CN100386428C - 耐氯菌株s616及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种耐氯微生物。一株耐氯菌株S616，其特征在于所述的菌株为坚强芽饱杆菌(Bacillus firmus)S616CCTCC NO.M205146。所述的一株耐氯菌株S616的菌落形态：幼龄菌菌落呈车轮状，乳白色不透明；老龄菌呈土灰色、边缘不齐；生理特征：细胞常呈对或链状排列，周生鞭毛，运动，产芽孢，革兰氏阳性，兼性厌氧，0.2～0.4μm×1.4～2.1μm，最适生长pH值：6.5～7.5，生长温度：30-40℃；主要生化特征：接触酶阳性，氧化酶阴性，水解酪朊、明胶和淀粉。它既可在含高浓度氯离子环境下生存、又可高效降解高浓度有机污染物。

Description

耐氯菌株S616及其筛选方法

技术领域

本发明涉及一种耐氯微生物及其筛选方法。

背景技术

高盐度难降解有机废水，如石油开采、化工、制药等废水已经成为环保水处理领域的世界性技术难题。而盐酸法黄姜皂素生产废水在高浓度含盐难降解有机物废水中具代表性。一方面，这类废水成分复杂，难降解的有机物多，废水的可生化性差；另一方面，废水中的盐含量高，氯离子浓度大，其混合废水中氯离子浓度可达20000mg/L。目前，含盐有机废水采用非生物方法和生物方法，非生物方法由于其处理费用高、处理效果不好，企业无法接受，生化法一直是水处理工艺中的首先方法，主要采用A-B两段接触氧化法，传统活性污泥法，SBR法，生物滤池，厌氧滤池等，但是上述生物法大多只能处理含盐量为3％以下的废水，而对高盐废水(含盐量5％，甚至20％)难以处理，因此需要特殊的微生物。近年来，国外已报道了有关选育耐盐(NaCl)菌处理高盐有机废水的报道，而对皂素废水这类高浓度有机物含量、高盐(CaCl₂)、含难降解物质(皂素)复杂的废水，至今还属于研究之薄弱领域。

发明内容

本发明的目的在于提供一株可处理含高浓度氯离子废水的耐氯菌株S616及其筛选方法。

本发明所提供的耐氯菌株S616，为坚强芽孢杆菌(Bacillus furmus)S616 CCTCCNO.M205146，已于2005年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号：CCTCC NO.M205146。

所述的一株耐氯菌株S616的菌落形态：幼龄菌菌落呈车轮状，乳白色不透明；老龄菌呈土灰色、边缘不齐；生理特征：细胞常呈对或链状排列，周生鞭毛，运动，产芽孢，革兰氏阳性，兼性厌氧，0.2～0.4μm×1.4～2.1μm，最适生长pH值：6.5～7.5，生长温度：30-40℃；主要生化特征：接触酶阳性，氧化酶阴性，水解酪朊、明胶和淀粉。

一株耐氯菌株S616的筛选方法，

1).菌胶团的破碎：

取皂素废水处理系统中的厌氧活性污泥，按厌氧活性污泥∶无菌水＝2g∶100ml的配比，加入事先灭菌好的装有无菌水的三角瓶内，并加入重量为无菌水0.01％的焦磷酸钠，摇床振荡，将菌胶团打碎，得泥水混合物，备用；

2).耐氯离子优势菌种的分离：

利用无菌移液管吸取上述泥水混合物，按泥水混合物∶分离培养基＝0.5ml∶4.5ml的配比，加入分离培养基，30-40℃厌氧恒温培养5-7天，待试管培养基变混浊，说明细菌已经生长，然后平板稀释涂布，挑取在菌落特征上有明显差异的单菌，直至获得单一菌株，并于斜面培养基上保存；

3).耐氯离子优势菌种的筛选：

挑取上述分离出的单菌落，分别接种于筛选培养基内，30-40℃厌氧恒温培养5-7天，观察菌悬液的混浊情况，变混浊的即为筛选出的耐氯离子的菌株；经过筛选，获得一株编号为菌株S616的菌株，即耐氯菌株S616。

