CN110713946B - 一株可降解双酚a和磷酸三苯酯的鞘氨醇菌 - Google Patents

一株可降解双酚a和磷酸三苯酯的鞘氨醇菌 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种可降解双酚A和磷酸三苯酯的鞘氨醇菌。该菌命名为YC‑JY1，保藏编号为CGMCC No.16352，其能够在12小时内将无机盐中的100mg/L双酚A降解100％，4天内将无机盐培养基中的100mg/L磷酸三苯酯100％降解。本发明的鞘氨醇菌株YC‑JY1在pH值为5.5‑8时，培养处理9小时后对双酚A的降解效率高于95％。本发明菌株能够应用于双酚A和磷酸三苯酯污染环境的生物修复，具有较好的经济价值和应用前景。

Description

一株可降解双酚A和磷酸三苯酯的鞘氨醇菌
技术领域
本发明涉及微生物及生物降解领域，具体地，涉及一株可降解双酚A和磷酸三苯酯的鞘氨醇菌(Sphingobium sp.)YC-JY1。
背景技术
双酚A(Bisphenol A，BPA)是一种具有雌激素活性的环境内分泌干扰物(Endocrine Disrupting Chemicals，EDCs)。双酚A作为一种重要的有机化工原料已经广泛应用于人类的日常生活中，主要被用来合成聚碳酸酯(PC)和环氧树脂等材料，如婴儿的奶瓶，食品包装，牙科填充剂等。双酚A生产过程中的泄露以及含有双酚A的物品不合理处置都会使得双酚A很容易进入到土壤、水体和大气中，环境中双酚A污染问题广泛存在。它能够进入人体或动物体内与细胞受体结合，干扰生物体荷尔蒙的合成、运输、结合或分解等过程，严重破坏动物的内分泌系统，对集体的生殖发育、免疫系统、神经系统等多方面产生异常效应。
磷酸三苯酯(Triphenyl phosphate，TPP)是一种有机磷酸酯，可作为阻燃剂用于泡沫中，也可作为增塑剂用于指甲油、液压油中。TPhP是一种添加剂，不与聚合物材料形成化学键，这意味着它可以很容易地释放到环境中。TPP对生物体具有神经毒性和免疫毒性。
鞘氨醇菌属细菌(Sphingobium sp.)是较常见的细菌之一，它广泛存在于环境中，该种菌具有用于生物修复的潜力，但目前对于该菌同时降解双酚A和磷酸三苯酯未见报道。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术中的缺陷，提供一种可降解双酚A和磷酸三苯酯的鞘氨醇菌(Sphingobium sp.)YC-JY1。
本发明的菌株YC-JY1是从活性污泥中分离得到一株能够降解双酚A和磷酸三苯酯的菌株。土壤样品采集于广东某受污染的河流。该菌可在12h内将无机盐离子培养基中100mg/L的双酚A 100％降解，4天内将无机盐离子培养基中100mg/L的磷酸三苯酯100％降解，对菌株进行连续转接测定降解能力，降解能力稳定。
菌株YC-JY1的菌落呈黄色、湿润、边缘整齐且中间略凸起、菌落表面光滑且不透明(图1)。在电镜下(图2)，该菌为短杆状，有鞭毛。菌株革兰氏染色反应为阴性。基于形态特征、生理生化特征，将该菌株鉴定为鞘氨醇菌属细菌Sphingobium sp.，命名为YC-JY1。该菌株于2018年8月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.16352，分类名为鞘氨醇菌Sphingobium sp.。
本发明首先提供了一株鞘氨醇菌(Sphingobium sp.)YC-JY1，其保藏编号为CGMCCNo.16352。
本发明提供了含有所述鞘氨醇菌YC-JY1的菌剂。
优选地，所述菌剂其为生物清洁剂或土壤修复剂。
本发明提供了鞘氨醇菌YC-JY1或含有该菌的菌剂在清洁环境中的应用。
本发明提供了鞘氨醇菌YC-JY1或含有该菌的菌剂在净化、修复土壤或工业废水中的应用。
具体地，所述应用为降解双酚A和/或磷酸三苯酯。
进一步地，上述应用时的环境温度为15-35℃。优选地，所述环境温度为25-35℃。更优选地，所述环境温度为30℃。
进一步地，应用时的体系pH值为5-8。优选地，所述体系pH值5.5-8。
本发明提供了所述的鞘氨醇菌YC-JY1在制备能够降解双酚A和/或磷酸三苯酯的生物清洁剂、降解剂或土壤修复剂中的应用。
本发明的鞘氨醇菌株YC-JY1对pH值有强适应性，在pH值为5.5-8时，对双酚A能保持95％以上的降解率；本发明的菌株能够在12小时内将无机盐中的100mg/L双酚A降解100％，4天内将无机盐培养基中的100mg/L磷酸三苯酯100％降解，具有高效、迅速的降解双酚A和TPP能力，能够应用于双酚A和磷酸三苯酯污染环境的生物修复，具有较好的经济价值和应用前景。
附图说明
图1为鞘氨醇菌株YC-JY1在培养基中生长菌落图。
图2为鞘氨醇菌株YC-JY1在电镜下的形态结构图。
