CN105274031A - 一株鞘氨醇单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明一株保藏编号为CGMCC?No.?11031的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas?sp.),该菌可制备成HJY菌剂,应用于增强韭菜中残留毒死蜱降解;相对于现有降解作物中农药毒死稗残留的技术,该鞘氨醇单胞菌可长期定植于韭菜根部,可增强农作物降解残留毒死蜱的活性,在不影响农作物品质的前提下,高效降解农药残留,绿色无污染,适宜广泛推广使用。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域,特别是一株可增强韭菜中残留毒死蜱降解的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.)及其应用。
背景技术
毒死蜱(chlorpyrifos)是美国陶氏益农化学公司于1965年研发出来的一种高效、低毒、广谱、低残留及低抗药性的有机磷杀虫杀螨剂。有效成分的化学名称为O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯(O,O-diethyl-O-(3,5,6-trichloro-2-pyridyl,phosphorothioate)。毒死蜱在室温及酸性介质中稳定,在碱性介质中则易分解,难容于水,易溶于大多数有机溶剂。由于高毒有机磷农药被禁用,毒死蜱作为有效的取代产品,在用量和使用范围上越来越大,在我国广泛应用于水稻防治稻飞虱、水稻螟虫,韭菜等防治根蛆以及叶菜类蔬菜防治蚜虫、螨类等害虫,如目前田间一般使用48%毒死蜱乳油500-800倍稀释液灌根,用以防治韭菜根蛆;但是与其他有机磷农药相同,毒死蜱也存在残留和对生态环境的潜在威胁性,在我国由于大量以及不合理的使用,使得毒死蜱在稻米及蔬菜中的农残超标,成为发达国家设置绿色贸易壁垒的重要手段,对我国对人民健康产及农产品出口造成重大的影响。
目前毒死蜱在农产品中的去除一般采用清洗和辐照技术,但是这些方法只能清洗或去除农产品表面的农药残留,同时还有可能造成农产品外观及品质方面的损害。因此,如何在不损害农产品外观品质的前提下,高效降解残留的农药毒死稗,一直是本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对上述问题,本发明一株可增强韭菜中残留毒死蜱降解的鞘氨醇单胞菌,在不影响作物生长及农产品安全的前提下,可提升韭菜对毒死蜱的降解能力,从源头上降低毒死蜱的在农产品中的残留,本发明是这样实现的:
一株鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.),其保藏编号为CGMCCNo.11031;所述鞘氨醇单胞菌菌株为革兰氏阴性,菌体直杆状,带有鞭毛,无内生芽孢。
本发明中所提供的鞘氨醇单胞菌在增强韭菜中残留毒死蜱降解中的应用。
进一步,本发明所述氨醇单胞菌的应用是指,利用HJY菌剂对韭菜进行浸根处理,用以增强韭菜中残留毒死蜱的降解;
该HJY菌剂是这样获得的:
A)将保藏编号为CGMCCNo.11031的鞘氨醇单胞菌接种至LB培养基,30℃划线、挑单菌落培养两次后,挑取单菌落于菌种活化培养基中,30℃,150-200rpm摇床振荡培养12-24h,获得活化菌种;
B)向装有种子培养基的发酵罐接种活化菌种,接种量为种子培养基体积的1%,25-38℃,通空气培养16-24h,得到液体种子;
C)向装有种子培养基的发酵罐接种液体种子,接种量为种子培养基体积的1%,30-35℃,150rpm下避光培养至对数生长期,得到活菌体培养物;
D)取活菌体培养物50ml于4℃、5000rpm下离心15min,取沉淀菌体用0.85%的无菌生理盐水冲洗3次,再用无菌生理盐水调节至含菌量为1010cfu/mL,即获得HJY菌剂;
LB培养基:胰蛋白胨10g,酵母粉5g,氯化钠10g,琼脂20g,加水至1L,121℃灭菌20min;
菌种活化培养基:胰蛋白胨10g,酵母粉5g,氯化钠10g,加水至1L,121℃灭菌20min;
种子培养基:K2HPO44.8g,KH2PO43.5g,(NH4)2SO42g,MgCl20.16g,CaCl20.02g,Na2MoO4.2H2O0.0024g,FeCl30.0018g,MnCl2.2H2O0.0015g,pH=7.0,加水至1L,121℃灭菌20min。
