CN114369552A - 修复典型异味污染农药场地的混合菌剂及制备方法和应用 - Google Patents

修复典型异味污染农药场地的混合菌剂及制备方法和应用 Download PDF

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CN114369552A CN202210045339.8A CN202210045339A CN114369552A CN 114369552 A CN114369552 A CN 114369552A CN 202210045339 A CN202210045339 A CN 202210045339A CN 114369552 A CN114369552 A CN 114369552A
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Abstract

本发明公开了一种修复典型异味污染农药场地的混合菌剂及制备方法和应用，所述混合菌剂包括用于降解苯的第一高效降解菌，用于降解二甲基二硫醚的第二高效降解菌以及用于降解乙酰甲胺磷的第三高效降解菌。本发明通过三类高效降解菌的混合使用，可以有效的将典型异味污染农药场地中的苯、二甲基二硫醚以及乙酰甲胺磷进行降解去除，从而有效提高对典型异味污染农药场地的修复处理效果。

Description

修复典型异味污染农药场地的混合菌剂及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及土壤修复技术领域，具体是涉及一种修复典型异味污染农药场地的混合菌剂及制备方法和应用。
背景技术
农药品种包括有机氯类、有机磷类和菊酯类等多代农药。农药造成的土壤污染主要发生在农药生产场地和农用地，其中农药生产场地污染土壤具有多代农药混合以及有机溶剂复合污染等特点，这类污染土壤的修复与安全利用是亟待解决的环境问题。
目前，针对典型异味污染农药场地的修复处理大多采用的是化学氧化药剂，化学氧化药剂具有修复时间短和成本低的优点，然而化学氧化药剂缺乏靶向性，过量使用易造成土壤理化性质破坏和二次污染，所以，针对典型异味污染农药场地需要一种绿色修复方式进行修复处理。
采用菌剂降解的方式进行土壤修复，绿色环保，不会造成土壤理化性质破坏和二次污染，但由于典型异味污染农药场地污染复杂，单一菌剂难以高效处理修复典型异味污染农药场地。因此，现需要一种可高效修复典型异味污染农药场地的复合菌剂来解决上述技术问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种修复典型异味污染农药场地的混合菌剂及制备方法和应用。
本发明的技术方案是：一种修复典型异味污染农药场地的混合菌剂，所述混合菌剂包括用于降解苯的第一高效降解菌，用于降解二甲基二硫醚的第二高效降解菌以及用于降解乙酰甲胺磷的第三高效降解菌；
其中，所述第一高效降解菌的分离筛选方法包括以下步骤：
S101、取25g试验土样置于锥形瓶中，并加入100mL的超纯水，放3～5粒玻璃珠，在100～140r/min，25～35℃的恒温摇床上进行震荡混匀；
S102、24h后取出锥形瓶并静置10～15min，吸取0.5mL上清液置于LB固体培养基上，并用玻璃棒进行四周旋转涂抹，将所有的试验土样进行相同操作后，置于恒温培养箱，25～35℃倒置培养48h；
S103、观察LB平板的菌落形态，并且从LB平板上挑取不同的菌落进行单菌落分离，涂布LB平板，培养48h；
S104、经过连续2～4次单菌落分离纯化后，挑取单菌落在LB液体培养基中培养48h，待菌液浑浊，得到第一高效降解菌；
通过上述三类高效降解菌的混合使用，可以有效的将典型异味污染农药场地中的苯、二甲基二硫醚以及乙酰甲胺磷进行降解去除，从而有效提高对典型异味污染农药场地的修复处理效果。
