CN107904188B

CN107904188B - 一株具有一甲胺降解能力的无色杆菌及其应用

Info

Publication number: CN107904188B
Application number: CN201711084294.0A
Authority: CN
Inventors: 李桂英; 李世蔼; 安太成; 刘宏利; 陈江耀
Original assignee: Guangdong University of Technology
Current assignee: Guangdong University of Technology
Priority date: 2017-11-07
Filing date: 2017-11-07
Publication date: 2020-07-10
Anticipated expiration: 2037-11-07
Also published as: US20210371808A1; WO2019091033A1; CN107904188A

Abstract

本发明公开了一株具有一甲胺降解能力的无色杆菌及其应用。该菌株的名称为无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)GDUTAN5，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏编号为CCTCC NO：M 2017285，保藏日期为2017年5月24日。该无色杆菌GDUTAN5呈革兰氏阴性，杆状，菌落形态为圆形，淡黄色，不透明，表面平滑，菌落直径为1～2mm。本发明的无色杆菌GDUTAN5可应用于环境修复，降解环境中的一甲胺且降解率高。在底物浓度为5mg/L条件下降解96h，降解率可达92.3％。

Description

一株具有一甲胺降解能力的无色杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，更具体地，涉及一株具有一甲胺降解能力的无色杆菌及其应用。

背景技术

甲胺类有机化合物如一甲胺(Methylamine或methylamine)、二甲胺(dimethylamine)和三甲胺(trimethylamine)是一类在生产染料，橡胶，农药，药品，化妆品和缓蚀剂等医药或化工行业中主要的原材料或中间产物。它们不仅具有强烈的恶臭气味，而且当人类暴露于该类污染物后会导致皮肤、眼睛、鼻子、喉咙或呼吸道系统的强烈刺激。其中一甲胺是最简单的甲胺类化合物，在工业中用途广泛，而由于其沸点低、蒸汽压高，在生产和使用时大量挥发到环境中，危害人体健康和自然环境。另外一甲胺的嗅阈值极低，在较低浓度时就具有强烈的鱼臭味，对人的生理及心理健康也会产生不利影响。因此从环境中有效去除一甲胺是非常必要和紧迫的，而利用微生物来降解环境中的有机污染物的方法是一种环境非常友好的方法。而目前研究最多的一种一甲胺降解菌是广泛存在于水体、土壤和空气中甲基杆菌(Methylobacterium AM1)，它能够将一甲胺作为唯一的碳源和氮源。另外也发现海洋菌Roseobacter分枝菌能够将一甲胺、二甲胺和三甲胺作为重要的氮源和可能的能源。然而，从垃圾渗滤液中，使用分离培养新的单一菌种对一甲胺进行降解研究的文献报道却非常有限，因此筛选出低成本、高效率的一甲胺降解菌在恶臭有机含氮废气的净化方面具有非常重要的意义。该无色杆菌是一种革兰氏阴性菌、杆状，在固体培养基表面，菌体可形成白色、圆形、边缘不整齐，表面粗糙的菌落。迄今为止，还没有见到有关使用无色杆菌降解一甲胺的相关报道及专利。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的缺陷，提供一株具有一甲胺降解能力的无色杆菌。该无色杆菌GDUTAN5属于无色杆菌属的一个新变种，具有优异的一甲胺降解能力，能降解环境中的一甲胺且降解率高。

本发明的另一目的在于提供上述具有一甲胺降解能力的无色杆菌在环境修复中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明的第一方面，提供一株具有一甲胺降解能力的无色杆菌，该菌株名称为无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)GDUTAN5，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学校内；保藏编号为CCTCC NO：M2017285，保藏日期为2017年5月24日。

本发明的所述具有一甲胺降解能力的无色杆菌的形态特性如下：

(a)采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，所筛选的无色杆菌的细胞染色为革兰氏阴性，杆状。

(b)菌落的形态特性为：在LB固体培养基培养24h后，菌落形态为圆形，淡黄色，不透明，表面平滑，菌落直径为1～2mm。

本发明所述具有一甲胺降解能力的无色杆菌的主要生理生化特征如下表1所示：

表1无色杆菌的主要的生理生化特征

本发明的所述具有一甲胺降解能力的无色杆菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

通过16S rDNA序列比对分析，发现本发明的菌株与Achromobacter xylosoxidansGAD3的同源性达到67％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)GDUTAN5属于无色杆菌属的一个新变种，命名为无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)GDUTAN5。

