CN108130288A - 赤红球菌及其降解有机污染物的应用 - Google Patents

赤红球菌及其降解有机污染物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种赤红球菌FQ‑2及其降解丙酮等工业常见有机污染物的应用，所述应用方法为：将赤红球菌FQ‑2接种至含丙酮等工业常见有机污染物的无机盐培养基中，在30℃、160r/min条件下进行降解反应，实现对这些有机污染物的降解；所述工业常见的有机污染物包括丙酮、正己烷、二硫化碳、氯苯、乙酸丁酯、乙酸乙酯或α‑蒎烯。本发明中的赤红球菌FQ‑2取自浙江省某制药厂曝气池活性污泥，对于VOCs类有机污染物，尤其是丙酮具有较好地降解效果，可以较为完全地把丙酮转化为CO2、H2O、细胞生物量等无害物质；同时，该菌株也能不同程度地降解二硫化碳、氯苯等工业常见的污染物，因而在工业废气废水的生物净化中具有广阔的应用前景。

Description

赤红球菌及其降解有机污染物的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种有机化合物的生物降解技术，特别涉及一株赤红球菌(Rhodococcus ruber)FQ-2，及其在降解丙酮等工业常见有机污染物中的应用。
(二)背景技术
丙酮(分子式：CH3COCH3)是一种常见的有机溶剂，是一种易挥发有机化合物(VOCs)，在橡胶、制革和喷漆等生产企业和工业过程中广泛使用。丙酮易燃易挥发，化学性质比较活泼，对眼睛、鼻子和咽喉有刺激性，人长时间接触该化学品，可致眩晕、灼烧感、咽炎、支气管炎、乏力、易激动等。因此寻找有效防治丙酮污染的对策刻不容缓，对人类健康和环境保护具有重大意义。
用物理化学法处理VOCs时，会存在一些问题，比如吸收法和燃烧法易造成二次污染，冷凝法费用较高。与物理化学法相比，用生物法处理VOCs，具有简单高效、能耗低、费用低、无二次污染等特点，因此生物法处理VOCs越来越受到重视。大量研究表明从环境中分离筛选高效降解VOCs的细菌，仍然是消除环境中该类污染物的重要方法之一。
红球菌属于放线菌门、放线菌纲、放线菌目、诺卡氏菌科，是一类含有独特的细胞壁结构的细菌。红球菌含有大型基因组与环状质粒，可分泌大量的活性酶，能够降解石油烷烃、芳香烃、多环芳烃、有机农药残留等环境污染物，还可以分解脂肪酶、腈水合酶和胆固醇氧化酶等，可运用到环境的生物修复中。
研究者从一些受污染的环境中已分离到了一些具有丙酮降解能力的菌株。如：从胜利油田石油污染土壤中分离到1株能够分别以环己烷、环己酮为唯一碳源的降解菌A-1，经形态及生理生化特征和16SrDNA的全序列测序分析，初步鉴定为节杆菌属(Arthrobactersp.)。该菌株还能降解丙酮、辛烷、甲苯等链烃和芳烃；从生长银杏树的土壤中驯化分离得到两株能降解甲基叔丁基醚的纯培养微生物，其中一株为球菌(BC-1),另一株为杆菌(BC-2)，试验中检测到的甲基叔丁基醚降解产物有丙酮等,其也能被这些微生物继续降解。
中国专利-一株具有低温降解石油功能的红球菌及其应用(201610289660.5)公开了一种红球菌QY-2，能高效降解石油，其中石油主要包括烷烃、环烷烃和芳香烃。但在该专利中报道了该红球菌能降解石油，对于其他工业常见的污染物是否具有降解能力并未提及。本发明提及的丙酮和石油结构迥异，丙酮分子中含有氧原子，而石油是一些碳氢化合物的混合物，所含的烷烃、环烷烃和芳香烃分子结构中并不含有氧原子，因此若仅从能降解石油就推断出所述的菌株能降解丙酮是不科学的。此外，本发明还报道了红球菌还能利用二硫化碳、氯苯、乙酸丁酯、乙酸乙酯或α-蒎烯等工业常见的污染物作为碳源生长。
(三)发明内容
本发明目的是克服现有技术中的不足而提供一种高效的具有丙酮等有机污染物降解能力的赤红球菌及其应用，解决了其他技术在降解丙酮等有机污染物易产生二次污染、条件要求高等问题。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株具有丙酮等工业常见有机污染物降解性能的菌株--赤红球菌(Rhodococcus ruber)FQ-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017565，保藏日期：2017年9月30日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
本发明还提供一种所述赤红球菌FQ-2在降解有机污染物的应用。
进一步，所述有机污染物包括丙酮、正己烷、二硫化碳、氯苯、乙酸丁酯、乙酸乙酯或α-蒎烯，优选为丙酮、正己烷、氯苯或乙酸乙酯，更优选为丙酮。