进一步,本发明所述氨醇单胞菌的应用是指,在韭菜移栽前,将韭菜根浸没于HJY菌剂稀释液中,浸泡24h后再进行田间移栽;所述HJY菌剂稀释液是由无菌生理盐水将含菌量为1010cfu/mL的HJY菌剂稀释至含菌量为103-104cfu/mL后获得。
相对于现有降解作物中农药毒死稗残留的技术,本发明获得的鞘氨醇单胞菌可长期定植于韭菜根部,可增强农作物降解残留毒死蜱的活性,在不影响农作物品质的前提下,高效降解农药残留,绿色无污染,适宜广泛推广使用。
附图说明
图1为鞘氨醇单胞菌HJY显微镜图;
图2为鞘氨醇单胞菌HJY菌落形貌图片;
其中,(A)为加富培养基培养,(B)为MSM培养基;
图3为16SrDNA系统发育示意图;
图4增强农作物降解毒死稗结果示意图。
具体实施方式
实施例中所涉及的培养基:
LB培养基:10g胰蛋白胨,5g酵母膏,10g氯化钠,去离子水1000mL;121℃灭菌20min。
无机盐培养基(MSM):0.4gMgSO47H2O,0.2gFeSO47H2O,0.2gK2HPO4,0.2g(NH4)2SO4,0.08gCaSO4,去离子水1000mL,pH7.0-7.2。,121℃灭菌20min;
加富培养基(固体,1L):0.4gMgSO47H2O,0.2gFeSO47H2O,0.2gK2HPO4,0.2g(NH4)2SO4,0.08gCaSO4,1000mg蛋白胨,1000mg牛肉膏,琼脂20g,去离子水1000mL,pH7.0-7.2,121℃灭菌20min,用于菌株的斜面保存和平板培养。
菌种保藏培养基(固体,1L):胰蛋白胨10g,酵母粉5g,氯化钠10g,琼脂20g,加水至1L,121℃灭菌20min。
菌种活化培养基(液体,1L):胰蛋白胨10g,酵母粉5g,氯化钠10g,加水至1L,121℃灭菌20min。
种子培养基(液体,1L):K2HPO44.8g,KH2PO43.5g,(NH4)2SO42g,MgCl20.16g,CaCl20.02g,Na2MoO4.2H2O0.0024g,FeCl30.0018g,MnCl2.2H2O0.0015g,pH=7.0;121℃灭菌20min。
实施例1筛选菌株
1、菌株的获得
(1)样品采集:2012年10月,在江苏省南京市江苏省农业科学院实验田中采集经毒死蜱选择压力驯化的韭菜新鲜植株样本,用自来水将植株表面附带灰尘泥土冲洗干净,自然风干,按下述程序进行表面消毒:75%酒精浸泡3-5min,然后用无菌水冲洗3-4次,用2.5%NaClO2漂洗2-5min,最后用无菌水清洗5次;
(2)菌株分离筛选:分别取韭菜根茎叶进行组织研磨,吸取汁液均匀涂布于加富培养基平板上,于30℃条件下避光培养2-7天。
(3)菌株富集培养:待长出菌落后,挑取单菌落进一步划线于含毒死蜱的无机盐培养基(MSM)(毒死蜱含量50mg/L,该培养基以毒死蜱为单一碳源),于30℃条件下避光培养2-7天,选取能连续5次在只含毒死蜱(50mg/L)作为唯一碳源的MSM上生长的菌株;
(4)菌株纯化:采用平板划线分离法纯化,挑取在最高浓度下(毒死蜱100mg/L)生长的菌落在富集培养基上划线,直到分离获得纯培养物。
经上述方法筛选获得1株高效毒死蜱降解菌,申请人将其自命名为菌株HJY,其生理生化特征见表1:
表1菌株HJY的生理生化特性
测试项目 | 结果 | 测试项目 | 结果 |
菌株形态 | 直杆状rod | 葡萄糖酸盐 | - |
革兰氏反应 | -* | 丙二酸盐 | - |
接触酶 | + | 氧化酶 | + |
V-P试验 | + | M.R试验 | - |
硝酸盐还原 | - | 柠檬酸盐 | + |
明胶液化 | - | 吲哚 | - |
苯丙氨酸脱氨酶 | + | 精氨酸双水解酶 | + |
鸟氨酸脱羧酶 | + | 赖氨酸脱羧酶 | + |
*+代表反应呈阳性,-代表反应呈阴性。
菌株HJY显微照片如图1所示,经检测,该菌株为革兰氏阴性,直杆状,带有鞭毛而无内生芽孢,其在加富培养基(含毒死蜱100mg/L)和LB培养基上生长较快,在加富培养基(含毒死蜱100mg/L)中菌落生长48h如图2(A)所示,菌落呈亮黄色,质地光滑,湿润粘稠;而在以毒死蜱为唯一碳源的MSM平板上(含毒死蜱50mg/L)生长相对缓慢,如图2(B)所示,菌落开始时稀薄,呈白色,生长36h后菌株变为淡黄色,质地光滑粘稠。