进一步地，所述第一高效降解菌为红球菌；所述第二高效降解菌为枯草芽孢杆菌；所述第三高效降解菌为芽孢杆菌；通过选用红球菌、枯草芽孢杆菌以及芽孢杆菌作为第一、第二、第三高效降解菌，可以有效去除典型异味污染农药场地中的苯、二甲基二硫醚以及乙酰甲胺磷。
本发明还提供了一种修复典型异味污染农药场地的混合菌剂的制备方法，对第一高效降解菌、第二高效降解菌、第三高效降解菌分别进行包覆处理，得到第一高效降解菌小球、第二高效降解菌小球以及第三高效降解菌小球，随后根据典型异味污染农药场地情况按比例将第一高效降解菌小球、第二高效降解菌小球以及第三高效降解菌小球混合得到混合菌剂；由于第一、第二、第三高效降解菌的最优环境条件并不相同，为了使第一、第二、第三高效降解菌均能在所适宜的环境条件下进行污染物的降解处理，对第一、第二、第三高效降解菌采用了包覆处理，从而在混合菌剂投加后，调整对应环境条件即可促进对应菌剂对典型异味污染农药场地降解修复效果。
进一步地，所述包覆处理具体为：利用牛肉膏蛋白胨培养基分别将相同剂量的第一、第二、第三高效降解菌进行固定，并制备成5-10mm粒径的第一、第二、第三固体小球，并对第一固体小球进行电活性聚合物包覆，对第二固体小球进行糯米纸包覆，对第三固体小球进行凝胶包覆，得到第一高效降解菌小球、第二高效降解菌小球和第三高效降解菌小球；根据三类高效降解菌的环境条件线性排列，对三类高效降解菌的修复次序进行先后排序，从而选用了上述三种材料进行第一、第二、第三高效降解菌小球的制备，从而满足三类高效降解菌在对应条件触发时进行菌剂的释放。
更进一步地，所述第一高效降解菌小球的电活性聚合物制备以及包覆方法，具体包括以下步骤：
1)按质量比为5～7：3称取纸浆纤维素和壳聚糖，混合后按照每克混合物添加20～30mL的比例加入三氟乙酸，室温下密封放置5～7天，随后离心分离得到浆液，将浆液倒入浇铸成膜，室温下干燥48h，待用；
2)利用牛肉膏蛋白胨培养基分别将第一高效降解菌进行固定，并制备成5-10mm粒径的第一固体小球，待用；
3)将步骤1)所制备的膜分别通过酸液、碱液浸泡处理2～3h，随后使用去离子水反复冲洗后进行灭菌处理，将灭菌后的膜包覆在第一固体小球上，得到膜包覆后的第一固体小球，
其中，所述酸液为0.1mol/L的HCl水溶液，碱液为0.1mol/L的NaOH水溶液；
4)将膜包覆后的第一固体小球在室温下干燥10～30min，随后对膜包覆所形成的壳衣进行表面喷涂膜电极涂层，并在壳衣上开设若干细缝，得到第一高效降解菌小球；
上述第一高效降解菌小球的制备方法，提供了一种可降解的电活性聚合物，在混合菌剂修复处理时，不会对典型异味污染农药场地产生二次污染，并且对膜包覆所形成的壳衣开设若干细缝，可以配合通电收缩进行第一高效降解菌的释放，从而满足第一高效降解菌在对应条件触发时进行菌剂释放的需求。
进一步地，所述糯米纸选用市售糯米纸，所述凝胶选择琼脂糖凝胶。
本发明还提供了一种修复典型异味污染农药场地的混合菌剂的应用，将混合菌剂应用于典型异味污染农药场地的修复处理。
进一步地，所述修复处理分为三个修复阶段，具体为：
1)第一修复阶段：调控典型异味污染农药场地环境条件在pH＝5，温度为30℃，利用混合菌剂中的第二高效降解菌小球释放第二高效降解菌，对典型异味污染农药场地的二甲基二硫醚进行降解；
2)第二修复阶段：调控典型异味污染农药场地环境条件在pH＝10，温度为30℃，利用混合菌剂中的第一高效降解菌小球释放第一高效降解菌，对典型异味污染农药场地的苯进行降解；
3)第三修复阶段：调控典型异味污染农药场地环境条件在pH≥7，温度为35℃，利用混合菌剂中的第三高效降解菌小球释放第三高效降解菌，对典型异味污染农药场地的乙酰甲胺磷进行降解；