图3a为利用双酚A的标准品绘制浓度与220nm处吸收峰面积之间的标准曲线，图3b为磷酸三苯酯标准品绘制浓度与205nm处吸收峰面积之间的标准曲线。
图4为菌株YC-JY1在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下，12小时内降解双酚A能力示意图，显示菌株YC-JY1在30℃处理9小时后能保持97％以上的降解率。
图5为菌株YC-JY1在不同pH(4-9)的加入双酚A至底物浓度100mg/L的无机盐离子培养基中，12小时降解双酚A能力的示意图。
图6为液质联用法(HPLC-TOF-MS/MS)检测鞘氨醇菌YC-JY1降解双酚A的代谢产物图。
图7a为实施例4中土壤灭菌组和未灭菌组中，阴性对照与添加不同浓度YC-JY1菌液降解土壤过程中双酚A的残留量对比图。图7b为实施例4中土壤灭菌组和未灭菌组中，阴性对照与添加不同浓度YC-JY1菌液降解土壤过程中TPP的残留量对比图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1菌株YC-JY1的分离和鉴定
1.菌株的分离
活性污泥采集于广东受污染河流，在无菌操作条件下，将5g活性污泥样品接种到100mL含50mg/L双酚A的TEM无机盐离子培养基，30℃，180rpm条件下培养。该TEM无机盐离子培养基含(NH4)2SO4,2.0g/L；Na2HPO4·12H2O,1.5g/L；KH2PO4,1.5g/L；MgSO4·7H2O,0.2g/L；CaCl2·2H2O,0.01g/L,以及微量元素FeSO4·7H2O 5mg/L,ZnSO4·7H2O 0.22mg/L,CuSO4·5H2O 0.03mg/L,Na2MoO4·2H2O 0.02mg/L,MnSO4·2H2O 1.43mg/L,CoSO4·7H2O 0.12mg/L,Na2WO4·2H2O 0.023mg/L。每培养7天，取培养基体积的10％接种于新鲜的无机盐离子培养基中，且每次将双酚A的浓度提高50mg/L，连续转接5次，无机盐培养基中双酚A浓度提高到300mg/L。
将驯化后的菌液划线到含有100mg/L双酚A的无机盐培养基平板上，30℃静置培养5天。挑取平板上的单菌落进行划线后培养，重复三次，直至分离获得纯化的菌株。保存生长良好、传代稳定且降解能力较好的菌株，菌株命名为YC-JY1。
2.菌株的形态学特征
在LB固体培养基上菌落呈黄色、湿润、边缘整齐且中间略凸起、菌落表面光滑且不透明(见图1)，菌株革兰氏染色为阴性。
3.16S rDNA鉴定
将菌株YC-JY1接种到LB培养基中，30℃、180rpm条件下过夜培养，取1mL菌液，离心收集菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，得到的基因DNA用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，-20℃保存备用。
用于扩增16s rRNA基因序列的通用引物为：27F5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R5'-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3'，用基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA纯化回收试剂盒纯化，连接到pMD-T载体上，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布到含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，在37℃下培养16h，挑取白色菌落至液体LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，送上海生工生物公司进行测序。将该序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行Blast比对分析，并利用MEGA 5.2软件构建系统发育树可知，菌株YC-JY1为鞘氨醇菌，与目前已发表的鞘氨醇菌序列具有较高相似性。
综合菌体形态、生理生化特性和16S rRNA基因序列，菌株YC-JY1被鉴定为鞘氨醇菌(Sphingobium sp.)。该菌株YC-JY1于2018年08月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.16352，分类名为鞘氨醇菌Sphingobiumsp.。
实施例2鞘氨醇菌YC-JY1的降解性能试验
1、鞘氨醇菌YC-JY1对双酚A和磷酸三苯酯的降解
高效液相色谱法检测鞘氨醇菌YC-JY1分别对无机盐培养基中双酚A和TPP的降解作用。