菌株HJY的16SrDNA基因序列已经递交到了GenBank数据库,登记号为:KM985687,其16SrDNA系统发育如图3所示,在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上用blast程序与已登录细菌菌株的16SrDNA基因序列进行比较,结果表明其与鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.)相似性最高,可以达到99%以上,因此确定其为鞘氨醇单胞菌。
申请人于2015年7月2日将该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中,国科学院微生物研究所,邮编100101;其保藏编号为CGMCCNo.11031,分类命名为鞘氨醇单胞菌Sphingomonassp.。
实施例2制备HJY菌剂
1、菌种活化:挑取实施例1获得的鞘氨醇单胞菌HJY至菌种保藏培养基,30℃连续划线、挑单菌落培养(每次培养24h)两次后,再挑取单菌落在菌种活化培养基中,于30℃,150-200rpm摇床振荡培养12-24h;
2、液体种子制备:向装有种子培养基的发酵罐中,按照种子培养基体积的1%接种量接种步骤1活化后的菌种,于25-38℃,通空气培养16-24h,得到液体种子;
3、液态发酵:向装有种子培养基的发酵罐中,接种液体种子,接种量为培养基体积的1%,于30-35℃,150rpm条件下避光培养4-6h,得到活菌体培养物;
4、菌剂制备:取活菌体培养物50ml于4℃、5000rpm下离心15min,弃上清液,取沉淀菌体,用0.85%的无菌生理盐水冲洗3次,用无菌生理盐水调节至含菌量为1010cfu/mL,即获得HJY菌剂;加入无菌甘油(体积分数50%),灌装保藏,使用时稀释500-1000倍。
实施例3HJY菌剂离体条件下降解毒死稗
1、将2ml实施例2获得的HJY菌剂接种于100mlMSM培养基中,添加毒死蜱至终浓度为20mg/L,测定培养基初始OD600值和毒死蜱含量;同时以不接种HJY菌剂(加入与菌剂等体积的无菌生理盐水)的培养基作为对照组,每个处理重复3次;
将对照组与实验组均于30℃、200rpm避光培养,分不同时间取样测定OD600值及毒死蜱残留量;12d后,取样萃取,利用HPLC测定邻苯毒死蜱的含量,测定结果如图4所示,在以20mg/L毒死蜱为单一碳源的MSM培养基中,前3天菌体浓度(OD600nm)快速上升,而从第3天到第6天内有轻微地降低,随后又再上升;试验组至第12天时毒死蜱的残留量为1.83mg/L,降解率超过90%,而在未接HJY菌剂的对照组中,12天毒死蜱的降解率少于10%。
实施例4鞘氨醇单胞菌HJY在韭菜中的定殖
1、将实施例1获得的鞘氨醇单胞菌HJY接种至含1μg/mL利福平的LB平板上,逐步增加利福平的浓度至300μg/mL,筛选出能稳定生长且生理特性与原始菌株一致的突变体菌株。在LB平板上转接10代,观察菌落形态,然后转接至含有300μg/mL利福平的LB培养基上,检测突变菌株的稳定性,获得生长稳定且与原始菌株一致的利福平驯化鞘氨醇单胞菌HJY;
2、将利福平驯化鞘氨醇单胞菌HJY用生理盐水稀释至103cfu/mL,备用;取生长健康韭菜,剪去茎叶以及须根,用清水冲洗去除表面泥土,自然风干后在稀释后的菌液中浸泡24h,然后栽种于灭菌的土中,分别于7d,14d和30d取样检测鞘氨醇单胞菌HJY在韭菜植株体内的定殖量;同时设置未浸泡菌液的健康韭菜作为对照;
3、菌株检测:挖取完整韭菜植株,自来水冲洗干净表面土壤灰尘,剪分成根、茎、叶部分,经表面消毒后于灭菌的研钵内研磨,吸取汁液均匀涂布于添加有300ug/ml利福平的LB平板上,于30℃条件下避光培养2-4天后进行菌落计数,最后计算出每克植株样品的菌落数CFU/g。同时取未浸泡菌液的韭菜作为对照,每个处理重复3次;
4、试验检测结果:接种后7d,根部菌落数为8.6x103cfu/g,茎部菌落数为5.7x103cfu/g,叶部菌落数为3.1x103cfu/g;接种后14d,根部菌落数为9.3x103cfu/g,茎部菌落数为4.3x103cfu/g,叶部菌落数为2.1x103cfu/g;接种后30d,根部菌落数为2.6x104cfu/g,茎部菌落数为6.1x103cfu/g,叶部菌落数为1.2x103cfu/g;未浸泡菌液的对照组未检测到菌落。
由上述试验可知:鞘氨醇单胞菌HJY能够成功的在韭菜中定植,同时鞘氨醇单胞菌HJY可以由韭菜根部转移到茎叶中。接种30天后,根部HJY菌量显著增加,茎叶部菌量保持在103cfu/g的数量级。