通过在三种环境条件的线性排列，触发释放对应菌剂进行典型异味污染农药场地的修复处理，可以使第一、第二、第三高效降解菌均达到其最优降解效率，从而显著提高混合菌剂对于典型异味污染农药场地的修复处理效果。
更进一步地，所述第二高效降解菌小球释放第二高效降解菌的方法为：在投入典型异味污染农药场地后，第二高效降解菌小球的糯米纸进行自动溶解；
所述第一高效降解菌小球释放第一高效降解菌的方法为：在典型异味污染农药场地插入碳棒并通电后，第一高效降解菌小球的电活性聚合物包覆所形成的壳衣在电流所用下进行收缩使细缝开裂；
所述第三高效降解菌小球释放第三高效降解菌的方法为：在典型异味污染农药场地升温至35℃后，第三高效降解菌小球的凝胶在温度作用下进行溶解；
根据三类高效降解菌的环境条件线性排列，选用上述糯米纸、电活性聚合物以及凝胶作为固体小球的壳衣，可以通过对环境条件等控制，选择对应环境条件下释放对应菌剂进行典型异味污染农药场地，从而提高混合菌剂对典型异味污染农药场地的修复效率。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的混合菌剂通过三类高效降解菌的混合使用，可以有效的将典型异味污染农药场地中的苯、二甲基二硫醚以及乙酰甲胺磷进行降解去除，从而有效提高对典型异味污染农药场地的修复处理效果。
(2)本发明根据混合菌剂三类高效降解菌的环境条件线性排列，将三类高效降解菌分别进行对应材料的包覆处理，从而在混合菌剂投加后，调整对应环境条件即可有效促进对应菌剂对典型异味污染农药场地降解修复效果。
附图说明
图1是本发明不同pH条件下第一高效降解菌对苯的降解率。
图2是本发明不同pH条件下第二高效降解菌对二甲基二硫醚的降解率。
图3是本发明不同外加碳源下第二高效降解菌对二甲基二硫醚的降解率。
图4是本发明不同温度下第二高效降解菌对二甲基二硫醚的降解率。
图5是本发明不同pH条件下第三高效降解菌对乙酰甲胺磷的降解率。
图6是本发明不同金属离子下第三高效降解菌对乙酰甲胺磷的降解率。
图7是本发明不同温度下第三高效降解菌对乙酰甲胺磷的降解率。
具体实施方式
下面结合具体实施方式来对本发明进行更进一步详细的说明，以更好地体现本发明的优势。
实施例1
一种修复典型异味污染农药场地的混合菌剂，所述混合菌剂包括用于降解苯的第一高效降解菌，用于降解二甲基二硫醚的第二高效降解菌以及用于降解乙酰甲胺磷的第三高效降解菌；所述第一高效降解菌为红球菌；所述第二高效降解菌为枯草芽孢杆菌；所述第三高效降解菌为芽孢杆菌；通过选用红球菌、枯草芽孢杆菌以及芽孢杆菌作为第一、第二、第三高效降解菌，可以有效去除典型异味污染农药场地中的苯、二甲基二硫醚以及乙酰甲胺磷；
其中，所述第一高效降解菌的分离筛选方法包括以下步骤：
S101、取25g试验土样置于锥形瓶中，并加入100mL的超纯水，放4粒玻璃珠，在120r/min，30℃的恒温摇床上进行震荡混匀；
S102、24h后取出锥形瓶并静置10min，吸取0.5mL上清液置于LB固体培养基上，并用玻璃棒进行四周旋转涂抹，将所有的试验土样进行相同操作后，置于恒温培养箱，30℃倒置培养48h；
S103、观察LB平板的菌落形态，并且从LB平板上挑取不同的菌落进行单菌落分离，涂布LB平板，培养48h；
S104、经过连续3次单菌落分离纯化后，挑取单菌落在LB液体培养基中培养48h，待菌液浑浊，得到第一高效降解菌；