将菌株YC-JY1接种到液体LB培养基中活化，用TEM无机盐培养基洗涤并调整菌液浓度为OD600＝0.8，按照体积比1％的接种量接种到分别含双酚A和TPP各100mg/L混合物的TEM无机盐培养基中，作为处理组，以未接种菌株的含双酚A和TPP各100mg/L的无机盐培养基作为对照组，对照组与处理组各设三个重复。将对照组与处理组在30℃条件下，180rpm摇床振荡避光培养，在培养12h后测定双酚A的浓度，在培养4天后测定磷酸三苯酯的浓度。
取1mL双酚A降解样品，用0.22μm的滤膜过滤，用于双酚A浓度检测；在TPP降解样品中加入等体积乙腈，充分振荡10min，然后用0.22μm的滤膜过滤，进行HPLC分析。
HPLC分析条件为：Agilent 1200高效液相色谱仪，色谱柱：Eclipse-C18(150×4.6mm×5μm)，流动相1(用于双酚A检测)为乙腈:0.1％乙酸水＝70:30(v/v)，进样量2μL；流动相2(用于TPP的检测)为乙腈:水＝90:10(v/v)，进样量5μL，流速均为1.0mL/min，使用DAD检测器进行检测。双酚A的检测波长为220nm，保留时间为1.85min；磷酸三苯酯的检测波长为205nm，磷酸三苯酯的保留时间2.17min。利用双酚A的标准品绘制浓度与220nm处吸收峰面积之间的标准曲线(图3a)，磷酸三苯酯标准品绘制浓度与205nm处吸收峰面积之间的标准曲线(图3b)。
降解率的计算：根据不同底物的标准曲线计算每种底物在无机盐培养基中每天的残留浓度，再根据降解率计算公式得到菌株YC-JY1对底物的降解率。
降解率％＝(对照组中底物的终浓度-处理组中底物的终浓度)/对照组中底物的终浓度×100％
表1菌株YC-JY1对底物的降解率与底物的自然降解率
Figure BDA0002250630150000061
2、鞘氨醇菌YC-JY1降解双酚A时对温度的耐受能力
将菌株YC-JY1接种到液体LB培养基中活化，用无机盐培养基洗涤并调整菌液浓度到OD600＝0.8，按照体积比1％的接种量接种无机盐离子培养基(pH 7)中，分别在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下，180rpm摇床振荡避光培养。每3小时取样测定双酚A浓度。
鞘氨醇菌YC-JY1降解双酚A的最适温度是30℃，在15-35℃均可降解双酚A，在15～30℃范围内，降解效率随温度的升高而升高，在30℃时达到最高，在40℃温度下无降解能力(图4)。9h时测定降解率分别为22.4％(15℃)、44％(20℃)、66.9％(25℃)、97.1％(30℃)、49.5％(35℃)、0(40℃)。
3、鞘氨醇菌YC-JY1降解双酚A时对pH耐受能力
分别配制不同pH(4-9)的无机盐离子培养基，灭菌备用。向配制的无机盐离子培养基中同时加入双酚A至底物浓度100mg/L。将菌株YC-JY1接种到液体LB培养基中活化，洗涤并调整菌液浓度为OD600＝0.8，按照体积比1％的接种量接种到上述培养基中，作为处理组，30℃，180rpm摇床振荡避光培养。每3小时测定双酚A浓度。
pH影响鞘氨醇菌YC-JY1对双酚A的降解，如图5所示。
pH值为5.5～8时，培养9h后降解效率均高于95％，当pH值为4.0-4.5时，双酚A无降解。当pH值从5.0增加到5.5，9h双酚A的降解率由30.2％增加到97.8％。在pH值为5.5-8.0时，YC-JY1对双酚A的降解效率保持在最高水平95％以上。当pH值超过8时，YC-JY1对双酚A的降解率显著降低，pH8.5时降解率为11.3％。
实施例3液质联用法(HPLC-TOF-MS/MS)检测鞘氨醇菌YC-JY1降解双酚A的代谢产物
将菌株YC-JY1降解BPA的代谢物用乙酸乙酯萃取两次。通过旋转蒸发浓缩样品。将残余物溶解在HPLC级乙腈中，并使用0.22μm膜(Millipore，USA)过滤用于分析。使用配备有Eclipse XDB-C18柱(Agilent，USA)的高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(HPLC-Q-TOF-MS/MS)来检测样品。使用电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)，在负离子模式下进行母离子扫描检测。
流动相为乙腈(A)和0.1％甲酸水溶液(B)。如下使用梯度运行：0-5分钟，30％A；5-6分钟，30％-50％A；6-11分钟，50％A；11-12分钟，50％-70％A；12-13分钟70％-90％A；13-18分钟，90％A；18-20分钟，90％-50％A；20-22分钟，50％-30％A；22-25分钟，30％A。流速为0.5mL/min，注射体积为2μL。离子扫描范围设为50至500Da。使用软件Agilent MassHunter收集和分析数据。
