CN103773710B - 一种乙酰甲胺磷降解芽孢杆菌j1及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种乙酰甲胺磷降解芽孢杆菌J1及应用，属于生物技术领域。该菌株在中国普通微生物保藏管理中心的保藏号为：CGMCC？NO.7793;其序列如SEQ？ID？NO.1所述。实验证明，本发明的乙酰甲胺磷降解芽孢杆菌可以在乙酰甲胺磷为唯一碳源的环境中存活，可在1200mg/L乙酰甲胺磷固体和液体培养基中生长良好，在乙酰甲胺磷含量为150mg/L到1200mg/L浓度范围的液体培养基中，芽孢杆菌J1在72h对于乙酰甲胺磷降解率均达到60%以上，具有很高的乙酰甲胺磷降解活性。本发明所提供的一种乙酰甲胺磷降解芽孢杆菌可广泛应用于污染环境中的乙酰甲胺磷降解，在环境修复方面具有好的应用价值。

Description

一种乙酰甲胺磷降解芽孢杆菌J1及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种乙酰甲胺磷降解芽孢杆菌J1及应用。
背景技术
我国全面禁止在农业生产中使用甲胺磷、甲基对硫磷、磷胺等高毒性农药。乙酰甲胺磷由于具有高效、低毒性的特点，已作为高毒性农药的替代品被广泛应用蔬菜、果树等农作物的病虫害防治中，其产量也在逐年增加。虽然乙酰甲胺磷比甲胺磷等传统有机磷农药毒性低，但由于其广泛使用，也存在着环境污染和农药残留的问题。因此，如何降低乙酰甲胺磷的污染和残留问题已成为理论研究和技术开发的焦点。
微生物是地球生态环境中的重要类群，由于其种类繁多、生境各异，其生理代谢特点也多种多样，土壤有机污染物主要靠微生物来降解，很多污染物的修复技术已经着眼于利用微生物类群的降解作用。利用微生物的代谢作用降解各类人工合成的农药，使其转化成无污染的无机物，是当前研究的热点，也是最有前景的应用开发领域。从环境中分离筛选高效降解乙酰甲胺磷农药的细菌，对消除农药污染、净化环境有着重大的现实意义。
发明内容
鉴于上述和/或现有乙酰甲胺磷降解中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明其中一个目的是提供一种乙酰甲胺磷降解芽孢杆菌J1。
为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种乙酰甲胺磷降解芽孢杆菌J1，已于2013年6月21日保存至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，所述菌株的保藏号为：CGMCCNO.7793；分类命名为芽孢杆菌Bacilussp.，菌株的16SrDNA序列如SEQIDNO.1所述。
作为本发明所述乙酰甲胺磷降解芽孢杆菌J1的一种优选方案，其中：由下述方法制得：
（1）从长期受乙酰甲胺磷污染的土壤中分离样品，加入100mL液体LB培养基中，以140r/min转速于30℃培养24h;所述LB液体培养基成份为：每1L蒸馏水中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g；
（2）将培养物接种到乙酰甲胺磷降解菌筛选培养基，于培养温箱中培养2d，筛选乙酰甲胺磷降解菌株，所述乙酰甲胺磷降解菌筛选培养基成份为：每1L培养基中含有乙酰甲胺磷150mg，NaCl0.5g，KH2PO40.5g，Na2HPO41.5g，MgSO40.5g，NH4NO31g，FeCl30.015g，CaCl20.005g，琼脂粉12g，以蒸馏水补足体积至1L；
（3）观察记录菌的生长情况，筛选获得乙酰甲胺磷降解菌株。
作为本发明所述乙酰甲胺磷降解芽孢杆菌J1的一种优选方案，其中：所述16SrDNA序列获得方法是：使用PCR方法扩增菌株16SrDNA并分析序列；用于扩增16SrDNA的上游引物序列为：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,下游引物序列为：GGTTACCTTGTTACGACTT。
本发明的另一个目的是将乙酰甲胺磷降解芽孢杆菌J1应用于乙酰甲胺磷降解。
为解决上述技术问题，根据本发明的另一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种乙酰甲胺磷降解芽孢杆菌J1在环境中对乙酰甲胺磷降解的应用。
本发明的有益效果是:用含有乙酰甲胺磷为唯一碳源的筛选培养基，从长期受乙酰甲胺磷污染的土壤中分离获得乙酰甲胺磷降解芽孢杆菌J1，经降解分析表明，该菌株可以在乙酰甲胺磷为唯一碳源的环境中存活，可在1200mg/L乙酰甲胺磷固体和液体培养基中生长良好，具有很高的乙酰甲胺磷降解活性的特点。该乙酰甲胺磷降解芽孢杆菌J1将在环境中乙酰甲胺磷降解、环境污染修复中具有应用潜力。
附图说明
图1是乙酰甲胺磷降解芽孢杆菌J1的菌落照片图。
图2是菌株J1的16SrDNA的琼脂糖凝胶电泳图（1：Marker，从上到下一次大小为2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp；2：16SrDNA）。
图3菌株J1在不同浓度乙酰甲胺磷中的生长曲线图。
具体实施方式
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
1、主要材料
（1）培养基