通过上述三类高效降解菌的混合使用，可以有效的将典型异味污染农药场地中的苯、二甲基二硫醚以及乙酰甲胺磷进行降解去除，从而有效提高对典型异味污染农药场地的修复处理效果。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，与其不同之处在于，对第一高效降解菌、第二高效降解菌、第三高效降解菌分别进行包覆处理，得到第一高效降解菌小球、第二高效降解菌小球以及第三高效降解菌小球，随后根据典型异味污染农药场地情况按比例将第一高效降解菌小球、第二高效降解菌小球以及第三高效降解菌小球混合得到混合菌剂；由于第一、第二、第三高效降解菌的最优环境条件并不相同，为了使第一、第二、第三高效降解菌均能在所适宜的环境条件下进行污染物的降解处理，对第一、第二、第三高效降解菌采用了包覆处理，从而在混合菌剂投加后，调整对应环境条件即可促进对应菌剂对典型异味污染农药场地降解修复效果；
所述包覆处理具体为：利用牛肉膏蛋白胨培养基分别将相同剂量的第一、第二、第三高效降解菌进行固定，并制备成8mm粒径的第一、第二、第三固体小球，并对第一固体小球进行电活性聚合物包覆，对第二固体小球进行糯米纸包覆，对第三固体小球进行凝胶包覆，得到第一高效降解菌小球、第二高效降解菌小球和第三高效降解菌小球；根据三类高效降解菌的环境条件线性排列，对三类高效降解菌的修复次序进行先后排序，从而选用了上述三种材料进行第一、第二、第三高效降解菌小球的制备，从而满足三类高效降解菌在对应条件触发时进行菌剂的释放；
其中，所述糯米纸选用市售糯米纸，所述凝胶选择琼脂糖凝胶；所述第一高效降解菌小球的电活性聚合物制备以及包覆方法，具体包括以下步骤：
1)按质量比为2：1称取纸浆纤维素和壳聚糖，混合后按照每克混合物添加25mL的比例加入三氟乙酸，室温下密封放置6天，随后离心分离得到浆液，将浆液倒入浇铸成膜，室温下干燥48h，待用；
2)利用牛肉膏蛋白胨培养基分别将第一高效降解菌进行固定，并制备成8mm粒径的第一固体小球，待用；
3)将步骤1)所制备的膜分别通过酸液、碱液浸泡处理2.5h，随后使用去离子水反复冲洗后进行灭菌处理，将灭菌后的膜包覆在第一固体小球上，得到膜包覆后的第一固体小球，
其中，所述酸液为0.1mol/L的HCl水溶液，碱液为0.1mol/L的NaOH水溶液；
4)将膜包覆后的第一固体小球在室温下干燥25min，随后对膜包覆所形成的壳衣进行表面喷涂膜电极涂层，具体为石墨涂层，并在壳衣上开设若干细缝，得到第一高效降解菌小球；
上述第一高效降解菌小球的制备方法，提供了一种可降解的电活性聚合物，在混合菌剂修复处理时，不会对典型异味污染农药场地产生二次污染，并且对膜包覆所形成的壳衣开设若干细缝，可以配合通电收缩进行第一高效降解菌的释放，从而满足第一高效降解菌在对应条件触发时进行菌剂释放的需求；
上述修复典型异味污染农药场地的混合菌剂的应用，将混合菌剂应用于典型异味污染农药场地的修复处理，所述修复处理分为三个修复阶段，具体为：
1)第一修复阶段：调控典型异味污染农药场地环境条件在pH＝5，温度为30℃，在投入典型异味污染农药场地后，第二高效降解菌小球的糯米纸进行自动溶解，从而通过第二高效降解菌小球释放第二高效降解菌，对典型异味污染农药场地的二甲基二硫醚进行降解；
2)第二修复阶段：调控典型异味污染农药场地环境条件在pH＝10，温度为30℃，在典型异味污染农药场地插入碳棒并通电后，第一高效降解菌小球的电活性聚合物包覆所形成的壳衣在电流所用下进行收缩使细缝开裂，从而通过第一高效降解菌小球释放第一高效降解菌，对典型异味污染农药场地的苯进行降解；
3)第三修复阶段：调控典型异味污染农药场地环境条件在pH＝10，温度为35℃，在典型异味污染农药场地升温至35℃后，第三高效降解菌小球的凝胶在温度作用下进行溶解，从而通过第三高效降解菌小球释放第三高效降解菌，对典型异味污染农药场地的乙酰甲胺磷进行降解；
通过在三种环境条件的线性排列，触发释放对应菌剂进行典型异味污染农药场地的修复处理，可以使第一、第二、第三高效降解菌均达到其最优降解效率，从而显著提高混合菌剂对于典型异味污染农药场地的修复处理效果；选用上述糯米纸、电活性聚合物以及凝胶作为固体小球的壳衣，可以通过对环境条件等控制，选择对应环境条件下释放对应菌剂进行典型异味污染农药场地，从而提高混合菌剂对典型异味污染农药场地的修复效率。
