CN112877243B - 一种降解乙酰甲胺磷的湖生戴尔福特菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种降解乙酰甲胺磷的湖生戴尔福特菌(Delftia lacustris)RJJ‑61及其应用，属于生物技术领域。实验证明，本发明的乙酰甲胺磷降解菌RJJ‑61可以在乙酰甲胺磷为唯一碳源的环境中存活，具有很高的乙酰甲胺磷降解活性。本发明所提供的乙酰甲胺磷降解菌RJJ‑61可以应用于污染环境中的乙酰甲胺磷降解，在水处理和土壤修复方面具有很好的应用价值。

Description

一种降解乙酰甲胺磷的湖生戴尔福特菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为一种降解乙酰甲胺磷的戴尔福特菌及其对土壤或废水中含乙酰甲胺磷降解领域的应用。

背景技术

乙酰甲胺磷是一种有机磷类杀虫剂，具有低毒、广谱、内吸性强、持效期长等特点，适用于蔬菜、茶叶、烟草、果树、棉花、水稻、小麦等作物，防止多种咀嚼式、刺吸式口器害虫和害螨。纯品为白色结晶，熔点为91℃。工业品为白色固体，纯度80-90％，易熔于水、甲醇、乙醇、丙酮等极性溶剂和二氯甲烷、二氯乙烷等卤代烃类。在苯、甲基苯环与二甲基苯环的混合溶液中溶解度较小，且在碱性介质中极易分解。

农药的生产及使用是乙酰甲胺磷污染的主要来源。由于乙酰甲胺磷过量使用，导致土壤、水体等自然环境被严重污染。同时对多种土壤有益微生物产生抑制作用，农药在土壤中的积累过程逐渐占据优势，破坏了土壤的自然动态平衡，导致土壤自然正常功能失调，土壤性质恶化，影响植物的生长发育，造成农产品产量和质量下降。由于本品属有机磷酸酯类农药，该类农药抑制体内胆碱酯酶，造成神经生理功能紊乱，同时其菌体降解物会在动物体内富集，人类食用后便最终会在人体内富集，严重危害人体健康。因而长期以来，科研人员一直在积极寻求一种经济、高效的处理方法。

修复该污染目前所用的方法，有物理降解法和化学降解法。物理修复法主要采用物理筛分将污染土壤分为不同粒级，粗粒级组分污染物浓度低，细粒级组分污染物浓度高，具有流程简单易于工程实现等优点，但缺点是只能处理一些粒级差别比较大、污染物浓度较低的污染土壤，对于细粒级组分较多、污染土不适用。化学修复是采用化学法将土壤中污染区分离去除的技术，其主要方法是化学淋洗将污染物从土壤中分离的过程，该方法工艺简单，成本低，见效快，但缺点是需要采用化学淋洗剂容易造成二次污染，对结构紧实的土壤处理效果较差。

采用微生物修复法操作简单、经济且环境友好，微生物作为生物修复中的主体，对农药残留的降解起着重要作用。人们对农药降解微生物的研究至今已取得了很大进展,表现在降解农药的微生物种类不断被发现，降解机理日趋深入，降解效果稳定提高等方面。本研究从教学试验田地表土壤中，分离筛选有机磷类高效降解菌，并对其进行降解特性的研究，微生物将乙酰甲胺磷作为其生长所需的碳源和能源，并在酶的作用下水解成简单化合物，最终降解为无害的代谢产物。在节省很多治理费用的同时，对环境影响小，最终产物不会形成二次污染，对污染位点的干扰及破坏达到最小程度，积极响应国家走可持续发展道路的号召。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种乙酰甲胺磷降解菌，即湖生戴尔福特菌(Delftia lacustris)RJJ-61及其应用，以及降解乙酰甲胺磷的方法、乙酰甲胺磷降解菌干粉剂。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种降解乙酰甲胺磷的菌种，分类命名为戴尔福特菌(Delftia lacustris)，该湖生戴尔福特菌(D.lacustris)RJJ-61，已于2019年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC NO. 19233。

