CN115491325A - 一种耐金属贪铜菌及应用方法 - Google Patents

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CN115491325A CN202210802121.2A CN202210802121A CN115491325A CN 115491325 A CN115491325 A CN 115491325A CN 202210802121 A CN202210802121 A CN 202210802121A CN 115491325 A CN115491325 A CN 115491325A
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Abstract

本发明公开了一种耐金属贪铜菌及应用方法，耐金属贪铜菌原始编号ZM02，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC AB 2019263；耐金属贪铜菌应用于在重金属胁迫下降解；重金属包括铜、银、锰和锌中至少一种；耐金属贪铜菌为革兰氏阴性菌，无内生孢子形成；耐金属贪铜菌通过化能异养，不需要氧气，不需要光照；耐金属贪铜菌通过周生鞭毛运动，兼性厌氧；耐金属贪铜菌为乳白偏黄，圆形，湿润，边缘整齐，不透明；耐金属贪铜菌用于制备土壤修复剂；耐金属贪铜菌的分离基物为工厂废水及活性污泥；耐金属贪铜菌的保存方法为真空冷冻干燥法。本发明为生物法净化含1,4‑D、四氢呋喃的废水及废气的工程应用奠定了基础。

Description

一种耐金属贪铜菌及应用方法
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种耐金属贪铜菌及应用方法。
背景技术
1，4-二氧六环(1,4-Dioxane，1,4-D)，又称二恶烷，是一种含有两个对称醚键的典型含氧杂环化合物。1，4-D常被用为氯化溶剂(如三氯乙烷，二氯乙烯)工业生产中的稳定剂，近年来则被广泛用作生产各种有机日用品如油漆、防冻剂、除臭剂、洗涤剂、化妆品等的溶剂。1,4-D独特的化学结构使其具有高度水溶性、中度挥发性、抗生物降解性以及低吸附性，能够迅速从土壤迁移至地下水，从而导致1，4-D广泛存在于地下水、地表水乃至饮用水中，造成持久性的污染。1，4-D是人工合成的异生物质代表之一，其理化性质稳定，可长期积累在环境中造成污染。因1，4-D在工业生产中的重要性，研究其微生物降解具有重要的环境意义。
微生物修复是微生物通过同化作用将污染物降解为小分子物质，最终分解为CO2和H2O的一种生物方法，具有成本低、效能高及环境污染小等特点，是去除环境污染的有效手段。污染物实际修复环境复杂，其中重金属离子胁迫会导致功能微生物生长代谢活性显著下降，严重影响污染物降解效率。因此，如何解决目前重金属胁迫下降解1，4-D效率低下成为目前亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种耐金属贪铜菌及应用方法，旨在解决目前微生物培养效率低下的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供一种耐金属贪铜菌及应用方法，技术方案为：
一种可高效降解1，4-D的耐金属贪铜菌ZM02，所述耐金属贪铜菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC AB 2019263。
进一步地，所述耐金属贪铜菌应用于在重金属胁迫下降解所述1，4-D菌株；
进一步地，所述重金属包括铜、银、锰和锌中至少一种；
进一步地，所述耐金属贪铜菌为革兰氏阴性菌，无内生孢子形成；
进一步地，所述耐金属贪铜菌通过化能异养，不需要氧气，不需要光照；
进一步地，所述耐金属贪铜菌通过周生鞭毛运动，兼性厌氧；
进一步地，所述耐金属贪铜菌为乳白偏黄，圆形，湿润，边缘整齐，不透明；
进一步地，所述耐金属贪铜菌的分离基物为工厂废水及活性污泥；
进一步地，所述半透膜为聚四氟乙烯膜；
进一步地，所述耐金属贪铜菌的保存方法为真空冷冻干燥法。
本发明所提供的1，4-D降解菌C.metallidurans ZM02来源于某污水处理厂活性污泥，经人工驯化、富集和分离所得。该菌株是一株革兰氏阴性菌。
本发明公开了一种耐金属贪铜菌及应用方法，耐金属贪铜菌原始编号 ZM02，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC AB 2019263；耐金属贪铜菌应用于在重金属胁迫下降解；重金属包括铜、银、锰和锌中至少一种；耐金属贪铜菌为革兰氏阴性菌，无内生孢子形成；耐金属贪铜菌通过化能异养，不需要氧气，不需要光照；耐金属贪铜菌通过周生鞭毛运动，兼性厌氧；耐金属贪铜菌为乳白偏黄，圆形，湿润，边缘整齐，不透明；耐金属贪铜菌用于制备土壤修复剂；耐金属贪铜菌的分离基物为工厂废水及活性污泥；耐金属贪铜菌的保存方法为真空冷冻干燥法。本发明为生物法净化含 1,4-D、四氢呋喃的废水及废气的工程应用奠定了基础。
附图说明
图1为本发明实施例方案中涉及的一种耐金属贪铜菌及应用方法中耐金属贪铜菌的菌落形态。