实施例3
本实施例与实施例2基本相同，与其不同之处在于，1)按质量比为5：3称取纸浆纤维素和壳聚糖，混合后按照每克混合物添加25mL的比例加入三氟乙酸，室温下密封放置6天，随后离心分离得到浆液，将浆液倒入浇铸成膜，室温下干燥48h，待用。
实施例4
本实施例与实施例2基本相同，与其不同之处在于，1)按质量比为7：3称取纸浆纤维素和壳聚糖，混合后按照每克混合物添加25mL的比例加入三氟乙酸，室温下密封放置6天，随后离心分离得到浆液，将浆液倒入浇铸成膜，室温下干燥48h，待用。
实施例5
本实施例与实施例2基本相同，与其不同之处在于，1)按质量比为2：1称取纸浆纤维素和壳聚糖，混合后按照每克混合物添加20mL的比例加入三氟乙酸，室温下密封放置5天，随后离心分离得到浆液，将浆液倒入浇铸成膜，室温下干燥48h，待用。
实施例6
本实施例与实施例2基本相同，与其不同之处在于，1)按质量比为2：1称取纸浆纤维素和壳聚糖，混合后按照每克混合物添加30mL的比例加入三氟乙酸，室温下密封放置7天，随后离心分离得到浆液，将浆液倒入浇铸成膜，室温下干燥48h，待用。
实施例7
本实施例与实施例2基本相同，与其不同之处在于，3)将步骤1)所制备的膜分别通过酸液、碱液浸泡处理2h，随后使用去离子水反复冲洗后进行灭菌处理，将灭菌后的膜包覆在第一固体小球上，得到膜包覆后的第一固体小球。
实施例8
本实施例与实施例2基本相同，与其不同之处在于，3)将步骤1)所制备的膜分别通过酸液、碱液浸泡处理3h，随后使用去离子水反复冲洗后进行灭菌处理，将灭菌后的膜包覆在第一固体小球上，得到膜包覆后的第一固体小球。
实验例
为了探究第一高效降解菌、第二高效降解菌、第三高效降解菌的最佳环境条件，做出如下探究：
一、第一高效降解菌的最佳环境条件：
1)所需培养基如下：
无机盐培养基(MSM)：0.630g NH4Cl，1.965g K2HPO4·3H20，0.5g KH2PO4，1g NaCl，0.1g MgSO4，1g EDTA，加入超纯水1000mL，根据其酸碱性用0.1mol/L的NaOH溶液或HCI溶液调节pH至7.0；
肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，超纯水100mL，根据其酸碱性用0.1mol/L的NaOH溶液或HCI溶液调节pH至7.2(固体培养基加入1.5g的琼脂)。
LB液体培养基：胰化蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，超纯水100mL，根据其酸碱性用0.1mol/L的NaOH溶液或HCI溶液调节pH至7.0；
LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上加入1.5g的琼脂；
高氏合成一号培养基：可溶性淀粉2g，0.1g KNO3，0.05g的K2HPO4·3H2O、NaCl、MgSO4·7H2O，0.001g FeSO4·7H2O，加入超纯水100mL，根据其酸碱性用0.1mol/L的NaOH溶液或HCI溶液调节pH至7.4(固体状态需要加入1.5g的琼脂)。
2)菌株分离纯化：取25g试验土样置于锥形瓶中，并加入100mL的超纯水，放4粒玻璃珠，在120r/min，30℃的恒温摇床上进行震荡混匀；24h后取出锥形瓶并静置10min，吸取0.5mL上清液置于LB固体培养基上，并用玻璃棒进行四周旋转涂抹，将所有的试验土样进行相同操作后，置于恒温培养箱，30℃倒置培养48h；观察LB平板的菌落形态，并且从LB平板上挑取不同的菌落进行单菌落分离，涂布LB平板，培养48h；经过连续3次单菌落分离纯化后，挑取单菌落在LB液体培养基中培养48h，待菌液浑浊，如菌液不浑浊需再进行一轮液体富集培养直至菌液浑浊，组DNA提取试剂盒提取总DNA，提取后进行16SrDNA、PCR扩增、凝胶电泳检测，并将其送至基因测序公司进行16SrDNA基因测序，将所得到的16SrDNA序列于NCBI的数据库进行98％同源性比对，在LB平板上培养两天后菌落呈红色，圆形，直径3-4mm，菌落表面干燥粗糙，不透明的，革兰氏反应阳性。