进一步，所述应用方法为：将赤红球菌FQ-2接种至含有机污染物的无机盐培养基中，在30℃、160r/min条件下进行降解反应，实现对有机污染物的降解；所述无机盐培养基组成为：KH2PO4 0.234g·L-1、K2HPO4·3H2O 0.942g·L-1、MgCl2 0.2033g·L-1、NH4Cl0.98g·L-1、CaCl2 0.0111g·L-1、NaNO3 1.7g·L-1、FeCl3 0.0162g·L-1，微量元素母液5mL·L-1，溶剂为去离子水，pH 7.0；其中微量元素母液组成：CuSO4·5H2O 0.02g·L-1、FeSO4·7H2O1.0g·L-1、MnSO4·4H2O 0.10g·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.02g·L-1、CoCl2·6H2O0.02g·L-1、H3BO3 0.014g·L-1、ZnSO4·7H2O 0.10g·L-1，溶剂为去离子水。
进一步，所述有机污染物的初始加入浓度为50-200mg/L，优选50mg/L。所述赤红球菌FQ-2接种量以OD600计为0.05～0.20，优选0.1-0.2。
进一步，所述赤红球菌FQ-2接种前先进行活化培养，然后将活化培养后的菌液接种至无机盐培养基，使OD600为0.05～0.20，所述的活化培养是将赤红球菌FQ-2接种至LB液体培养基，在30℃、160r/min恒温振荡培养至OD600为0.50～0.80，获得活化的赤红球菌FQ-2菌液；所述LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH值7。
本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明中的赤红球菌(Rhodococcusruber)FQ-2取自浙江省某制药厂曝气池活性污泥，对于VOCs类有机污染物，尤其是丙酮具有较好地降解效果，能在12h内将50mg/L的丙酮较为完全地把丙酮转化为CO2、H2O、细胞生物量等无害物质；同时，该菌株也能不同程度地降解二硫化碳、氯苯等工业常见的污染物，因而在工业废气废水的生物净化中具有广阔的应用前景。
(四)附图说明
图1为赤红球菌FQ-2在LB培养基上菌落形态照片。
图2为赤红球菌FQ-2的系统发育树图。
图3为赤红球菌FQ-2菌体生长曲线。
图4为赤红球菌FQ-2对50mg/L丙酮的降解效果图。
图5为赤红球菌FQ-2降解50mg/L丙酮时CO2的变化。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：菌株的分离、纯化及其鉴定
1.赤红球菌(Rhodococcus ruber)FQ-2的分离及纯化。
赤红球菌(Rhodococcus ruber)FQ-2是从浙江省某制药厂曝气池中的活性污泥中驯化、分离得到的一株真菌。具体步骤如下：
取浙江省某制药厂曝气池中的活性污泥。自来水淘洗五次后，空曝48h，尽量去除残留的有机物。配制初始无机盐培养液，接种活性污泥，以初始浓度为50mg/L丙酮为唯一碳源对活性污泥进行定向驯化，每3d更换新鲜无机盐培养液，40d左右即可分离。
初始无机盐培养基组成：KH2PO4 0.45g/L、Na2HPO4 0.47g/L、(NH4)2SO4 2.0g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、无水CaCl2 0.01g/L、微量元素(MnSO4·H2O 0.001g/L、ZnSO4·7H2O0.001g/L、FeSO4 0.001g/L、CuSO4·5H2O 0.001g/L)，溶剂为蒸馏水1000mL，pH＝6，分装于250mL的密封盐水瓶(50mL/个)，110℃灭菌40min。
从驯化瓶中取50ml上清液进行离心，将沉淀下来的污泥加入到装有50ml的无机盐培养基(已灭菌)的盐水瓶中。盖上瓶塞后加入丙酮(浓度为50mg/L)。放置在30℃，160rpm的摇床中培养。隔一段时间观察盐水瓶中菌体生长情况，并利用气相色谱法测定盐水瓶中丙酮浓度，待丙酮检测不到时，在盐水瓶中取5mL菌悬液到装有新鲜的50mL的无机盐培养基的瓶中，重复上述操作3次。
待最后一次的盐水瓶中丙酮降解完全，取2mL混合菌液，涂布于含有50mg/L丙酮的固体无机盐培养基(即在前述的初始无机盐培养基中加入琼脂至16g/L)上，连续划线分离，最终获得纯化菌株FQ-2，接种到LB斜面固体培养基中，在4℃的冰箱中保存。LB固体斜面培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，琼脂16g/L，溶剂为去离子水，pH值7，于121℃高压蒸汽灭菌20min。
2.赤红球菌(Rhodococcus ruber)FQ-2的鉴定。
(1)菌株FQ-2的生理生化特性。
菌株FQ-2在LB平板固体培养基上培养2-3天后，可见其菌落粗糙、圆形、隆起、赤红色、不透明、边缘整齐(图1)。其生理生化特性检测结果如表1所示。
表1菌株FQ-2生理生化特性
注：“+”阳性，“-”阴性。
(2)细菌16s DNA序列(SEQ ID NO:1)分析，具体步骤如下：
PCR扩增反应体系见表2。
