CN104371954A - 一株芽孢杆菌及其菌剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种芽孢杆菌及其菌剂的制备方法，所述菌株为芽孢杆菌FZUL-33(BacillusSp.)，已于2014年8月15日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号：CGMCCNo.9523，将该菌株活化、发酵得到发酵培养液，与添加剂混合后通过喷雾干燥工艺制备菌剂，应用于土壤残留农药的降解。本发明的优势在于利用芽孢杆菌耐高温、耐干燥的特点，使其在经过喷雾干燥菌剂制备过程后，菌株仍有较高的存活率，通过平板计数法检测所得菌剂存活率达到70%以上，活菌数大于1010CFU/g。
Description
技术领域
本发明属于微生物培养领域，具体涉及一株芽孢杆菌及其菌剂的制备方法，包括微生物培养和菌剂制备及其降解有机磷农药的应用。
背景技术
当代农业的迅速发展，不可避免的导致农药残留问题的出现。其中，有机磷农药应用最为广泛。而往往有机磷农药发挥杀虫作用的只有一小部分，很大一部分则残留下来。残留下的有机磷农药会改变土壤的理化性质，影响土壤质量，并且随着雨水冲刷，造成地下水污染。有机磷农药对人畜可产生慢性中毒，导致神经系统损伤。对于农药的致癌、致畸、致突变问题更是令广大群众担忧。
目前，利用微生物降解残留农药的方法因其操作可行性和成本低等特点，已获得广泛的肯定。对具有降解有机磷农药的微生物的筛选通常是由长期遭受农药污染的土壤和水体中分离得到。例如，天京科技大学的王硕、郭睿莉等人（2009）从山东农药厂采集的活性污泥中分离得到一株能够降解有机磷农药的产碱杆菌。本发明特点在于所分离到的芽孢杆菌能快速有效降解残留的有机磷农药。
发明内容
本发明的目的在于提供一种一株芽孢杆菌及其菌剂的制备方法，解决农药残留问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明利用的微生物鉴定为芽孢杆菌(Bacillus Sp.)FZUL-33。该菌株已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：中国北京，保藏日期为2014年8月15日，保藏号为：CGMCC No.9523。该菌株通过喷雾干燥制得的菌剂具有降解有机磷农药的特性。
本发明所用菌株是从福建某长期有机磷农药用地的土壤中分离得到，该菌株为革兰氏阳性细菌，菌落表面粗糙，乳白色，边缘波状有褶皱，菌体无荚膜，周生鞭毛，能运动。该芽孢杆菌可在pH为7.2的LB培养基中良好生长。将该菌株活化、发酵得到发酵培养液，与添加剂混合后通过喷雾干燥工艺制备菌剂，应用于土壤残留农药的降解。
具体步骤如下：
1、菌种复苏: 芽孢杆菌FZUL-33(Bacillus Sp.FZUL-33)种子菌接种到LB固体培养基上，32℃，培养48h，备用。
2、菌种活化：将LB固体培养基菌种接种到LB液体培养基中，32-35℃培养18-24h，得到液体发酵种子培养液。
3、菌种发酵：将液体发酵种子培养液按3%的接种量接种入发酵罐，32-35℃培养36-48h，得到芽孢杆菌发酵液。
4、在发酵液中按5%-10%的质量比通过无菌操作添加碳酸钙、碳酸氢钠作为喷雾干燥保护剂，振荡使悬浮均匀，制得菌体悬浮液，备用。
5、将所得菌体悬浮液进行喷雾干燥得到干燥菌剂，进料浓度为20-30%，进料量10-20ml/min，进风温度110-150℃，出风温度60-90℃。
所述菌株LB固体培养基成分为胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%，其余为水，pH为7.2，温度32-35℃。LB液体培养基成分为胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%，其余为水，pH为7.2。
步骤（5）中喷雾干燥条件为：进风温度为110℃-150℃，出风温度为60℃-90℃，进样速度为5-10ml/min。
步骤（4）中碳酸钙含量为5wt.%-12wt.%，碳酸氢钠含量为5wt.%-10wt.%。
所述的方法制备得到的菌剂。该菌剂在24-48h内降解农药用地中75%以上的乙酰甲胺磷。该菌剂降解有机磷农药的适宜pH为7-9。
所述的菌剂在有机磷农药降解中的应用。
我们通过含有机磷农药农的培养基筛选出了能够耐受有机磷农药的芽孢杆菌，发现该芽孢杆菌具有降解有机磷农药的特性。并且本发明的优势在于利用芽孢杆菌耐高温、耐干燥的特点，使其在经过喷雾干燥菌剂制备过程后，菌株仍有较高的存活率，通过平板计数法检测所得菌剂存活率达到70%以上，活菌数大于1010CFU/g。本发明有机磷农药残留量采用气象色谱法测定。
具体实施方式
实例1：芽孢杆菌菌剂制备
1.1菌种的活化
取甘油冷冻保藏的芽孢杆菌种子菌，在LB平板上划线，挑单菌落接种于LB液体培养基中，在好氧、常压、32℃条件下置于120转/分钟摇床中振荡培养24h，再按3%接种量扩大培养24h。
1.2芽孢杆菌菌剂制备及有机磷农药降解的作用。
将扩大培养的菌液按5%的接种量接入发酵罐中，32℃培养48小时得到发酵液，往发酵液中加入质量比为10%碳酸钙和质量比为10%的碳酸氢钠，振荡摇匀5min得到芽孢杆菌菌体悬浮液。通过喷雾干燥得到固体颗粒菌剂。喷雾干燥条件为如表1所示。
表1 喷雾干燥条件
实例2 ：芽孢杆菌在含四种不同有机磷农药培养基的生长及降解情况
