CN107815427B - 一株具有甲胺降解能力的梭状芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株具有甲胺降解能力的梭状芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株具有甲胺降解能力的梭状芽孢杆菌及其应用。该菌株的名称为梭状芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)GDUTAN2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉武汉大学校内；保藏编号为CCTCC NO：M 2017284，保藏日期为2017年5月24日。该梭状芽孢杆菌GDUTAN2革兰氏阳性，杆状，菌落形态为圆形，白色，透明，菌落直径为1～2mm。本发明的梭状芽孢杆菌GDUTAN2可应用于环境修复，降解环境中的甲胺，降解率高，在底物浓度为5mg/L条件下降解96h，降解率可达96.3％。

Description

一株具有甲胺降解能力的梭状芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，更具体地，涉及一株具有甲胺降解能力的梭状芽孢杆菌及其应用。
背景技术
恶臭污染是当今空气污染的一大难题。有机恶臭气体主要分为含硫有机恶臭气体和含氮有机恶臭气体，其中甲胺(Methylamine，MA)是典型的含氮有机恶臭化合物。甲胺的嗅阈值低至0.021ppm，较难生化降解。在甲胺浓度较低时就可以产生强烈的刺激性鱼臭味，且容易被皮肤以及衣服等所吸附。甲胺可经呼吸道、胃肠道及皮肤吸收，在体内转化成二甲胺或氧化生成甲酸。甲胺对眼、皮肤和呼吸道粘膜有强烈的刺激和腐蚀作用，对机体全身有拟交感神经作用。甲胺常使用于药物、有机氮农药、染料、炸药和表面活性剂等生产过程中，我国工作场所空气中甲胺短时间接触容许浓度均为0.01ppm，时间加权平均容许浓度均为0.005ppm。
现阶段国内外对甲胺的治理方法主要包括物理法和化学方法。相比而言，采用生物法降解恶臭气体具有降解彻底、成本低、无二次污染等优点，因此受到国内外研究者的关注。据报道，由于目前单一菌种对甲胺的降解能力有限，目前已有一部分研究者通过接种混合菌种对甲胺进行降解研究，使用新的单一菌种对甲胺进行降解的研究却鲜有文献报道。因此筛选出高效率、低成本的甲胺降解菌对恶臭有机含氮废气的净化方面具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的缺陷，提供一株具有甲胺降解能力的梭状芽孢杆菌。该梭状芽孢杆菌GDUTAN2属于芽孢杆菌属的一个新变种，具有优异的甲胺降解能力，能降解环境中的甲胺，且甲胺降解率高。
本发明的另一目的在于提供上述具有甲胺降解能力的梭状芽孢杆菌在环境修复中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
本发明的第一方面，提供一株具有甲胺降解能力的梭状芽孢杆菌，该菌株的名称为梭状芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)GDUTAN2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏编号为CCTCC NO.：M2017284，保藏日期为2017年5月24日。
本发明的所述具有甲胺降解能力的梭状芽孢杆菌的形态特性如下：
(a)采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，所筛选的梭状芽孢杆菌的细胞染色为革兰氏阳性，杆状。
(b)菌落的形态特性为：在LB固体培养基培养24h后，菌落形态为圆形，白色，透明，菌落直径为1～2mm。
本发明的所述具有甲胺降解能力的梭状芽孢杆菌的主要的生理生化特征如下表1所示：
表1 梭状芽孢杆菌的主要的生理生化特征
本发明的所述具有甲胺降解能力的梭状芽孢杆菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
通过16S rDNA序列比对分析，发现本发明的菌株与Lysinibacillus fusiformisKNUC423的同源性高达100％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定梭状芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)GDUTAN2属于芽孢杆菌属的一个新变种，命名为梭状芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)GDUTAN2。
本发明的第二个方面，提供所述的具有甲胺降解能力的梭状芽孢杆菌在环境修复中的应用。
本发明的具有甲胺降解能力的梭状芽孢杆菌在环境修复的应用中，能够降解环境中的甲胺。
进一步地，所述环境包括大气、水体或者土壤。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明的梭状芽孢杆菌GDUTAN2是首次从广东省广州市某垃圾填埋场的垃圾渗滤液中筛选得到具有降解甲胺能力的梭状芽孢杆菌。
2.本发明的梭状芽孢杆菌GDUTAN2具有高效降解甲胺的能力，在底物浓度为5mg/L条件下降解96h，降解率可达96.3％。
附图说明
图1是本发明的梭状芽孢杆菌GDUTAN2在电子显微镜下的形态图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
一株具有甲胺降解能力的梭状芽孢杆菌，该菌株的名称为梭状芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)GDUTAN2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏编号为CCTCC NO.：M 2017284，保藏日期为2017年5月24日。