3)单菌落降解试验：在超净工作台上将分离纯化后的菌株，按照5％的接种量接种于含有浓度200mg/L苯为唯一碳源的无机盐培养基中，瓶口需要用胶塞封口并且裹上封口膜，在25℃，120r/min的恒温摇床上培养72h，吸取2mL待测液置于灭菌后的顶空瓶子中，使用顶空-气相色谱-质谱联用仪进行苯扫描测定含量.根据降解率(％)＝(对照样品的残余含量-试验样品的残余含量)/对照样品的残余含量×100％。
4)环境因子试验：采用单因素进行有关环境因子试验，将分离纯化后的菌株，按照接种量为5％规格接种于含有苯3种浓度50、100、150、200、250、300mg/L的无机盐培养基中，温度为10、20、30℃，转速为65、130、200r·min-1，pH为2、4、6、8、10、12，碳源(葡萄糖、蔗糖、淀粉)，氮源(明胶、尿素、蛋白胨)条件下进行培养，测定其同一时间的OD600和苯的浓度，计算降解率，比较环境因子对该菌降解苯的影响(初始浓度、温度、转速、pH的对照均为不加菌，在同等条件下，加入同等量的苯看其自然挥发损失，外加碳氮源的对照组则是同等条件下，加入同样体积分数的菌液，不外加碳氮源，以苯为唯一碳源时的降解情况，挥发的空白组和前几个环境因子一致)。
5)初始浓度试验：接种5％体积分数的菌液于含有50、100、150、200、250、300mg/L的苯的无机盐培养基中，在温度为30℃，pH为7，转速为120r/min的条件下培养72h，降解率在低浓度50mg/L苯时，降解率仅可达85.98％，高浓度250mg/L苯时，降解率为46.89％，说明苯的初始浓度明显影响菌株对其的降解率，而在最高浓度300mg/L苯时，出现小范围的下降，综合它的吸光度值也有一定的下降，考虑到可能是过高浓度时，抑制了其菌株的生长，导致其降解率下降。
6)pH试验：接种5％体积分数的菌液于含有50mg/L的苯的无机盐培养基中，以苯为唯一碳源，温度为30℃，转速为120r/min，调节pH为2，4，6，8，10，12，振荡培养72h，如图1所示，随着pH值的升高，降解率随之增高，在弱酸性pH为2的条件下，降解率低至20.19％，此时的吸光度也最低，达到1.231，说明菌落生长不旺盛，削弱了它对苯的降解，在碱性pH为10的条件下，降解率大幅度上升，达到80.12％，此时吸光度值也比较大，说明菌落在碱性条件下，生长旺盛，有利于其对苯的降解，而在pH为12时，出现幅度降低，可能碱性过高，导致其生长缓慢，降解率也略微降低。
因此，第一高效降解菌对苯的降解环境条件：初始浓度为50mg/L，降解率达85.98％；pH值为10，降解率达80.12％，说明碱性条件下，降解效果更好。
二、第二高效降解菌的最佳环境条件：
针对枯草芽孢杆菌对二甲基二硫醚的降解环境进行研究，如图2-4所示，可知，pH为5，弱酸性条件下生长较好；温度梯度呈现正趋势上升，达到试验最高温度30℃时最佳；采用淀粉为外加碳源(实验室采用的污染物浓度为50ppm，每100ml菌液只添加了2g)效果理想，综合的最佳降解率可达到50％左右。
三、第三高效降解菌的最佳环境条件：
针对芽孢杆菌对乙酰甲胺的降解环境进行研究，如图5-7所示，可知，pH在中碱性时降解效果较佳；菌株在35℃时对乙酰甲胺磷的降解率最高，达到78％；Cu2+对其降解率影响最小，降解率最低，铁离子对其降解率影响最大，达到65.97％，综合的最佳降解率为68％左右。