分离培养基：CH₃CH₂COONa 30mmol，CH₃CH₂CH₂COONa 30mmol，CH₃CHOHCOONa30mmol，酵母菌2.0g，MgCl₂ 0.1g，NH₄Cl 1.0g，K₂HPO4 0.4g，刃天青0.002g，半胱氨酸0.5g，蒸馏水1000ml，pH＝7.0～7.3。

筛选培养基：MgSO4·7H₂O，0.2g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，NH₄Cl 0.5/L，CaCl₂135g/L，1ml微量元素溶液，溶入1L皂素废水(COD浓度为1000mg/L)，pH＝7.5，

微量元素溶液：FeCl₃·6H₂O 2g，CoCl₂ 2g，MnCl₂ 0.5g，CuCl₂ 0.03g，ZnCl₂ 0.05g，NiCl₂.6H₂O 0.05g，EDTA 1g，pH＝7.0。

扩大培养基：蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化钠；5g；蒸馏水1000ml；CaCl₂18.0g/L。

SC培养基：蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化钠；5g；蒸馏水1000ml；琼脂20g(固)；CaCl₂的加入量为0-140g。

斜面培养基：蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化钠；5g；磷酸二氢钾2g；氯化铵1g；琼脂20g；蒸馏水1000ml；CaCl₂ 18g/L，pH＝7.5。

以上培养基分别于121℃高压灭菌30min后备用。

所述的一株坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)S616 CCTCC NO.M205146应用于含高浓度氯离子废水的处理方法为：挑取坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)S616单菌落，于扩大培养基中培养24h，按培养后的坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)S616：含高浓度氯离子废水(如混合皂素废水)的体积比为(1-4)∶50取坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)S616接种于含高浓度氯离子废水(如混合皂素废水)中，30-40℃恒温培养，pH值为7.0-8.0，反应48-72小时。

本发明从皂素废水处理系统中的活性污泥中分离、筛选到一株在高浓度氯离子条件下具有一定生长能力的新菌株。并对其耐氯能力进行了研究，结果表明，在高浓度氯离子条件下，耐氯菌株S616的耐氯能力好，范围广，能在[Cl^-]为3000-75000mg/L时具有较好的生长能力。如果将其作为处理高盐度的有机废水的生物系统中的投加诱导菌，可以克服一般活性污泥的微生物受高氯离子的抑制、活性低、处理效率不高的缺点。由于在高氯离子(20000mg/L)环境中，传统工艺的微生物受氯离子渗透压的作用而使质膜受损、代谢功能下降从而使处理效果降低，相比之下，如果生化系统中直接投加耐高氯离子并且具有良好降解性能的菌株，就能克服上述传统工艺处理高浓度氯离子难降解有机废水的缺点。

以含高盐(CaCl₂盐)的难降解的高浓度有机废水-皂素废水为例，研究了其降解有机污染物的效果。结果发现该菌株能有效去除皂素废水中COD的能力，能在72小时之内去除废水中的COD约为60-70％。

本发明获得的新菌株既可在含高浓度氯离子环境下生存、又可高效降解高浓度有机污染物。

附图说明

图1-1a是菌株S616菌株投影电镜图片

图1-1b是菌株S616菌株投影电镜图片

图1-2是菌株S616在液体不同氯离子浓度的SC培养基上生长情况图

图1-3是菌株S616的PCR产物琼脂糖电泳图(1：核DNA，2：扩增产物，M：Marker)