PCR扩增的反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，循环32次；72℃延伸10min，10℃保存。
表2PCR扩增反应体系
反应体系成分 体积(μl)
10×Ex Taq buffer 2.0
2.5mM dNTP Mix 1.6
5p Primer 1 0.8
5p Primer 2 0.8
Template 0.5
5u Ex Taq 0.2
超纯水 14.1
总体积 20
将菌株FQ-2的DNA序列上传到Genbank，获得Genbank登录号为MF563612。同时该序列与NCBI数据库中的基因序列进行Blast对比。结果表明FQ-2菌株的DNA序列与菌株Rhodococcus ruber(LRRL01000064)(该菌株可降解四氢呋喃)具有99％以上的同源性。从结果中选取9株具有代表性的菌株，以DNA基因序列同源性为基础，结合采用MEGA5.0软件构建系统发育树(图2)。
通过生理生化特征、遗传距离及DNA序列对比，鉴定菌株FQ-2为赤红球菌(Rhodococcus ruber)，命名为赤红球菌(Rhodococcus ruber)FQ-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017565，保藏日期：2017年9月30日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。
实施例2：赤红球菌FQ-2的生长曲线。
将赤红球菌FQ-2接种至LB液体培养基后，在恒温摇床(30℃、160r/min)中进行振荡培养，每隔一小时测定菌液的OD600，并绘制菌株的生长曲线。LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH值＝7，于121℃高压蒸汽灭菌20min。
实验测定的菌体生长曲线如图3所示。赤红球菌FQ-2能在LB培养基中不断生长并在12h左右达到稳定期，但继续观测后发现其24h后仍处稳定期，一般细菌生长的稳定期为8-12h，推测用LB培养基测定菌株生长曲线过程中，死去的菌体没有发生自溶现象，在培养基中依旧存在，从而影响了OD的测定。
实施例3：赤红球菌FQ-2降解丙酮。
将保存在LB固体培养基上的赤红球菌FQ-2接种至LB液体培养基中，在恒温摇床(30℃、160r/min)中进行振荡培养12h(OD＝0.7)，8000rpm离心10分钟后，将获得的细胞接种至无机盐培养基中(初始OD600为0.20)，加入3μL丙酮(浓度为50mg/L)，在恒温摇床(30℃、160r/min)中进行振荡培养，每隔一段时间利用气相色谱法测定丙酮浓度。实验设置两组平行组以及空白组(不接菌液)。
LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH值＝7，于121℃高压蒸汽灭菌20min。
微量元素母液组成：CuSO4·5H2O 0.02g·L-1、FeSO4·7H2O1.0g·L-1、MnSO4·4H2O0.10g·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.02g·L-1、CoCl2·6H2O 0.02g·L-1、H3BO3 0.014g·L-1、ZnSO4·7H2O 0.10g·L-1，溶剂为去离子水；
无机盐培养基终浓度组成：KH2PO4 0.234g·L-1、K2HPO4·3H2O 0.942g·L-1、MgCl20.2033g·L-1、NH4Cl 0.98g·L-1、CaCl2 0.0111g·L-1、NaNO3 1.7g·L-1、FeCl3 0.0162g·L-1，微量元素母液5mL·L-1，溶剂为去离子水，pH 7.0，于110℃高压蒸汽灭菌40min。
细菌降解底物性能的好坏包括菌株安全降解底物的时间，时间越短说明菌株降解底物的性能越好。赤红球菌FQ-2降解50mg/L丙酮(图4)，约12h就能降解完全，产生较多的CO2(图5)，说明菌株降解丙酮的矿化率高，二次污染少。
实施例4：赤红球菌FQ-2降解底物的广谱性。
在实际应用中，不仅仅存在丙酮这一种有机污染物，工业废气中往往是多组分的有机污染物共存，因此，研究细菌FQ-2对其他底物的降解效果很有必要。
将保存在LB固体培养基上的赤红球菌FQ-2接种至LB液体培养基中，在恒温摇床(30℃、160r/min)中进行振荡培养12h(OD＝0.60)，8000rpm离心10分钟后将获得的赤红球菌FQ-2细胞用无机盐培养基(组成同实施例3)重复洗涤3次，彻底去除残留的LB后，以无机盐培养基重悬。将上述菌悬液加入50mL无机盐液体培养基中(OD＝0.15)，分别加入丙酮、正己烷、二硫化碳、氯苯、乙酸丁酯、乙酸乙酯及α-蒎烯作为唯一碳源(初始浓度均为50mg/L)，在恒温摇床(30℃、160r/min)中进行振荡培养，利用气相色谱法检测菌株FQ-2对这几种底物的降解能力。赤红球菌FQ-2对初始浓度为50mg/L的这些不同碳氢化合物的降解效果如表3所示。结果表明，赤红球菌FQ-2能不同程度的降解丙酮、正己烷、二硫化碳、氯苯、乙酸丁酯、乙酸乙酯或α-蒎烯等类的碳氢化合物。