具体实施方式
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如下为第一实施例，菌株的分离和鉴定：
1.1ZM02耐金属贪铜菌1，4-D的分离
ZM02耐金属贪铜菌1，4-D的分离包括取样，富集和初筛，复筛3个步骤，具体如下：
1.1.1取样
样品取自来源于哈尔滨市某污水处理厂活性污泥中，将污水处理厂的活性污泥存于无菌袋中，做好标记，并且在常温下带回实验室，于4℃冰箱中保存备用。
①分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的细菌的分离。先用接种环挑取标本涂布于琼脂平板A区(占培养基总面积的1/4)并作数条划线，再于 B、C、D区依次划线。每划完一个区域，均将接种环烧灼灭菌1次，冷后再划下一区域，每一区域的划线均与上一区域的划线交接1～3次。一个成功分区划线的平板，培养后分别观察A区形成菌苔，B区菌落连成线，C区和D区可分离到单个菌落。
②连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养。方法是先将接种物在琼脂平板上1/5处轻轻涂抹，然后再用拭子或接种环在平板表面曲线通过连续划线的方法进行接种，直至划满琼脂平板表面。
在一示例性的实施方式中，还可以采用琼脂斜面接种法培养污泥中的细菌，琼脂斜面接种法主要用于菌落的移种，以获得纯种进行鉴定和保存菌种等。用拭子或接种环挑取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。生化鉴定培养基斜面接种，用接种针挑取待鉴定细菌的菌落，从斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折划线接种。
1.1.2富集和初筛
称取污泥100g于灭菌的玻璃瓶中，加入1ml浓度为100mM的酒石酸锑钾，轻轻搅匀置25℃恒温箱中富集培养7天，过程中注意补加无菌水，确保样品保持原始湿度；
称取上述富集的污泥10g于装有90ml无菌生理盐水的三角瓶中，于25℃摇床以180r/min振荡培养25min，再按梯度稀释到10-3，10-4，10-5，分别取各个梯度的稀释液0.1ml涂布含100μM C8H4K2O12Sb2.3H2O的CDM选择性平板上，每个稀释度涂布3个平板，置于28℃恒温培养箱中培养7d后，观察有无单菌落出现，挑取单菌落多次划线确保得到纯培养。
1.1.3复筛
将1.1.2得到的菌株在培养基中，30℃，140rpm，培养36h。而后对其发酵液进行检查，取发酵液按梯度稀释涂于含5mM Sb3+的固体培养基中，30℃培养箱中倒置培养3天，挑选较大的菌株多次分离传代，分离得到了一株抗重金属能力较高的菌株。对上述分离纯化得到的纯培养菌株进行一系列生理生化鉴定，并进行DNA提取，16S rDNA的扩增和测序，结果如图1所示。
1.2ZM02耐金属贪铜菌1，4-D的鉴定
对上述分离纯化得到的纯培养菌株进行一系列生理生化鉴定，并进行DNA 提取，16S rDNA的扩增和测序。该菌株在CDM固态培养基上乳白偏黄、圆形，湿润，边缘整齐，不透明。镜检显示短杆状、无芽孢的革兰氏阴性细菌。
在一示例性的实施方式中，对于微生物群落的高通量测序方法可以采用扩增子测序技术。扩增子测序技术是基于微生物基因组的特征性序列(如细菌的16S rDNA，真菌的ITS等)进行测序和分类。它的测序范围只是通过扩增检测微生物基因组上的特征性区域(如，16S rDNA上的某些高变区域)，研究目的也倾向于物种的分类识别和相对丰度统计。多样性项目有一个特点，靶向性明确。根据引物来确定需要研究的微生物类群，一对引物只针对样本中的细菌，或真菌，或某一类微生物群落。
本实施例提供一株可在重金属胁迫逆境下高效降解1，4-二氧六环(1， 4-Dioxane，1，4-D)的耐金属贪铜菌(Cupriavidurans metallidurans)ZM02，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC AB 2019263。本发明提供的1，4-D降解菌为好氧革兰氏染色阴性菌，能够以1，4-D为唯一碳源和能源生长。该菌株具有强重金属离子耐受性，在1mMCu2+、Fe2+、Cd2+、Pb2+、 Cr6+、Co2+、Ag+、Zn2+和Mn2+等重金属离子胁迫下仍具有高效的1,4-D降解能力。该菌株具有广泛的降解底物范围，还能利用四氢呋喃、苯酚、邻苯二酚、间苯酚、对苯酚、1，4-丁二醇、苯、甲苯、苯甲酸、三氯乙烷和二氯乙烯作为唯一碳源生长。
本发明公开了一种耐金属贪铜菌及应用方法，耐金属贪铜菌原始编号 ZM02，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC AB 2019263；耐金属贪铜菌应用于在重金属胁迫下降解；重金属包括铜、银、锰和锌中至少一种；耐金属贪铜菌为革兰氏阴性菌，无内生孢子形成；耐金属贪铜菌通过化能异养，不需要氧气，不需要光照；耐金属贪铜菌通过周生鞭毛运动，兼性厌氧；耐金属贪铜菌为乳白偏黄，圆形，湿润，边缘整齐，不透明；耐金属贪铜菌用于制备土壤修复剂；耐金属贪铜菌的分离基物为工厂废水及活性污泥；耐金属贪铜菌的保存方法为真空冷冻干燥法。本发明为生物法净化含 1,4-D、四氢呋喃的废水及废气的工程应用奠定了基础。