本发明的第二个方面，提供所述的具有一甲胺降解能力的无色杆菌在环境修复中的应用。

本发明的具有一甲胺降解能力的无色杆菌在环境修复的应用中，能够降解环境中的一甲胺。

进一步地，所述环境包括大气、水体或者土壤。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明的无色杆菌GDUTAN5菌株是首次从广东省广州市某垃圾填埋场的垃圾渗滤液中筛选得到，其具有降解一甲胺的能力。

2.本发明的无色杆菌具有降解一甲胺的能力，在底物浓度为5mg/L条件下降解96h，降解率可达92.3％。

附图说明

图1是本发明的无色杆菌GDUTAN5在电子显微镜下的形态图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1

一株具有一甲胺降解能力的无色杆菌，该菌株的名称为无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)GDUTAN5，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学校内；保藏编号为CCTCC NO：M 2017285，保藏日期为2017年5月24日。

本实施例的无色杆菌GDUTAN5分离筛选自广东省广州市某垃圾填埋场渗滤液。其分离纯化方法如下：所用的驯化培养液为无机盐培养水溶液(每1000mL无机盐培养水溶液中含有：K₂HPO₄·3H₂O 1.2g，KH₂PO₄1.2g，NH₄Cl 0.4g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，FeSO₄·7H₂O0.01g和1mL微量元素水溶液。其中，每1000mL微量元素水溶液中含有：CaCl₂·2H₂O 0.2g，MnSO₄·4H₂O 0.2g，CuSO₄·2H₂O0.01g，ZnSO₄·7H₂O 0.2g，CoCl₂·6H₂O 0.09g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.12g，H₃BO₃0.006g)。首先取1mL垃圾渗滤液稀释100倍，接种至营养肉汤中，在摇床温度为37℃、转速150rpm条件下好氧培养1天。取经富集的菌液1mL，接种在含一甲胺的无机盐营养液中，在摇床温度为37℃、转速150rpm条件下好氧培养5天后以10％接种量移入下一浓度驯化，底物驯化梯度分别为：10，20，50和100mg/L。将终浓度驯化液做10^-1～10^-6的稀释，分别取稀释10^-5和10^-6倍的稀释液200μL涂布到以一甲胺为唯一碳源的固体琼脂平板(含一甲胺的固体培养基为：每升上述无机盐培养基中加入琼脂粉18g和一甲胺4mg)上，放入35℃恒温箱中培养3天，挑选不同形态单菌落进行一甲胺降解率的测定，选择降解率最高的菌种进行纯化。

降解率的测定：在一甲胺生物降解的过程中定时取样通过分光光度法测定降解率。降解率＝(初始浓度-终浓度)/初始浓度。

分光光度法测定甲胺的浓度：分别取一定量的一甲胺降解液于l0mL比色管中，以吸收液(0.01mol/L HCl)稀释至2.0mL，分别加入缓冲液(80mL蒸馏水内溶解4.08g磷酸二氢钾、1.6g硼砂，再加入5.0mol/LNaOH溶液6.35mL，用水稀释至100mL)4.0mL，重氮盐溶液(10mL对硝基苯胺盐酸溶液中加入亚硝酸钠溶液1.0mL，混匀)0.4mL，摇匀，放置40min，再加入1.0mL的5mol/L NaOH溶液，混匀，放置20min，于波长510nm处比色定量。

将纯化得到的菌落进行鉴定，鉴定结果如下：

(1)菌体的形态特性：

a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，所筛选的无色杆菌的细胞染色为革兰氏阴性；在电子显微镜下观察，其形态为杆状，菌体大小为(0.6～1.0)μm×(1.3～1.8)μm，周生鞭毛，如图1所示；

b.菌落的形态特性：在LB固体培养基培养24h后，菌落边缘整齐，圆形，淡黄色，不透明，菌落直径为1～2mm；

c.无色杆菌主要的生理生化特征如表2所示：

表2无色杆菌的各项生理生化特征

上述结果表明本发明所筛选的细菌与无色杆菌属的生理生化特性很相似。

(2)提取细菌基因组DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物：

上游引物：F27(5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3')

下游引物：R1492(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')

扩增其16S rDNA全部基因，测序结果如SEQ ID NO：1所示。

将SEQ ID NO：1中所示的长为1359bp的16S rRNA基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行比对分析发现菌株与Achromobacter xylosoxidans GAD3的同源性高达67％。

综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列结果，本发明所筛选的菌株应归属无色杆菌属的一个新变种，命名为无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)GDUTAN5。

该无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)GDUTAN5于2017年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学校内，保藏编号为CCTCCNO：M 2017285。