图1-4a是菌株S616在高氯离子、高COD浓度下的下降解效率图

图1-4b是菌株S616在高氯离子、高COD浓度下的下降解效率图

图1-4c是菌株S616在高氯离子、高COD浓度下的下降解效率图

图1-4d是菌株S616在高氯离子、高COD浓度下的下降解效率图

具体实施方式

一、一株耐氯菌株S616的筛选方法：

(一)、材料准备：

1、菌源和实验废水：

(1)菌源：处理皂素废水的生化系统中的活性污泥；

(2)实验废水(即混合皂素废水)：取自湖北省十堰市方坤置业有限公司皂素生产废水；经内电解和CaO调配后，具体指标为：pH＝7.5-8.2，COD＝4000-17000mg/L，Cl^-＝8000-30000mg/L，NH₄-N 140-300mg/L。

2、培养基：

分离培养基：CH₃CH₂COONa 30mmol，CH₃CH₂CH₂COONa 30mmol，CH₃CHOHCOONa30mmol，酵母菌2.0g，MgCl₂ 0.1g，NH₄Cl 1.0g，K₂HPO4 0.4g，刃天青0.002g，半胱氨酸0.5g，蒸馏水1000ml，pH＝7.0～73。

筛选培养基：MgSO4·7H₂O，0.2g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，NH₄Cl 0.5/L，CaCl₂135g/L，1ml微量元素溶液，溶入1L皂素废水(COD浓度为1000mg/L)，pH＝7.5，

微量元素溶液：FeCl₃·6H₂O 2g，CoCl₂ 2g，MnCl₂ 0.5g，CuCl₂ 0.03g，ZnCl₂ 0.05g，NiCl₂.6H₂O 0.05g，EDTA 1g，pH＝7.0。

扩大培养基：蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化钠；5g；蒸馏水1000ml；CaCl₂ 18.0g/L。

SC培养基：蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化钠；5g；蒸馏水1000ml；，琼脂20g(固)；CaCl₂的加入量为0-140g；当CaCl₂加入量为0g时，SC培养基内[Cl^-]＝3000mg/L。

斜面培养基：蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化钠；5g；磷酸二氢钾2g；氯化铵1g；琼脂20g；蒸馏水1000ml；CaCl₂18g/L，pH＝7.5。

以上培养基分别于121℃高压灭菌30min后备用。

3、实验仪器和设备：

国华SHA-B恒温振荡器，

SHH150G光照生物培养箱，

卧式压力蒸汽灭菌器，

WMX-1型微波密封消解COD速测仪，

722S分光光度计，

光学显微镜，

pH计，

超净工作台，

鼓风干燥箱，

超薄切片机，

日立H-7000FA投射显微镜，

PTC200型PCR仪，

电泳仪及电泳槽，

凝胶紫外观测仪等。

(二)、菌株的分离与筛选：

1).菌胶团的破碎：

取2g皂素废水处理系统中的厌氧活性污泥，加入事先灭菌好的装有100ml无菌水的250ml的三角瓶内，并加入重量为无菌水0.01％的焦磷酸钠，摇床振荡，将菌胶团打碎，得泥水混合物，备用；

2).耐氯离子优势菌种的分离：

利用无菌移液管吸取0.5ml上述泥水混合物，加入分离培养基4.5ml，30-40℃(最佳35℃)厌氧恒温培养5-7天，待试管培养基变混浊，说明细菌已经生长，然后平板稀释涂布，挑取在菌落特征上有明显差异的单菌，直至获得单一菌株，并于斜面培养基上保存；

3).耐氯离子优势菌种的筛选：

挑取上述分离出的单菌落，分别接种于筛选培养基内，30-40℃(最佳35℃)厌氧恒温培养5-7天，观察菌悬液的混浊情况，变混浊的即为筛选出的耐氯离子的菌株；经过筛选，获得一株编号为菌株S616的菌株，即耐氯菌株S616。

菌株S616在加入不同浓度氯离子的液体SC培养基上生长情况如附图1-2所示。

二、耐氯微生物菌株鉴定：

1、对耐氯性能较强的菌株S616的鉴定：

对耐氯性能较强的菌株S616进行了生理生化的鉴定以及16S rDNA分子的鉴定，从分子水平确定耐氯菌株的种属。

16S rDNA序列分析主要按照以下步骤：

①细菌核DNA的提取：

1)用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于扩大培养基内培养过夜，取1.5ml菌液于Eppendorf管内，8,000rpm室温离心5min，彻底除去上清。

