津工业废水生物处理的中度嗜盐菌，其特征在于：该菌株是革兰氏阴性的盐单胞菌(Halomonas sp.)SY-AD-9，菌株在生长过程中能耐受14％的氯化钠，2010年09月13日保存于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4165，菌株16S rDNA序列的GenBank登陆号为HM627247。

2.一种如权利要求1所述的中度嗜盐菌在阿特拉津工业废水生物处理中的应用，其特征在于，采用以下方法处理阿特拉津工业废水：将盐单胞菌SY-AD-9在3g/L柠檬酸钠为碳源、200mg/L阿特拉津为氮源的无机盐液体培养基中于25～35℃震荡培养40～72h，然后按5％的接种量将菌液接种到阿特拉津农药废水中，加入Na₂HPO₄使终浓度为500mg/L，加入柠檬酸钠使终浓度为500mg/L，于25～35℃震荡培养，去除其中的阿特拉津。

3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于：将盐单胞菌SY-AD-9在3g/L柠檬酸钠为碳源、200mg/L阿特拉津为氮源的无机盐液体培养基中于30℃震荡培养48h，然后按5％的接种量将菌液接种到阿特拉津农药废水中，加入Na₂HPO₄使终浓度为500mg/L，加入柠檬酸钠使终浓度为500mg/L，于30℃震荡培养，去除其中的阿特拉津。

4.一种生物菌剂，其特征在于：含有权利要求1所述的中度嗜盐菌为活性成分，菌剂中菌体数量达到10⁹-10¹²CFU/mL。

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