在第二实施例中，ZM02耐金属贪铜菌1，4-D在重金属锑胁迫下溶磷能力体现为有效磷浓度为501.63士22.47mg/l。
ZM02耐金属贪铜菌1，4-D合成生长激素IAA含量的测定。
通过使用Salkowski法对1，4-D菌株进行产IAA定量检测，在含有0.5g/l 色氨酸的LB液体培养基中，25℃、140rmp条件下培养36h，用分光光度计测定OD535,利用IAA标准曲线计算各处理的IAA。实验发现，2mM Sb3+和10mM Sb3 胁迫对菌株产IAA的能力并没有很大影响，IAA浓度与对照组相差不大，基本稳定在94.75μg/ml左右，培养36h左右，产IAA浓度已经趋于饱和，往后继续培养未见其含量上升步骤S30，基于所述目标培养基，培养活性单细胞，获得新物种菌落。
于含10mM Sb3+的液体NBRIP液体培养基中，设置不加菌、加菌、不加 Ca3(PO4)2对照,每个处理3个重复。处理组接种1％处于对数期S-8-2菌液, 接种后28℃、120rmp/min条件下培养72小时,培养液经8000rpm，离心l5min, 取上清液，上清液过0.22pm孔径滤膜后,用钼蓝法测定速效磷浓度。结果表明:接种S-8-2菌株的有效磷浓度为501.63±22.47mg/l,而无菌对照组仅为 3.05±0.11mg/l,处理组对Ca--P的活化能力是无菌对照的164倍。
第三实施例中，菌种的培养包括:
⒈孢子制备
⑴放线菌孢子的制备
一般采用琼脂斜面培养基,培养基中含有一些适合产孢子的营养成分,如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。碳源和氮源不要太丰富(碳源约为 1％,氮源不超过0.5％),碳源丰富容易造成生理酸性的营养环境,不利于放线菌孢子的形成,氮源丰富则有利于菌丝繁殖而不利于孢子形成。一般情况下,干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。放线菌斜面的培养温度大多数为28℃,少数为37℃,培养时间为5～14天。
⑵产品仅限用于科研霉菌孢子的制备
霉菌的孢子培养,一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。这是由于这些农产品中的营养成分较适合霉菌的孢子繁殖,而且这类培养基的表面积较大,可获得大量的孢子。霉菌的培养一般为25～28℃,培养时间为4～14天。
⒉种子制备
⑴摇瓶种子制备
摇瓶种子进罐,常采用母瓶、子瓶两级培养,有时母瓶种子也可以直接进罐。种子培养基要求比较丰富和完全,并易被菌体分解利用,氮源丰富有利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓,子瓶培养基浓度比母瓶略高,更接近种子罐的培养基配方。
⑵种子罐种子制备
种子罐种子制备的工艺过程,因菌种不同而异,一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。孢子(或摇瓶菌丝)被接入到体积较小的种子罐中, 经培养后形成大量的菌丝,这样的种子称为一级种子,把一级种子转入发酵罐内发酵,称为二级发酵。如果将一级种子接入体积较大的种子罐内,经过培养形成更多的菌丝,这样制备的种子称为二级种子,将二级种子转入发酵罐内发酵,称为三级发酵。同样道理,使用三级种子的发酵,称为四级发酵。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种耐金属贪铜菌及应用方法，其特征在于，一种可高效降解1，4-D的耐金属贪铜菌ZM02，所述耐金属贪铜菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC AB 2019263。
2.根据权利要求1所述的耐金属贪铜菌及应用方法，其特征在于，所述耐金属贪铜菌应用于在重金属胁迫下降解所述1，4-D菌株。
3.根据权利要求2所述的耐金属贪铜菌及应用方法，其特征在于，所述重金属包括铜、银、锰和锌中至少一种。
4.根据权利要求1所述的耐金属贪铜菌及应用方法，其特征在于，所述耐金属贪铜菌为革兰氏阴性菌，无内生孢子形成。
5.根据权利要求1所述的耐金属贪铜菌及应用方法，其特征在于，所述耐金属贪铜菌通过化能异养，不需要氧气，不需要光照。
6.根据权利要求1所述的耐金属贪铜菌及应用方法，其特征在于，所述耐金属贪铜菌通过周生鞭毛运动，兼性厌氧。
7.根据权利要求1所述的耐金属贪铜菌及应用方法，其特征在于，所述耐金属贪铜菌为乳白偏黄，圆形，湿润，边缘整齐，不透明。
8.根据权利要求1所述的耐金属贪铜菌及应用方法，其特征在于，所述耐金属贪铜菌用于制备土壤修复剂。
9.根据权利要求6所述的耐金属贪铜菌及应用方法，其特征在于，所述耐金属贪铜菌的分离基物为工厂废水及活性污泥。
10.根据权利要求1所述的耐金属贪铜菌及应用方法，其特征在于，所述耐金属贪铜菌的保存方法为真空冷冻干燥法。
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