本发明的第二个目的是提供了上述湖生戴尔福特菌(D.lacustris)RJJ-61在制备用于乙酰甲胺磷降解的制剂中的应用。

本发明的第三个目的是提供了上述湖生戴尔福特菌(D.lacustris)RJJ-61在制备用于乙酰甲胺磷环境污染后修复的制剂中的应用。

本发明的第四个目的是提供了上述湖生戴尔福特菌(D.lacustris)RJJ-61在制备用于乙酰甲胺磷残留污染后土壤修复的制剂中的应用。

本发明的第五个目的是提供了上述湖生戴尔福特菌(D.lacustris)RJJ-61在制备用于乙酰甲胺磷残留污染后水体修复的制剂中的应用。

本发明的第六个目的是提供了一种降解乙酰甲胺磷的方法，将上述的湖生戴尔福特菌(D.lacustris)RJJ-61接种于含有乙酰甲胺磷的体系中培养，即可实现降解乙酰甲胺磷。

进一步的，上述的一种降解乙酰甲胺磷的方法，所述培养温度为30℃，培养时间为6d，PH为7。

进一步的，将上述菌种扩大培养后干燥处理得到干粉，与秸秆碳化制备的活性炭混合后形成制剂；所述干粉与活性炭的质量比为1:1；所述制剂的用量为每亩100千克。

本发明的第七个目的是提供了一种乙酰甲胺磷降解菌菌剂，所述菌剂中含有上述的湖生戴尔福特菌.RJJ-61。

进一步的，所述菌剂为干粉剂，为菌种扩大培养后，干燥制得。

本发明的第八个目的是提供了上述一种乙酰甲胺磷降解菌干粉剂的制备方法，是将湖生戴尔福特菌.RJJ-61扩大培养后，经过常规方法干燥制得。

本发明通过微生物降解法，即根据首先从污染土壤中取样，对降解菌进行富集筛选获得高效降解菌株，通过分子生物鉴定法确定其种属关系。绘制系统发育树，确定其系统分支和降解基因，并进行降解基因的克隆和相关酶活性的研究，通过对控制PH，温度，底物初始浓度等影响因子考察，以及确定降解产物，测定产物的MSM，根据降解产物确定其降解途径。在节省很多治理费用的同时，对环境影响小，最终产物不会形成二次污染，对污染位点的干扰及破坏达到最小程度，积极响应国家走可持续发展道路的号召。

本发明的有益效果为：

本发明提供的乙酰甲胺磷降解菌及其应用，通过微生物筛选富集，根据乙酰甲胺磷的理化性质，在特定环境条件中筛选得到能够降解乙酰甲胺磷的微生物。最终确定了巨大芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和台湾铜绿假单胞菌，4种能够较为高效降解乙酰甲胺磷的菌株，同时得到危害小，无污染的代谢产物，从而达到乙酰甲胺磷无害化处理的目的。实验证明，本发明的乙酰甲胺磷降解菌RJJ-61能在仅存在乙酰甲胺磷为碳源的特殊环境中存活，达到65％-75％的降解乙酰甲胺磷的效率，相关酶降解乙酰甲胺磷的活性高。本发明所提供的乙酰甲胺磷降解菌RJJ-61可以应用于药企菌渣废物与污染环境中的乙酰甲胺磷降解，在菌渣固废处理和水污染处理方面拥有良好的实际应用价值。

上述的该乙酰甲胺磷降解菌的筛选方法，步骤如下：

称取一定量菌渣，加入生理盐水，稀释10倍。取1mL上清液，加入9mL 无菌水梯度稀释，稀释至10000倍，取上清液加入含乙酰甲胺磷的MSM无菌培养基，置于30℃、170rpm摇床中培养6天。将上述所得上清液均匀涂布在含乙酰甲胺磷的MSM固体培养基上，然后放入35℃培养箱培养4-6天，在LB平板上划线分离，得到乙酰甲胺磷降解菌RJJ-61(图1)。

将降解菌株分别接种于LB液体培养基进行纯培养，然后用无菌水洗涤2次，将菌液浓度调节至OD₆₀₀＝2.0。然后吸取1mL菌液加入于100mL以200mg·L^-1乙酰甲胺磷作为唯一碳源的基础盐培养基中，170r·min^-1、30℃摇床富集培养。每24h取样5mL，用HPLC测定乙酰甲胺磷含量。