2)加STE缓冲液1.5ml洗涤一次，离心弃上清，再加入0.6mlTE溶液，重悬细菌。

3)加30ul10mg/ml的溶菌酶，37℃水浴45min

4)加65μl 10％的SDS，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃水浴2小时，至溶液变清。

5)加入等积体酚氯仿抽提三次，直至看不到蛋白层为止。

6)在上清液中加入1/10体积的3M的NaAc(pH5.2)。

7)加入等体积的异丙醇，沉淀DNA。用玻璃棒缠绕挑出DNA细丝，在用70％的乙醇洗涤一次，自然凉干，并将DNA溶于100μl TE溶液中。

8)加入终浓度为50μg/ml的RNase，37℃，30min，去除RNA，-20℃保存备用。②16S rDNA基因的PCR扩增

P1：正向引物5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’

P2：反向引物5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’

在50μL反应体积中，加入1μL模板DNA(0.1μg)，0.5μL P1和P2(终浓度为0.5μM)，1μLdNTP(每种NTP0.2mM)，0.5μLTaq聚合酶(2U)和5μL 10×PCR缓冲液。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；在94℃变性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃终延伸10min。

③PCR产物的回收

将PCR产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶，放入1.5ml离心管中加2倍体积TE，65℃水浴10分钟后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍体积的10mol/L乙酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用70％乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水。

④16S rDNA的全序列测定和分析

P-f：CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC；

P-r：GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。

加入1μL模板DNA(＜0.1μg)，PCR扩增30个循环(94℃ 1min，55℃ 30s，72℃2min)。采用ABI PRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应。然后，在Applied Biosystem 373A DNA测序仪上测序。测得的16S rDNA序列采用BLAST软件与GenBank数据库比较分析，最终从分于水平上确定该菌的种属。

2、16S rDNA序列测定：

本发明采用对16S rDNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的核DNA为模板，以16S rDNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为1425bp的扩增带(用1％琼脂糖凝胶电泳检测)，如图1-3所示。PCR产物经纯化后，测定其全序列。

<110>中国地质大学(武汉)

<120>耐氯菌株S616及其筛选方法

<160>1425

<210>1

<211>11425bp

<212>DNA

<213>坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)

<220>

<221>misc_feature

<222>

<400>1

GCCTATGGTGCGGTCGCGCGAATCTGAGGGAGCTTGGTCCCAAAGATTAGCGGCGGACGG    60

GTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTA   120

ATACCGGATAATCCCTTTCCTCACATGAGGAAAGGCTGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACT   180

TACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGA   240

TGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAAACACGGCCCAAACTCC   300

TACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCG   360

CGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTATCGG   420

AGTAACTGCCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGC   480

AGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGC   540

AGGTGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAA   600

CTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTA   660

GAGATTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGC   720

GCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGA   780

GTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCG   840

CCTGGGGAGTACGACCGCaAGGTTGAAACTCaAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG   900

GTGGAGCATGTTGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTC   960

TGACAATCCTAGAGATAGGACGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGT  1020

TGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGAT  1080

CTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAA  1140

GGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAAT  1200

GGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTTTAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAG  1260

TTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCA  1320

GCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGT  1380

TTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGC                 1425

三、菌株S616菌落形态、生理和生化特征见表1-1；细胞形态见图1-1a、图1-1b。

表1-1：

菌株S616的菌落形态特征以及主要的生理特征：

表中符号说明：“+”：90％以上的菌株为阳性，“-”：90％以上的菌株为阴性。

四、菌株S616为新的菌株：

将菌株S616的16S rDNA基因序列与国际GenBank数据库中的序列进行网上同源性比较发现，细菌S616与Bacillus firmus(坚强芽孢杆菌)多个菌株的同源性高达98-99％以上。综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，可确定细菌S616为坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)，菌株S616命名为坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)S616(即耐氯菌株S616)，查阅有关资料，尚无芽孢杆菌属有关高浓度氯离子条件下难降解有机废水以及对其耐氯能力研究的报道。坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)S616为新的菌株，已于2005年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号：CCTCC NO.M205146。