同时为了进一步分析第一高效降解菌小球的电活性聚合物制备以及包覆方法不同对苯的降解效果，以实施例2-8为例，对本市某农药工厂的典型异味污染农药场地进行土壤修复处理，选择其场地苯浓度为50mg/L左右的7组面积相等的地块作为试验场地，且每组地块均用塑料膜进行分离隔开，并且碳棒插入深度以及通电功率均相同，现做出如下探究：
探究一不同混合物配比对第一高效降解菌小球释放第一高效降解菌的影响
以实施例2、3、4为例，分别测定3天后各试验场地的苯浓度，从而获得各实施例所对应的苯的降解率，结果如下表1所示：
表1 实施例2、3、4对各试验场地中苯的降解率
Figure BDA0003471958530000121
Figure BDA0003471958530000131
由上述表1可知，实施例2-4的苯的降解率不同，在相同碳棒插入深度以及通电功率的情况下，不同电活性聚合物的混合物配比对第一高效降解菌小球释放第一高效降解菌有一定影响，其中，以实施例2相对最优。
探究二不同溶剂添加量对第一高效降解菌小球释放第一高效降解菌的影响
以实施例2、5、6为例，分别测定3天后各试验场地的苯浓度，从而获得各实施例所对应的苯的降解率，结果如下表2所示：
表2 实施例2、5、6对各试验场地中苯的降解率
组别 降解率
实施例2 79.85％
实施例5 77.57％
实施例6 75.32％
由上述表1可知，实施例2、5、6的苯的降解率不同，在相同碳棒插入深度以及通电功率的情况下，不同电活性聚合物的三氟乙酸添加比例对第一高效降解菌小球释放第一高效降解菌有一定影响，其中，以实施例2相对最优。
探究三不同酸液、碱液浸泡处理时长对第一高效降解菌小球释放第一高效降解菌的影响
以实施例2、7、8为例，分别测定3天后各试验场地的苯浓度，从而获得各实施例所对应的苯的降解率，结果如下表3所示：
表3 实施例2、7、8对各试验场地中苯的降解率
组别 降解率
实施例2 79.85％
实施例8 79.47％
实施例9 79.93％
由上述表1可知，实施例2、7、8的苯的降解率不同，在相同碳棒插入深度以及通电功率的情况下，不同电活性聚合物的混合物配比对第一高效降解菌小球释放第一高效降解菌有一定影响，但影响不大，其中，以实施例9相对最优，但考虑到实施例9与实施例2浸泡时间延长，但对苯的降解率并没有太大影响，从经济性角度考虑，实施例2的综合使用效果更优。

Claims (10)

1.一种修复典型异味污染农药场地的混合菌剂，其特征在于，所述混合菌剂包括用于降解苯的第一高效降解菌，用于降解二甲基二硫醚的第二高效降解菌以及用于降解乙酰甲胺磷的第三高效降解菌；
其中，所述第一高效降解菌的分离筛选方法包括以下步骤：
S101、取25g试验土样置于锥形瓶中，并加入100mL的超纯水，放3～5粒玻璃珠，在100～140r/min，25～35℃的恒温摇床上进行震荡混匀；
S102、24h后取出锥形瓶并静置10～15min，吸取0.5mL上清液置于LB固体培养基上，并用玻璃棒进行四周旋转涂抹，将所有的试验土样进行相同操作后，置于恒温培养箱，25～35℃倒置培养48h；
S103、观察LB平板的菌落形态，并且从LB平板上挑取不同的菌落进行单菌落分离，涂布LB平板，培养48h；
S104、经过连续2～4次单菌落分离纯化后，挑取单菌落在LB液体培养基中培养48h，待菌液浑浊，得到第一高效降解菌。
2.根据权利要求1所述的混合菌剂，其特征在于，所述第一高效降解菌为红球菌；所述第二高效降解菌为枯草芽孢杆菌；所述第三高效降解菌为芽孢杆菌。