本实施例的梭状芽孢杆菌GDUTAN2分离筛选自广东省广州市某垃圾填埋场渗滤液。其分离纯化方法如下：所用的驯化培养基为无机盐培养基g/L(每1000mL无机盐培养基含K2HPO4·3H2O 1.2g，KH2PO41.2g，NH4Cl 0.4g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.01g，1mL微量元素液(g/L)：CaCl2·2H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.2g，CuSO4·2H2O 0.01g，ZnSO4·7H2O0.2g，CoCl2·6H2O 0.09g，Na2MoO4·2H2O 0.12g，H3BO30.006g)。首先取1mL垃圾渗滤液稀释100倍，接种至营养肉汤中，在摇床温度为37℃、转速150rpm条件下好氧培养1天。取经富集的菌液1mL，接种在含甲胺的无机盐营养液中，在摇床温度为37℃、转速150rpm条件下好氧培养5天后以10％接种量移入下一浓度驯化，底物驯化梯度分别为：10，20，50和100mg/L。将终浓度驯化液做10-1～10-6的稀释，分别取稀释10-5和10-6倍的稀释液200μL涂布到以甲胺为唯一碳源的固体琼脂平板(含甲胺的固体培养基为：每升上述无机盐培养基中加入琼脂18g和甲胺4mg)上，放入35℃恒温箱中培养3天，挑选不同形态单菌落进行甲胺降解率的测定，选择降解率最高的菌种进行纯化。
降解率的测定：在甲胺生物降解的过程中定时取样通过分光光度法测定降解率。降解率＝(初始浓度-终浓度)/初始浓度。
分光光度法测定甲胺的浓度：分别取一定量的甲胺降解液于l0mL比色管中，以吸收液(0.01M HCl)稀释至2.0mL，分别加入缓冲液(80mL蒸馏水内溶解4.08g磷酸二氢钾、1.6g硼砂，再加入5.0MNaOH溶液6.35mL，用水稀释至100mL)4.0mL，重氮盐溶液(10mL对硝基苯胺盐酸溶液中加入亚硝酸钠溶液1.0mL，混匀)0.4mL，摇匀，放置40min，再加入5M NaOH溶液1.0mL，混匀，放置20min，于波长510nm处比色定量。
将纯化得到的菌落进行鉴定，鉴定结果如下：
(1)菌体的形态特性：
a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，所筛选的梭状芽孢杆菌的细胞染色为革兰氏阳性；在电子显微镜下观察，其形态为杆状，菌体大小为(1.1～1.4)×(2.3～6.0)μm，周生鞭毛，如图1所示；
b.菌落的形态特性：在LB固体培养基培养24h后，菌落边缘整齐，圆形，白色，透明，菌落直径为1～2mm；
c.主要的生理生化特征如表2所示：
表2 梭状芽孢杆菌的各项生理生化特征
上述结果表明本发明所筛选的细菌与梭状芽孢杆菌属的生理生化特性很相似。
(2)提取细菌基因组DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物：
上游引物：F27(5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3')
下游引物：R1492(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')
扩增其16S rDNA全部基因，测序结果如SEQ ID NO：1所示。
将SEQ ID NO：1中所示的长为1398bp的16S rRNA基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行比对分析发现菌株与Lysinibacillus fusiformis KNUC423的同源性高达100％。
综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列结果，本发明所筛选的菌株应归属芽孢杆菌属的一个新变种，命名为梭状芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)GDUTAN2。
该梭状芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)GDUTAN2于2017年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC NO.：M 2017284。
实施例2
本实施例为梭状芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)GDUTAN2在环境修复中的应用，可降解环境中的甲胺。其中环境包括大气、水体或者土壤。
下面对本发明筛选得到的梭状芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)GDUTAN2的甲胺降解能力进行试验验证的方法如下：
根据降解实验需要，配置无机盐培养基：往300mL的血清瓶中加入无机盐溶液100mL(每100mL无机盐溶液含：K2HPO4·3H2O 0.12g，KH2PO4 0.12g，NH4Cl 0.04g，MgSO4·7H2O 0.02g，FeSO4·7H2O 0.001g，CaCl2·2H2O 0.02g，MnSO4·4H2O 0.02g，CuSO4·2H2O0.001g，ZnSO4·7H2O 0.02g，CoCl2·6H2O 0.009g，Na2MoO4·2H2O 0.012g，H3BO30.0006g，双蒸水100mL)，于121℃高压灭菌30min。首先，将筛选所得的具有甲胺降解能力的梭状芽孢杆菌GDUTAN2在营养肉汤培养基中(牛肉膏3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 5.0g/L)30℃，100rpm的摇床中活化菌体24h，菌液离心，收集菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤三次，并用10mL无机盐溶液重悬，并向含有不同浓度的甲胺的100mL无机盐溶液中接种1.0mL菌液，其中甲胺的浓度分别为5mg/L、10mg/L、40mg/L、70mg/L、100mg/L和130mg/L，其中无机盐的pH值为7，在30℃100rpm的摇床反应96h时，定时取样通过分光光度法测定降解率。降解率的测定同实施例1，结果如表3所示：