实施例5鞘氨醇单胞菌HJY定殖、增强韭菜中残留毒死蜱降解试验
1、韭菜浸根接种鞘氨醇单胞菌HJY:将实施例2获得的HJY菌剂用无菌生理盐水稀释,使鞘氨醇单胞菌HJY含菌量在103cfu/mL左右;于韭菜移栽前将韭菜根全部浸泡的稀释后的鞘氨醇单胞菌菌液内,浸泡24小时以接种,接种好鞘氨醇单胞菌HJY的韭菜幼苗进行田间移栽,正常浇水、施肥管理;
2、毒死蜱施用处理:接种鞘氨醇单胞菌韭菜幼苗生长7天后进行施药处理,即将48%毒死蜱乳油用自来水稀释100倍(以下简称高剂量)和500倍液(以下简称低剂量),分别按每盆韭菜(3株/盆)灌根10ml,于施药后30天取样检测土壤和植株中毒死蜱残留;同时以未接种鞘氨醇单胞菌HJY的韭菜作对照,每个处理重复三次;
3、韭菜植株及土壤中毒死蜱残留检测:韭菜植株分地上部分和地下部分,匀浆后用乙腈提取,过FlorisilSPE柱净化后,气相色谱检测毒死蜱残留量;土壤样品用乙腈提取,氮气吹干后用1mL正己烷定容,气相色谱检测毒死蜱残留量;
4、毒死蜱残留检测结果:以高剂量药液10mL灌根,30d后测定,未接种鞘氨醇单胞菌HJY的韭菜根部毒死蜱残留量为50.25mg/kg,地上部毒死蜱残留量为15.22mg/kg;而接种鞘氨醇单胞菌HJY的韭菜根部毒死蜱残留量为24.36mg/kg,地上部毒死蜱残留量为3.26mg/kg;
以低剂量药液灌根,未接种鞘氨醇单胞菌HJY韭菜根部毒死蜱残留量为9.57mg/kg,地上部毒死蜱残留量为2.86mg/kg;而接种鞘氨醇单胞菌HJY韭菜根部毒死蜱残留量为2.23mg/kg,地上部毒死蜱残留量为1.05mg/kg。
由上述试验可见,在低剂量下韭菜接种鞘氨醇单胞菌HJY后,与不接种的处理相比,根、茎部毒死蜱降解率分别提高了76.70%和63.29%;高剂量下,韭菜根、茎部毒死蜱降解率分别提高了为51.52%和78.58%;说明鞘氨醇单胞菌HJY接种韭菜后,能够显著增强韭菜降解毒死稗的能力,具有良好的田间应用价值。
Claims (4)
1.一株鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.),其保藏编号为CGMCCNo.11031;所述鞘氨醇单胞菌菌株为革兰氏阴性,菌体直杆状,带有鞭毛,无内生芽孢。
2.如权利要求1所述鞘氨醇单胞菌在增强韭菜中残留毒死蜱降解中的应用。
3.根据权利要求2所述应用,其特征在于,利用HJY菌剂对韭菜进行浸根处理,用以增强韭菜中残留毒死蜱的降解;
所述HJY菌剂是这样获得的:
A)将如权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌接种至LB培养基,30℃划线、挑单菌落培养两次后,挑取单菌落于菌种活化培养基中,30℃,150-200rpm摇床振荡培养12-24h,获得活化菌种;
B)向装有种子培养基的发酵罐接种活化菌种,接种量为种子培养基体积的1%,25-38℃,通空气培养16-24h,得到液体种子;
C)向装有种子培养基的发酵罐接种液体种子,接种量为种子培养基体积的1%,30-35℃,150rpm下避光培养至对数生长期,得到活菌体培养物;
D)取活菌体培养物50ml于4℃、5000rpm下离心15min,取沉淀菌体用无菌生理盐水冲洗3次,再用无菌生理盐水调节至菌含量为1010cfu/mL,即获得HJY菌剂;
LB培养基:胰蛋白胨10g,酵母粉5g,氯化钠10g,琼脂20g,加水至1L,121℃灭菌20min;
菌种活化培养基:胰蛋白胨10g,酵母粉5g,氯化钠10g,加水至1L,121℃灭菌20min;
种子培养基:K2HPO44.8g,KH2PO43.5g,(NH4)2SO42g,MgCl20.16g,CaCl20.02g,Na2MoO4.2H2O0.0024g,FeCl30.0018g,MnCl2.2H2O0.0015g,pH=7.0,加水至1L,121℃灭菌20min。
4.如权利要求3所述应用,其特征在于,在韭菜移栽前,将韭菜根浸没于HJY菌剂稀释液中,浸泡24h后再进行田间移栽;
所述HJY菌剂稀释液是由无菌生理盐水将HJY菌剂稀释至含菌量为103-104cfu/mL后获得。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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