分别制备含乙酰甲胺磷、甲胺磷、敌敌畏、辛硫磷100mg/L的LB液体培养基100ml于250ml锥形瓶中，将活化后的菌株按照1%接种量分别接入4瓶含不同有机磷农药的培养基中，置于30℃，180r/min摇床中振荡，24h后比对降解效果。结果发现，从菌体生长方面来看，四种培养基中的芽孢杆菌均在72小时后进入了稳定期。并且菌体生长情况为乙酰甲胺磷培养基>甲胺磷培养基>辛硫磷培养基>敌敌畏培养基。
有机磷农药残留量通过气象色谱检测。色谱条件：进样口温度220℃；程序升温：在120℃停留2min，每分钟升高10℃，直至250℃并保持30min；检测器采用NPD，220℃。芽孢杆菌降解四种有机磷的情况如表2。
表2 芽孢杆菌降解四种有机磷的情况
实例3：芽孢杆菌菌剂降解乙酰甲胺磷
将活化的芽孢杆菌接入LB液体培养基中，扩大培养后接种至发酵罐中，32℃培养48h得到发酵液，加入质量比为10%的碳酸钙与质量比为8%的碳酸氢钠，通过喷雾干燥得到固体颗粒菌剂。
配置100ml 乙酰甲胺磷浓度为100mg/L溶液于250ml锥形瓶中，将所得菌剂按照质量比为1:50加入该锥形瓶中，置于30℃，180r/min摇床中振荡24h后，测得乙酰甲胺磷的降解率为84.4%。
实例4.制备芽孢杆菌菌剂存活率对比
4.1菌种的活化
取甘油冷冻保藏的芽孢杆菌种子菌，在LB平板上划线，挑单菌落接种于LB液体培养基中，在好氧、常压、32℃条件下置于120转/分钟摇床中振荡培养24h，再按3%接种量扩大培养至4瓶含300ml LB 液体培养基的锥形瓶中，32℃、120转/分钟培养24h。
4.2菌剂的制备将四瓶培养基分别编号为1#、2#、3#、4#。向1#中按质量比为10%加入碳酸钙；向2#中按质量比为10%加入碳酸氢钠；向3#中按质量比为10%分别加入碳酸钙与碳酸氢钠；4#不添加任何成分做对照。再将1#、2#、3#、4#振荡摇匀5min得到菌体悬浮剂。取1#、2#、3#、4#按照实例1喷雾干燥条件进行喷雾干燥。将所得到的菌剂通过平板计数法得到四种菌剂的存活率如表3。
表3 四种菌剂的存活率
实例5.芽孢杆菌菌剂应用于菜地有机磷农药降解
将实例1所得芽孢杆菌菌剂按照1:50的比例用清水溶解，备用。选取相同的六块菜地，每两块地一组，分为三组。第一组均匀喷洒经过800倍稀释的50%甲胺磷乳油农药，第二组均匀喷洒经300倍稀释的30%乙酰甲胺磷乳油农药，第三组均匀喷洒经500倍稀释的50%辛硫磷乳油农药。24h后，在每组的第一块菜地均匀喷洒芽孢杆菌菌剂溶液，另一块菜地均匀喷洒清水作对照。78h后，从六块菜地取土样检测，结果显示（表4）经过芽孢杆菌菌剂溶液喷洒过后的菜地，甲胺磷农药残留量比对照组减少了68%，乙酰甲胺磷农药残留量比对照组减少了82%，辛硫磷农药残留量比对照组减少了63%。
表4 土壤农药残留情况
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (9)
1.一株芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株为芽孢杆菌(Bacillus Sp.)FZUL-33，已于2014年8月15日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号：CGMCC No.9523。
2.一种如权利要求1所述的一株芽孢杆菌的菌剂制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
（1）菌种复苏: 将所述芽孢杆菌FZUL-33(Bacillus Sp.)种子菌接种到LB固体培养基上，32℃，培养48h，备用；
（2）菌种活化：将LB固体培养基菌种接种到LB液体培养基中，32-35℃培养18-24h，得到液体发酵种子培养液；
（3）菌种发酵：将液体发酵种子培养液按3%的接种量接种入发酵罐，32-35℃培养36-48h，得到芽孢杆菌发酵液；
（4）在发酵液中按5%-10%的质量比通过无菌操作添加碳酸钙、碳酸氢钠作为喷雾干燥保护剂，振荡使悬浮均匀，制得菌体悬浮液，备用；
（5）将所得菌体悬浮液进行喷雾干燥工艺得到干燥菌剂，进料浓度为20-30wt.%，进料量10-20ml/min。
3.根据权利要求2所述的一株芽孢杆菌的菌剂制备方法,其特征在于：所述菌株LB固体培养基成分为胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%，琼脂1.5%,其余为水，pH为7.2;LB液体培养基成分为胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%，其余为水，pH为7.2。
4.根据权利要求2所述的一株芽孢杆菌的菌剂制备方法,其特征在于：步骤（5）中喷雾干燥条件为：进风温度为110℃-150℃，出风温度为60℃-90℃，进样速度为5-10ml/min。
5.根据权利要求2所述的一株芽孢杆菌的菌剂制备方法,其特征在于：步骤（4）中碳酸钙含量为5wt.%-12wt.%，碳酸氢钠含量为5wt.%-10wt.%。
6.一种如权利要求2所述的方法制备得到的菌剂。
7.根据权利要求6所述的的方法制备得到的菌剂，其特征在于：该菌剂在24-48h内降解农药用地中75%以上的乙酰甲胺磷。
8.根据权利要求6所述的的方法制备得到的菌剂，其特征在于：该菌剂降解有机磷农药的适宜pH为7-9。
9.一种如权利要求6所述的菌剂在有机磷农药降解中的应用。
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