表3 梭状芽孢杆菌GDUTAN2对不同初始浓度的甲胺的降解率
从表3中可以看出，本发明筛选得到梭状芽孢杆菌GDUTAN2在该条件下对甲胺的降解能力最高可达到96.3％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东工业大学
<120> 一种具有甲胺降解能力的梭状芽孢杆菌及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1398
<212> DNA
<213> 梭状芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis) GDUTAN2
<400> 1
cagtcgagcg aacagagaag gagcttgctc cttcgacgtt agcggcggac gggtgagtaa 60
cacgtgggca acctacctta tagtttggga taactccggg aaaccggggc taataccgaa 120
taatctgttt cacctcatgg tgaaacactg aaagacggtt tcggctgtcg ctataggatg 180
ggcccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac gatgcgtagc 240
cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300
gcagcagtag ggaatcttcc acaatgggcg aaagcctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg 360
aagaaggatt tcggttcgta aaactctgtt gtaagggaag aacaagtaca gtagtaactg 420
gctgtacctt gacggtacct tattagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 480
taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagcgcgc gcaggtggtt 540
tcttaagtct gatgtgaaag cccacggctc aaccgtggag ggtcattgga aactgggaga 600
cttgagtgca gaagaggata gtggaattcc aagtgtagcg gtgaaatgcg tagagatttg 660
gaggaacacc agtggcgaag gcgactatct ggtctgtaac tgacactgag gcgcgaaagc 720
gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag 780
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tgtagagata tagtttcccc ttcgggggca acggtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020
gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080
ccatcattta gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140
tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacgata 1200
caaacggttg ccaactcgcg agagggagct aatccgataa agtcgttctc agttcggatt 1260
gtaggctgca actcgcctac atgaagccgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320
cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380
cccgaagtcg gtgaggta 1398

Claims (2)

1.一株具有甲胺降解能力的梭状芽孢杆菌，其特征在于，该菌株名称为梭状芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis)GDUTAN2，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学校内；保藏编号为CCTCC NO：M 2017284，保藏日期为2017年5月24日。
2.根据权利要求1所述的一株具有甲胺降解能力的梭状芽孢杆菌在环境修复中的应用，其特征在于，所述梭状芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis)GDUTAN2能够降解环境中的甲胺。
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