CN105234168A - 一株枯草芽孢杆菌的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株枯草芽孢杆菌应用，具体为在降解有机磷及重金属Pb²⁺-乙酰甲胺磷农药复合物中的应用，所述菌株为芽孢杆菌(<i>Bacillus？Sp</i>.)FZUL-33，该菌株已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为：CGMCC？No.9523。所分离到的枯草芽孢杆菌FZUL-33具有良好的去除铅的特性与生物降解乙酰甲胺磷的特性，并且该菌株能同时去除环境中的乙酰甲胺磷及铅离子，并且对于铅污染问题上，引入乙酰甲胺磷能够促进了枯草芽孢杆菌FZUL-33对铅的去除。

Description

一株枯草芽孢杆菌的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌的应用，涉及微生物去除重金属，降解有机磷及重金属Pb²⁺-乙酰甲胺磷农药复合物的微生物修复应用。

背景技术

目前，由于铅的广泛应用价值，造成铅污染来源的多样性。水、土壤、大气、甚至食物、生活用品等等都成了铅污染的来源，严重影响人们的健康。铅作为一种毒性物质，会造成人体机体紊乱，运动失调，并且对人体而言，铅本身是一种潜在性泌尿系统致癌物质。特别的，对于儿童，血铅含量超标会严重影响其机体生长发育，造成严重后果。

另一方面，乙酰甲胺磷作为国内目前最常用农药之一，对于咀嚼式与刺吸式口器害虫、害螨作用效果明显，广泛应用于蔬菜、茶叶、烟草、果树、棉花、水稻、小麦、油菜等作物。目前，有机磷农药残在环境中的滥用现象严重，使得有机磷的使用效率极低，很大一部分农药残留在农作物与土壤中。乙酰甲胺磷这类有机磷农药的残留，能严重影响土壤理化性质与土壤质量。这些农残可通过雨水冲刷造成更广泛的水污染与土壤污染，并且可通过食物链进入人畜机体，造成神经中毒，造成诸多不利环境影响。

然而，实际上我们土壤所面对的环境污染往往不只一种。含重金属水源的灌溉，农药化肥的滥用，汽车尾气的排放等人为现象，都会造成环境中复合污染问题的产生。例如茶山，除了大量乙酰甲胺磷的农残污染问题，还常被检测出铅含量严重超标。而这样两种不同类型污染物的复合污染，对环境的深度影响引起了人们的关注。并且乙酰甲胺磷-铅复合污染扩散后，其治理难度更是人们所担心的问题。

目前，已有许多人进行了利用微生物去除铅离子以及利用微生物降解有机磷的报道。Huang和liu等人（2013）发现假单胞菌Pseudomonassp.LKS06在最佳条件下，对铅的吸附量为79.9mg/g。Guo等人（2010）报道了枯草芽孢杆菌L14在铅初始浓度为10mg/L时，具有良好去除铅效果，证明了微生物在低浓度重金属污染修复的优势。MingqiangTang（2011）在福建建瓯有机磷污染地分离出一株新型降解三唑磷芽孢杆菌，该菌株在三唑磷浓度为100mg/L的培养基中，对三唑磷降解率达98.5%。Wu等人（2005）证明了Pseudomonassp.S-2含有降解甲胺磷及乙酰甲胺磷的酶。

然而目前，国内关于不同类型复合污染物的治理研究还存在一定空白关于微生物对于重金属-有机磷复合污染的生物修复鲜有报道。ZangSY（2014）等人进行了利用微生物去除废水中乙酰甲胺磷-Hg²⁺混合物的研究。肖根林等人（2011）进行了利用光合细菌修复铅镉及呋喃丹复合污染污土壤的研究。但是，关于乙酰甲胺磷-Pb²⁺混合污染物的修复研究尚未有关报道出现。

发明内容

本发明的目的在于提供一种芽孢杆菌的应用，具有同时有效去除乙酰甲胺磷与铅离子的特性。

本发明利用的微生物鉴定为芽孢杆菌FZUL-33(BacillusSp.FZUL-33)。该菌株已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）,地址：中国北京，保藏日期为2014年8月15日，保藏号为：CGMCCNo.9523。

本发明所用菌株是从福建某长期有机磷农药用地的土壤中分离得到，该菌株为革兰氏阳性细菌，边缘有褶皱不平，表面为乳白色，菌体无荚膜，周生鞭毛能够运动。该芽孢杆菌可在pH为7.2±0.2的LB培养基中良好生长。将该菌株活化、发酵得到发酵培养液，通过喷雾干燥改良工艺制备菌剂，应用于环境中的Pb²⁺去除，乙酰甲胺磷的降解以及Pb²⁺-乙酰甲胺磷复合物的生物修复。