3.根据权利要求1所述的一种修复典型异味污染农药场地的混合菌剂的制备方法，其特征在于，对第一高效降解菌、第二高效降解菌、第三高效降解菌分别进行包覆处理，得到第一高效降解菌小球、第二高效降解菌小球以及第三高效降解菌小球，随后根据典型异味污染农药场地情况按比例将第一高效降解菌小球、第二高效降解菌小球以及第三高效降解菌小球混合得到混合菌剂。
4.根据权利要求3所述的一种修复典型异味污染农药场地的混合菌剂的制备方法，其特征在于，所述包覆处理具体为：利用牛肉膏蛋白胨培养基分别将相同剂量的第一、第二、第三高效降解菌进行固定，并制备成5-10mm粒径的第一、第二、第三固体小球，并对第一固体小球进行电活性聚合物包覆，对第二固体小球进行糯米纸包覆，对第三固体小球进行凝胶包覆，得到第一高效降解菌小球、第二高效降解菌小球和第三高效降解菌小球。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一高效降解菌小球的电活性聚合物制备以及包覆方法，具体包括以下步骤：
1)按质量比为5～7：3称取纸浆纤维素和壳聚糖，混合后按照每克混合物添加20～30mL的比例加入三氟乙酸，室温下密封放置5～7天，随后离心分离得到浆液，将浆液倒入浇铸成膜，室温下干燥48h，待用；
2)利用牛肉膏蛋白胨培养基分别将第一高效降解菌进行固定，并制备成5-10mm粒径的第一固体小球，待用；
3)将步骤1)所制备的膜分别通过酸液、碱液浸泡处理2～3h，随后使用去离子水反复冲洗后进行灭菌处理，将灭菌后的膜包覆在第一固体小球上，得到膜包覆后的第一固体小球，
其中，所述酸液为0.1mol/L的HCl水溶液，碱液为0.1mol/L的NaOH水溶液；
4)将膜包覆后的第一固体小球在室温下干燥10～30min，随后对膜包覆所形成的壳衣进行表面喷涂膜电极涂层，并在壳衣上开设若干细缝，得到第一高效降解菌小球。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述糯米纸选用市售糯米纸，所述凝胶选择琼脂糖凝胶。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一固体小球、第二固体小球、第三固体小球的粒径均为5-10mm。
8.根据权利要求1所述的一种修复典型异味污染农药场地的混合菌剂的应用，其特征在于，将混合菌剂应用于典型异味污染农药场地的修复处理。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述修复处理分为三个修复阶段，具体为：
1)第一修复阶段：调控典型异味污染农药场地环境条件在pH＝5，温度为30℃，利用混合菌剂中的第二高效降解菌小球释放第二高效降解菌，对典型异味污染农药场地的二甲基二硫醚进行降解；
2)第二修复阶段：调控典型异味污染农药场地环境条件在pH＝10，温度为30℃，利用混合菌剂中的第一高效降解菌小球释放第一高效降解菌，对典型异味污染农药场地的苯进行降解；
3)第三修复阶段：调控典型异味污染农药场地环境条件在pH≥7，温度为35℃，利用混合菌剂中的第三高效降解菌小球释放第三高效降解菌，对典型异味污染农药场地的乙酰甲胺磷进行降解。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述第二高效降解菌小球释放第二高效降解菌的方法为：在投入典型异味污染农药场地后，第二高效降解菌小球的糯米纸进行自动溶解；
所述第一高效降解菌小球释放第一高效降解菌的方法为：在典型异味污染农药场地插入碳棒并通电后，第一高效降解菌小球的电活性聚合物包覆所形成的壳衣在电流所用下进行收缩使细缝开裂；
所述第三高效降解菌小球释放第三高效降解菌的方法为：在典型异味污染农药场地升温至35℃后，第三高效降解菌小球的凝胶在温度作用下进行溶解。
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