实施例2

本实施例为无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)GDUTAN5在环境修复中的应用，可降解环境中的一甲胺。其中环境包括大气、水体或者土壤。

下面对本发明筛选得到的无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)GDUTAN5的一甲胺降解能力进行试验：

根据降解实验需要，配置无机盐培养基：往300mL的血清瓶中加入无机盐溶液100mL(每100mL无机盐水溶液含：K₂HPO₄·3H₂O 0.12g，KH₂PO₄0.12g，NH₄Cl 0.04g，MgSO₄·7H₂O 0.02g，FeSO₄·7H₂O 0.001g，CaCl₂·2H₂O 0.02g，MnSO₄·4H₂O 0.02g，CuSO₄·2H₂O0.001g，ZnSO₄·7H₂O 0.02g，CoCl₂·6H₂O 0.009g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.012g，H₃BO₃0.0006g，双蒸水100mL)，于121℃高压灭菌30min。首先将筛选所得的具有一甲胺降解能力的无色杆菌GDUTAN5在营养肉汤培养基中(牛肉膏3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 5.0g/L)30℃，100rpm的摇床中活化菌体24h，菌液离心，收集菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤三次，并用10mL无机盐溶液重悬，并向含有不同浓度的一甲胺的100mL无机盐溶液中接种1.0mL菌液，其中一甲胺的浓度分别为5、10、40、70、100和130mg/L，其中无机盐的pH值为7，在30℃100rpm的摇床反应96h，定时取样通过分光光度法测定降解率。降解率测定同实施例1，结果如表3所示。

表3无色杆菌GDUTAN5对不同初始浓度的一甲胺的降解率

一甲胺浓度(mg/L)	降解率
		5	92.3％
10	84.1％
		40	65.5％
70	49.3％
		100	35.1％
130	20.6％

从表3中可以看出，本发明筛选得到无色杆菌GDUTAN5在该条件下对一甲胺的降解能力最高可达92.3％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东工业大学

<120> 一株具有一甲胺降解能力的无色杆菌及其应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1359

<212> DNA

<213> 无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans) GDUTAN5

<400> 1

caagtcgaac ggcagcacgg acttcggtct ggtggcgagt ggcgaacggg tgagtaatgt 60

atcggaacgt gcccagtagc gggggataac tacgcgaaag cgtagctaat accgcatacg 120

ccctacgggg gaaagcaggg gatcgcaaga ccttgcacta ttggagcggc cgatatcgga 180

ttagctagtt ggtggggtaa cggctcacca aggcgacgat ccgtagctgg tttgagagga 240

cgaccagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 300

attttggaca atgggggaaa ccctgatcca gccatcccgc gtgtgcgatg aaggccttcg 360

ggttgtaaag cacttttggc aggaaagaaa cgtcgcgggt taataccccg cgaaactgac 420

ggtacctgca gaataagcac cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt 480

gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgtgcgca ggcggttcgg aaagaaagat 540

gtgaaatccc agagcttaac tttggaactg catttttaac taccgggcta gagtgtgtca 600

gagggaggtg gaattccgcg tgtagcagtg aaatgcgtag atatgcggag gaacaccgat 660

ggcgaaggca gcctcctggg ataacactga cgctcatgca cgaaagcgtg gggagcaaac 720

aggattagat accctggtag tccacgccct aaacgatgtc aactagctgt tggggccttc 780

gggccttggt agcgcagcta acgcgtgaag ttgaccgcct ggggagtacg gtcgcaagat 840

taaaactcaa aggaattgac ggggacccgc acaagcggtg gatgatgtgg attaattcga 900

tgcaacgcga aaaaccttac ctacccttga catgtctgga atgccgaaga gatttggcag 960

tgctcgcaag agaaccggaa cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1020

tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtcatt agttgctacg aaagggcact 1080

ctaatgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag tcctcatggc 1140

ccttatgggt agggcttcac acgtcataca atggtcggga cagagggtcg ccaacccgcg 1200

agggggagcc aatcccagaa acccgatcgt agtccggatc gcagtctgca actcgactgc 1260

gtgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgtcg cggtgaatac gttcccgggt 1320

cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtgggtttt 1359

Claims

1.一株具有一甲胺降解能力的无色杆菌的应用，其特征在于，该菌株名称为无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)GDUTAN5，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学校内；保藏编号为CCTCC NO：M2017285，保藏日期为2017年5月24日；所述的一株具有一甲胺降解能力的无色杆菌能够降解大气、水体或者土壤中的一甲胺，在底物浓度为5mg/L条件下降解96h，降解率达92.3％。