每1L的150mg/L、300mg/L、600mg/L、1200mg/L乙酰甲胺磷液体体培养基成份：分别加入乙酰甲胺磷150mg、300mg、600mg、1200mg，然后在加入NaCl0.5g，KH2PO40.5g，Na2HPO41.5g，MgSO40.5g，NH4NO31g，FeCl30.015g，CaCl20.005g，配制成不同浓度的溶液。用HCl或NaOH调节pH等于7.0。对于相应的1L固体培养基则在1L液体培养基中添加琼脂粉12g配制成。
（2）仪器设备
美国ABI公司PCR扩增仪，美国BIO-RAD公司GelDocXR+凝胶成像系统，北京市六一仪器厂DYY-12型电泳仪，上海博讯实业有限公司医疗设备厂YXQ-LS-75立式压力蒸汽灭菌锅，上海越平科学仪器有限公司FA2004电子天平，上海精宏实验设备有限公司DNP-9162型电热恒温培养箱，德国SIGMA公司Sigma3-16pk台式高速冷冻离心机，常州国华电器有限公司YXJ-2高速离心机，常州国华电器有限公司低速离心机，上海精密科学仪器有限公司7230G可见分光光度计，上海欣蕊自动化设备有限公司HYG型摇床，日本三洋电子有限公司超低温冰箱，青岛海尔集团Haier冰箱。
2、乙酰甲胺磷降解芽孢杆菌J1的筛选
（1）从长期受乙酰甲胺磷污染的土壤中分离样品，加入100mL液体LB培养基中，以140r/min转速于30℃培养24h；
（2）将培养物接种到乙酰甲胺磷降解菌筛选培养基，于培养温箱中培养2d，筛选乙酰甲胺磷降解菌株，所述乙酰甲胺磷降解菌筛选培养基成份为：每1L培养基中含有乙酰甲胺磷150mg，NaCl0.5g，KH2PO40.5g，Na2HPO41.5g，MgSO40.5g，NH4NO31g，FeCl30.015g，CaCl20.005g，琼脂粉12g，以蒸馏水补足体积至1L；
（3）观察记录菌的生长情况，筛选获得乙酰甲胺磷降解菌株。
3、菌株鉴定分析
（1）革兰氏染色
将菌体涂布于载玻片；滴加结晶紫(将菌膜覆盖)染色1-2min，用水冲洗；用碘液冲去残水，并用碘液覆盖染色1min，用水冲洗；用滤纸吸去玻片上的水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色20-30s，直至流出的乙醇无紫色时，立即用水冲洗；用番红液复染2min，用水冲洗；干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏阴性菌。
（2）菌株16SrDNA序列分析
采用苯酚：氯仿抽提的方法获得细菌基因组DNA，以PCR方法对菌株16SrDNA基因进行扩增，用于扩增16SrDNA的上游引物序列为：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,下游引物序列为：GGTTACCTTGTTACGACTT。PCR反应条件是：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火60s，72℃延伸，90s，反应22个循环；72℃延伸10min。将菌株16SrDNA产物送“上海生工生物工程技术服务有限公司”测序。使用BLAST程序在GeneBank中进行序列比对，分析菌株的分类。PCR获得16SrDNA的电泳结果见图2。
4、菌株在不同浓度乙酰甲胺磷液体培养基的生长情况
将菌株接种到LB液体培养基中培养过夜，活化菌种；把活化好的菌种按5%的接种量分别接种到乙酰甲胺磷含量为150mg/L、300mg/L、600mg/L、1200mg/L液体培养基中；利用分光光度计在600nm波长下测定菌体在不同浓度培养基中生长情况，记录数据，分析结果，制作出生长曲线见图3。降解菌的生长情况随乙酰甲胺磷的浓度变化而变化，在浓度为1200mg/L时，菌体生长基本不受乙酰甲胺磷的影响，这体现了细菌J1对乙酰甲胺磷的适应性能，适宜做乙酰甲胺磷降解菌株。
5、细菌J1在乙酰甲胺磷降解中的应用
芽孢杆菌J1可以将乙酰甲胺磷转化为磷酸根离子，采用钼蓝比色法测定降解后培养液中PO4 3-的量，可以确定乙酰甲胺磷的降解比率。接种活化后的菌种到培养基内培养一段时间，取1mL培养液加入50mL容量瓶中，再加入5ml钼酸铵溶液和3ml抗坏血酸溶液，补水至50mL刻度并混匀溶液。在28℃保温10min，测定其OD720值，计算出容量瓶内PO4 3-浓度WP，利用公式计算出1mL培养液中降解的乙酰甲胺磷的量。计算公式是：乙酰甲胺磷降解率a=(1000×[(Wp×183)/20×95]/m0)×100%，其中，m0是乙酰甲胺磷初始浓度；95是PO4 3-的分子量；183是乙酰甲胺磷的分子量。
上述实验的结果表明，乙酰甲胺磷含量为150mg/L到1200mg/L浓度范围的液体培养基中，芽孢杆菌J1在72h对于乙酰甲胺磷降解率均达到60%以上。该乙酰甲胺磷降解芽孢杆菌J1可应用于环境中乙酰甲胺磷降解，达到环境修复的目的。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.一种芽孢杆菌J1，所述菌株在中国普通微生物保藏管理中心的保藏号为：CGMCCNO.7793；分类命名为Bacillussp.，菌株的16SrDNA序列如SEQIDNO.1所述。
2.一种如权利要求1所述的芽孢杆菌J1在降解环境中乙酰甲胺磷的应用。
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