菌株鉴定

采用振荡破碎法获得乙酰甲胺磷降解菌RJJ-61基因组DNA，通过PCR方法对菌株16S rRNA基因进行扩增并送至上海捷瑞生物公司进行测序分析；用于扩增16S rRNA基因的上游引物序列为：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’，下游引物序列为5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’。

PCR反应条件是：95℃预变性5min，96℃变性30s，55℃退火30s， 72℃延伸50s，反应32个循环，72℃延伸3min。使用NCBI的BLAST功能在GeneBank数据库中进行序列比对，分析菌株的分类为：湖生戴尔福特菌 (Delftia lacustris)(图2)。

乙酰甲胺磷降解菌RJJ-61的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

附图说明

图1为该乙酰甲胺磷降解菌RJJ-61单菌落形态图。

图2为乙酰甲胺磷降解菌RJJ-61系统发育树。

图3为乙酰甲胺磷降解菌RJJ-61在基础液体无机盐培养基中对乙酰甲胺磷的降解率。

图4为乙酰甲胺磷降解菌RJJ-61在农田土壤中对乙酰甲胺磷的降解率。

图5为乙酰甲胺磷降解菌RJJ-61在含乙酰甲胺磷的废水中对乙酰甲胺磷的降解率。

图6为不同温度和PH条件下乙酰甲胺磷降解菌RJJ-61对乙酰甲胺磷的降解率。

具体实施方式

(一)主要材料

1、培养基

LB培养基：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，琼脂15.0g，超纯水1000mL。

MSM无机盐培养基：NH₄Cl 0.63g，K₂HPO₄·3H₂O 1.965g，KH₂PO₄ 0.50g， NaNO₃1.00g，MgSO₄ 0.10g，超纯水1000mL。

相对应的固体培养基则在1L液体培养基中添加琼脂粉16.0g配制成。

2、仪器设备

PCR扩增仪(FlexCycler)，Tanon-3500凝胶成像系统，北京市六一仪器厂电泳仪，灭菌锅(GR60DA致微)，英衡电子天平，恒温培养箱(恒LRH-250)，高速冷冻离心机(Eppendorf)，摇床(上海润度Stab M1)，青岛海尔集团的低温冰箱。

(二)乙酰甲胺磷降解测定

1、乙酰甲胺磷标准曲线的绘制

用电子天平称取常州东裕国际贸易有限公司提供的纯度为95.58％的乙酰甲胺磷原药1.0g，将其溶于1000mL的超纯水中，用10mL的离心管分别稀释至 50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L和250mg/L，用1mL注射器和水样滤膜将稀释好的乙酰甲胺磷溶液滤入进样瓶中，通过高效液相色谱法(HPLC) 测定乙酰甲胺磷的峰面积，并用Excel绘制标准样品曲线。

2、乙酰甲胺磷降解率测定方法

高效液相色谱法(HPLC)程序设置如下：

(1)色谱柱：C18(4.6*250mm)；

(2)流速：0.25mL/min；

(3)进样体积：10μL；

(4)柱温：30℃；

(5)检测波长：223nm；

(6)流动相：A：98/2＝水/甲醇+0.1％甲酸

B：甲醇+0.1％甲酸

(7)流动相采用梯度洗脱

标准曲线为y(峰面积)＝0.0458x(乙酰甲胺磷浓度)-0.0052

(三)下面为具体实施例部分

实施例1

将乙酰甲胺磷降解菌RJJ-61在LB液体培养基中培养，离心收集菌体，用无菌生理盐水重悬，并稀释至OD₆₀₀＝2.0，将所选菌株接种1mL到100.0mL含 200mg乙酰甲胺磷的基础液体无机盐培养基中，置于恒温摇床中170r/min， 30℃培养6天，每天取样测定乙酰甲胺磷浓度，并测定降解率为：82.25±2.86％ (图3)。