双酚A代谢产物的检测结果表明，在负离子模式下有六种母离子被检测到，保留时间为3.873min(m/z 259[M-H]-),5.709min(m/z 121[M-H]-),5.946min(m/z 135[M-H]-),7.203min(m/z 243[M-H]-),12.236min(m/z 227[M-H]-),15.560min(m/z 225[M-H]-)。其中质荷比m/z＝259[M-H]-的物质鉴定为2,3-双(4-羟基苯基)-1,2-丙二醇(2,3-Bis(4-hydroxyphenyl)-1,2-propanediol),质荷比m/z＝121[M-H]-的峰鉴定为对羟基苯甲醛(p-Hydroxybenzaldehyde)，质荷比m/z＝135[M-H]-的峰鉴定为对羟基苯乙酮(4'-Hydroxyacetophenone)，质荷比m/z＝243[M-H]-的峰鉴定为2,3-双(4-羟基苯基)-1,2-丙二醇(1,2-Bis(4-hydroxyphenyl)-2-hydroxypropane)，质荷比m/z＝227[M-H]-的峰鉴定为双酚A(bisphenol A)，质荷比m/z＝225[M-H]-的峰鉴定为4,4'-二羟基-α-甲基二苯乙烯(4,4'-Dihydroxy-α-methylstilbene)，见图6。
实施例4鞘氨醇菌YC-JY1降解双酚A、TPP的土壤实验
本研究中所用的土壤取自中国农业科学院西门花园土壤。土壤用40目筛子除去较大块的硬质土和沙石后，分别称取10g置于50mL离心管中，并做以下两种处理：不灭菌和灭菌(121℃，20min)。将菌株YC-JY1接种到液体LB培养基中活化，用TEM无机盐培养基洗涤并调整菌液浓度为OD600＝0.8，按照表2接种量进行接种，双酚A和TPP的初始添加浓度为100mg/kg。将样品放置于30℃培养箱内进行培养，培养2天后分别测定双酚A和TPP的浓度。以相同条件下不接菌的土壤样品作为对照，处理组和对照组中每个处理均设3个重复，每个样品确保添加的菌悬液体积和无机盐培养基体积为1mL。
表2菌株YC-JY1土壤修复实验
Figure BDA0002250630150000091
每个样品中加入10mL乙腈，剧烈震荡萃取底物，4℃静置过夜。取萃取后液体经0.22μm的滤膜进行过滤，用于HPLC检测。如图7a所示，未灭菌组中双酚A的残留量普遍低于相应的灭菌组，并且随着接种量的增加双酚A的残留量呈下降趋势，2天后接种量为10％的双酚A的残留量为29.5mg/kg(未灭菌组)和35.4mg/kg(灭菌组)。图7b中，未灭菌组中TPP的残留量低于相应的灭菌组，随着接种量加大残留量降低，当接种量为10％时，培养2天后，未灭菌组和灭菌组的TPP残留量均低于1mg/kg。菌株YC-JY1在土壤实际修复过程中表现出较强的双酚A和TPP降解能力，显示出巨大的实际应用潜能。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院研究生院
<120> 一株可降解双酚A和磷酸三苯酯的鞘氨醇菌
<130> KHP191115990.6
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.一株鞘氨醇菌(Sphingobium sp.)YC-JY1，其保藏编号为CGMCC No.16352。
2.含有权利要求1所述鞘氨醇菌(Sphingobium sp.)YC-JY1的菌剂。
3.权利要求1所述的鞘氨醇菌(Sphingobium sp.)YC-JY1或权利要求2所述的菌剂在清洁环境中的应用。
4.权利要求1所述的鞘氨醇菌(Sphingobium sp.)YC-JY1或权利要求2所述的菌剂在净化、修复土壤或工业废水中的应用。
5.权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述应用为降解双酚A和/或磷酸三苯酯。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，应用时的环境温度为15-35℃。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，应用时的体系pH值为5-8。
8.权利要求1所述的鞘氨醇菌(Sphingobium sp.)YC-JY1在制备降解双酚A和/或磷酸三苯酯的生物清洁剂中的应用。
9.权利要求1所述的鞘氨醇菌(Sphingobium sp.)YC-JY1在制备降解双酚A和/或磷酸三苯酯的降解剂中的应用。
10.权利要求1所述的鞘氨醇菌(Sphingobium sp.)YC-JY1在制备降解双酚A和/或磷酸三苯酯的土壤修复剂中的应用。
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