所述芽孢杆菌FZUL-33,在pH=5.5±0.5，温度25~30℃条件下，对Pb2+具有良好的去除特性。

该菌株在pH=5.5±0.5，温度25~30℃条件下，对乙酰甲胺磷具有良好生物降解的特性。

该菌株在pH=5.5±0.5，温度25~30℃条件下，具有同时去除乙酰甲胺磷-Pb2+混合物的特性。

芽孢杆菌FZUL-33对Pb2+的去除过程在2h内即可完成，反应迅速。

芽孢杆菌FZUL-33对Pb2+具有生物矿化的作用，矿化产物为Pb5(PO4)3OH。

乙酰甲胺磷加入体系中促进了芽孢杆菌FZUL-33对Pb2+的去除效果。

Pb2+加入体系对芽孢杆菌FZUL-33降解乙酰甲胺磷没有特别影响。

具体步骤如下：

1、菌种复苏:芽孢杆菌FZUL-33(BacillusSp.FZUL-33)种子菌接种到LB固体培养基上，32℃，培养48h，备用。

2、菌种发酵：将液体发酵种子培养液按3%的接种量接种入发酵罐，32-35℃培养36-48h，得到芽孢杆菌发酵液。

3、将发酵液分装为100ml，发酵液通过8000rpm离心5min，弃上清留菌泥。将菌泥用去离子水重悬，8000rpm离心5min，弃上清留菌泥。如此重复3次，得到菌泥，备用。

4、将所述菌泥接种于100mlPb²⁺铅溶度为100mg/L的水溶液中，水溶液pH调至5.5，在180rpm，25℃条件下反应2h。

5、将3中所述菌泥接种于100ml400mg/L乙酰甲胺磷水溶液中，水溶液pH调至5.5，180rpm，25℃反应1d。

6、将3中所述菌泥接种于Pb²⁺-乙酰甲胺磷的混合溶液中。其中，Pb²⁺浓度为100mg/L，乙酰甲胺磷浓度为400mg/L，水溶液pH调节至5.5。以180rpm，25℃反应1d。

7、将2中发酵液通过喷雾干燥改良工艺制成菌剂，在发酵液中按5%-10%的质量比通过无菌操作添加碳酸钙、碳酸氢钠作为喷雾干燥保护剂，振荡使悬浮均匀，制得菌体悬浮液，备用。将所得菌体悬浮液进行喷雾干燥得到干燥菌剂，喷雾干燥条件为：进风温度为110℃-150℃，出风温度为60℃-90℃，进样速度为5-10ml/min。碳酸钙含量为5wt.%-12wt.%，碳酸氢钠含量为5wt.%-10wt.%。

我们通过含乙酰甲胺磷及含Pb²⁺的培养基筛选出了耐乙酰甲胺磷及耐铅的芽孢杆菌FZUL-33，通过实验发现该芽孢杆菌具有良好降解乙酰甲胺磷及去除Pb²⁺的效果。并且本发明的特点与优势在于在能够利用芽孢杆菌FZUL-33同时高效去除乙酰甲胺磷与Pb²⁺。并且利用芽孢杆菌本身耐高温、耐干燥的特点，利用喷雾干燥改良工艺制备菌剂，用于实际应用。本发明乙酰甲胺磷含量采用高效液相色谱法测定，Pb²⁺含量采用分光光度法测定。反应产物通过XRD进行分析。

本发明特点在于所分离到的枯草芽孢杆菌FZUL-33具有良好的去除铅的特性与生物降解乙酰甲胺磷的特性。并且该菌株能同时去除环境中的乙酰甲胺磷及铅离子。并且对于铅污染问题上，引入乙酰甲胺磷能够促进了枯草芽孢杆菌FZUL-33对铅的去除。

具体实施方式

实施例1枯草芽孢杆菌的获得

从福建某农药制剂工厂附近土地取土样。称取10g土壤溶解于100ml无菌水中，混匀制得样品溶液。通过无菌操作，移取0.1ml与LB固体培养基中，用高压灭菌后的玻璃棒涂布平板，置于32℃培养，带菌落生长完成后，挑取单菌落与LB液体培养基中，32℃培养48h后得到菌悬液，用灭菌后接种环蘸取菌悬液与LB固体培养基中划线，待菌落生长完成。重复上述步骤，直至得到纯的单菌落，挑取该板单菌落培养，并在20%甘油条件下-68℃保存。

实施例2:芽孢杆菌FZUL-33菌泥制备

将活化的芽孢杆菌接入LB液体培养基中，32℃培养2d得到菌悬液，将菌悬液分装为100ml，通过8000rpm转速离心，弃上清液，留下菌泥。将留下的菌泥重悬于去离子水中，按同样条件离心，弃上清液，留下菌泥如此重复3次得到洗过的菌泥，备用。