实施例2

将乙酰甲胺磷降解菌RJJ-61按2.5*10⁸的接种量接种于150g灭菌的农田土壤中，并加入150mg乙酰甲胺磷，于30℃条件下培养6天，经测定，测定降解率为：57.78±0.7％(图4)。

实施例3

将乙酰甲胺磷降解菌RJJ-61按2.5*10⁸的接种量接种于150mL灭菌的含乙酰甲胺磷的废水中，经测定该废水的乙酰甲胺磷浓度为120mg/L，于30℃条件下培养6天，测定乙酰甲胺磷降解率为：76.02±1.4％(图5)。

实施例4

乙酰甲胺磷降解菌RJJ-61干粉剂的制备，乙酰甲胺磷降解菌RJJ-61扩大培养后，经过常规方法干燥制得。

序列表

<110> 常州大学

<120> 一种降解乙酰甲胺磷的湖生戴尔福特菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1396

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgcaagtcga acggtaacag gtcttcggac gctgacgagt ggcgaacggg tgagtaatac 60

atcggaacgt gcccagtcgt gggggataac tactcgaaag agtagctaat accgcatacg 120

atctgaggat gaaagcgggg gaccttcggg cctcgcgcga ttggagcggc cgatggcaga 180

ttaggtagtt ggtgggataa aagcttacca agccgacgat ctgtagctgg tctgagagga 240

cgaccagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 300

attttggaca atgggcgaaa gcctgatcca gcaatgccgc gtgcaggatg aaggccttcg 360

ggttgtaaac tgcttttgta cggaacgaaa aagctccttc taatacaggg ggcccatgac 420

ggtaccgtaa gaataagcac cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt 480

gcgagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgtgcgca ggcggttatg taagacagat 540

gtgaaatccc cgggctcaac ctgggaactg catttgtgac tgcatggcta gagtacggta 600

gagggggatg gaattccgcg tgtagcagtg aaatgcgtag atatgcggag gaacaccgat 660

ggcgaaggca atcccctgga cctgtactga cgctcatgca cgaaagcgtg gggagcaaac 720

aggattagat accctggtag tccacgccct aaacgatgtc aactggttgt tgggaattag 780

ttttctcagt aacgaagcta acgcgtgaag ttgaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt 840

tgaaactcaa aggaattgac ggggacccgc acaagcggtg gatgatgtgg tttaattcga 900

tgcaacgcga aaaaccttac ccacctttga catggcagga agtttccaga gatggattcg 960

tgctcgaaag agaacctgca cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1020

tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtcatt agttgctaca ttcagttgag 1080

cactctaatg agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcctca 1140

tggcccttat aggtggggct acacacgtca tacaatggct ggtacagagg gttgccaacc 1200

cgcgaggggg agctaatccc ataaaaccag tcgtagtccg gatcgcagtc tgcaactcga 1260

ctgcgtgaag tcggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc 1320

gggtcttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagcgggt ctcgccagaa gtagcgtagc 1380

ctaaccgcat aggagg 1396

Claims (5)

1.戴尔福特菌（Delftia lacustris）在修复乙酰甲胺磷污染后土壤或水体中的应用，所述戴尔福特菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年12月23日，菌种保藏号为CGMCC NO.19233。

2.戴尔福特菌（Delftia lacustris）在制备用于乙酰甲胺磷降解的制剂中的应用，所述戴尔福特菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年12月23日，菌种保藏号为CGMCC NO.19233。

3.一种降解乙酰甲胺磷的方法，其特征在于，将戴尔福特菌（Delftia lacustris）在含有乙酰甲胺磷的体系中培养，所述戴尔福特菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年12月23日，菌种保藏号为CGMCC NO.19233。

4.根据权利要求3所述的降解乙酰甲胺磷的方法，其特征在于，所述培养温度为30℃，培养时间为6 d，pH为7。

5.根据权利要求3所述的降解乙酰甲胺磷的方法，其特征在于，将所述戴尔福特菌扩大培养后干燥处理得到干粉，与秸秆碳化制备的活性炭混合后形成制剂；所述干粉与活性炭的质量比为1:1；所述制剂的用量为每亩100千克。

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