本实验分离、筛选出的菌株S616，具有较好降解高浓度氯离子难降解皂素废水的功能。这就拓宽了人们对坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)在其功能方面的应用研究思路，并为降解含高浓度氯离子皂素废水提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。

五、耐氯菌株S616的应用：

(一)、菌株S616对皂素废水降解能力：

取皂素生产混合废水，稀释3-5倍数，使其COD为5000mg/L，用CaCl₂调节[Cl^-]为2万mg/L，取废水50ml分别加入250ml的锥形瓶中，加入菌株S616的菌悬液1ml，35℃、140-160rpm、pH值＝7.0-7.5，摇床振荡3天，计算菌株对废水的COD的去除情况，菌株S616去除COD的效率好，为60-70％。降解因素实验结果见图1-4a、图1-4b、图1-4c、图1-4d。

所述的扩大培养基为：蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸馏水1000ml；琼脂20g(固)；CaCl₂18.0g/L，pH＝7.0-7.5。

(二)、菌株S616降解皂素废水的因素试验：

1)为了考察菌株在不同氯离子浓度下，对COD的去除效果，在废水中加CaCl₂调节氯离子浓度分别为：9864.2、14980、21061、24780、30080mg/L。耐氯菌株S616去除效果结果如图1-4a。

从图1-4a可以看出，当[Cl^-]＝9864.2mg/L时，反应时间为3d，菌株S616对COD的去除率仅为42.96％，但是随着废水中氯离子浓度的升高，菌株S616对COD的去除率增加，当废水中氯离子浓度达到2万mg/L时，菌株S616对COD的去除率可达78.89％，并且菌株S616对COD的去除率随着废水中氯离子浓度的继续增加而变化不大，当废水中氯离子浓度高达3万mg/L时，菌株S616对COD的去除率仍保持在70％。

2)为了考察菌株在不同COD浓度下(6610.4、7906.4、11209.6、13420.0、16196.2mg/L)，对COD的去除效果，在废水中加CaCl₂调节氯离子浓度分别为20000mg/L。耐氯菌株S616去除效果结果如图1-4b。通过实验可知：当废水中[Cl^-]＝20000mg/L、COD浓度达到1万mg/L时，菌株S616对COD的去除率较好，可达73.2％。

3)从图1-4c和1-4d可以看出，菌株S616对COD的去除率随pH的增加先增加后下降，其最高去除率在pH为7.5-8时，达到70％。离心处理后的废水，发现pH为7-8时，湿菌体量明显高于pH为9、10、11时，可见在pH在中性时，有利于菌株的生长；当接种量在1-4ml之间变化时，菌株S616对COD的去除率无明显变化，基本为70％，当接种量为1ml时，其去除率最好。这是因为菌株的生长需要一定的营养物质，当菌悬液为1ml时，其需要的物质容易得到满足。

Claims (2)

1.一株耐氯菌株S616，其特征在于所述的菌株为坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)S616CCTCC NO.M205146。

2.根据权利要求1所述的一株耐氯菌株S616，其特征在于：所述的一株耐氯菌株S616的菌落形态：幼龄菌菌落呈车轮状，乳白色不透明；老龄菌呈土灰色、边缘不齐；生理特征：细胞常呈对或链状排列，周生鞭毛，运动，产芽孢，革兰氏阳性，兼性厌氧，0.2～0.4μm×1.4～2.1μm，最适生长pH值：6.5～7.5，生长温度：30-40℃；主要生化特征：接触酶阳性，氧化酶阴性，水解酪朊、明胶和淀粉。

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