实施例3：芽孢杆菌FZUL-33去除Pb²⁺及其产物分析

配置100ml100mg/LPb²⁺溶液，pH调至5.5。将实例1中所得菌泥加入，置于25℃，180rpm振荡反应2h。将反应溶液通过13000rpm离心，取上清液测得Pb²⁺去除率为67.5%，沉淀通过XRD分析鉴定为Pb₅(PO₄)₃OH。

溶液中Pb²⁺含量通过分光光度法测定。以二甲酚为显色剂，pH为5.5的醋酸-醋酸钠为缓冲液,在547nm波长下测定Pb²⁺含量。

XRD分析条件：2θ扫描角度：5°~80°；扫描速率：8°/min；电压：40kV；电流20mA。

实施例4：芽孢杆菌FZUL-33降解乙酰甲胺磷

配置100ml400mg/L乙酰甲胺磷溶液，pH调至5.5。将实例1中所得菌泥加入，置于25℃，180rpm振荡反应24h，测得乙酰甲胺磷的降解率为81.7%。

乙酰甲胺磷溶度采用高效液相色谱法测定。色谱条件：流动相为纯水：乙腈=95:5；流动相速率：1ml/min；波长：210nm；柱温：30℃；进样量：20μl。

实施例5：芽孢杆菌FZUL-33去除乙酰甲胺磷-Pb²⁺混合物

配置100ml乙酰甲胺磷-Pb²⁺混合溶液，使乙酰甲胺磷浓度为400mg/L，Pb²⁺浓度为100mg/L，溶液pH调节至5.5。将1中所述菌泥加入，乙酰甲胺磷的降解率为80.5%，铅的去除率为91.3%。发现在加入乙酰甲胺磷后，菌体对铅去除率明显提高。而加入100mg/L铅后，对菌体降解乙酰甲胺磷没有明显影响。

实施例6：芽孢杆菌FZUL-33菌剂制应用于土壤Pb²⁺污染，乙酰甲胺磷污染及乙酰甲胺磷-Pb²⁺复合污染的修复

菌种复苏:芽孢杆菌FZUL-33(BacillusSp.FZUL-33)种子菌接种到LB固体培养基上，32℃，培养48h，备用。

菌种发酵：将液体发酵种子培养液按3%的接种量接种入发酵罐，32-35℃培养36-48h，得到芽孢杆菌发酵液。在发酵液中按10%的质量比通过无菌操作添加碳酸钙、碳酸氢钠作为喷雾干燥保护剂，振荡使悬浮均匀，制得菌体悬浮液，备用。将所得菌体悬浮液进行喷雾干燥得到干燥菌剂，喷雾干燥条件为：进风温度为120℃，出风温度为70℃，进样速度为5ml/min。碳酸钙含量为10wt.%，碳酸氢钠含量为5wt.%。

将所得菌剂用无菌水按照3:1000稀释，制得菌剂工作液，备用。

取茶山土地，均匀分为等量3份。第1份土样均匀喷洒一定量100mg/LPb²⁺；第2份土样均匀喷洒一定量经1000倍稀释30%乙酰甲胺磷乳油；第3份土样均匀喷洒与上述相同含量1000倍稀释30%乙酰甲胺磷乳油与上述含量相同的100mg/LPb²⁺水溶液的混合液。3份样品静置自然风干后，从三份样品中各取100g土样，并分别加入定量上述菌剂工作液，2d后测定土样中Pb²⁺与乙酰甲胺磷的含量。测定结果为：

从上表结果发现，实际土壤环境中的情况与实验条件类似。没有乙酰甲胺磷时，菌剂对铅离子的去除率为66.47%，当土壤中同时含有乙酰甲胺磷与铅离子，菌剂对铅离子的去除率为93.95%，提高了33.48%。没有铅离子时，菌剂对土壤中乙酰甲胺磷的降解率为89.31%，加入铅离子后，菌剂对土壤中乙酰甲胺磷的降解率为86.95%,降解率略微向下浮动，无明显影响。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (5)

1.一株枯草芽孢杆菌在环境中的Pb²⁺去除、乙酰甲胺磷的降解以及Pb²⁺-乙酰甲胺磷复合物的生物修复中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为芽孢杆菌(BacillusSp.)FZUL-33，该菌株已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期为2014年8月15日，保藏号为：CGMCCNo.9523。

3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于：所述菌株在pH=5.5±0.5，温度25~30℃条件下，对Pb²⁺具有良好的去除特性。

4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于：该菌株在pH=5.5±0.5，温度25~30℃条件下，对乙酰甲胺磷具有良好生物降解的特性。

5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于：该菌株在pH=5.5±0.5，温度25~30℃条件下，具有同时去除乙酰甲胺磷-Pb²⁺混合物的特性。