表3赤红球菌FQ-2对不同碳源的降解效果
物质名称 初始浓度(mg/L) 去除率(％)
丙酮 50 100
正己烷 50 98.91
二硫化碳 50 64.52
氯苯 50 99.71
乙酸丁酯 50 65.61
乙酸乙酯 50 97.96
α-蒎烯 50 59.65
如表3所示，菌株只能部分降解二硫化碳、乙酸丁酯、α-蒎烯；能高效去除丙酮、正己烷、氯苯和乙酸乙酯；乙酸乙酯和丙酮溶于水，溶解度相对较大，所以其去除率较高。
进一步表明，赤红球菌FQ-2能不同程度的降解丙酮、正己烷、二硫化碳、氯苯、乙酸丁酯、乙酸乙酯以及α-蒎烯等工业常见有机污染物。
实施例5：赤红球菌FQ-2降解不同浓度的丙酮。
将保存在LB固体培养基上的赤红球菌FQ-2接种至LB液体培养基(组成同实施例3)中，在恒温摇床(30℃、160r/min)中进行振荡培养12h(OD＝0.50)，8000rpm离心10分钟后将获得的细胞接种至无机盐培养基中(初始OD600为0.10，组成同实施例3)，加入丙酮使其最终浓度分别为50、100、150和200mg/L，在恒温摇床(30℃、160r/min)中进行振荡培养，每隔一段时间利用气相色谱法测定丙酮浓度。实验设置两组平行组以及空白组(不接菌液)。
赤红球菌FQ-2对不同浓度丙酮的降解情况如表4所示。可以发现，对于50mg/L-200mg/L的丙酮，该菌株需要16-40h就能将它们降解完。
表4赤红球菌FQ-2对不同浓度丙酮的降解情况
虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 赤红球菌及其降解有机污染物的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1433
<212> DNA
<213> 赤红球菌(Rhodococcus ruber)
<400> 1
acgcctgggc gggcgtgcta acacatgcag tcgaacgatg aagcccagct tgctgggtgg 60
attagtggcg aacgggtgag taacacgtgg gtgatctgcc ctgcacttcg ggataagcct 120
gggaaactgg gtctaatacc ggataggacc tcgggatgca tgttccgggg tggaaaggtt 180
ttccggtgca ggatgggccc gcggcctatc agcttgttgg tggggtaacg gcccaccaag 240
gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggcg accggccaca ctgggactga gacacggccc 300
agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc 360
gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct ctttcagtac cgacgaagcg 420
caagtgacgg taggtacaga agaagcaccg gccaactacg tgccagcagc cgcggtaata 480
cgtagggtgc gagcgttgtc cggaattact gggcgtaaag agctcgtagg cggtttgtcg 540
cgtcgtctgt gaaaacccgc agctcaactg cgggcttgca ggcgatacgg gcagacttga 600
gtactgcagg ggagactgga attcctggtg tagcggtgaa atgcgcagat atcaggagga 660
acaccggtgg cgaaggcggg tctctgggca gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg 720
tagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acggtgggcg ctaggtgtgg 780
gtttccttcc acgggatccg tgccgtagct aacgcattaa gcgccccgcc tggggagtac 840
ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggc ggagcatgtg 900
gattaattcg atgcaacgcg aagaacctta cctgggtttg acatacaccg gaccgcccca 960
gagatggggt ttcccttgtg gtcggtgtac aggtggtgca tggctgtcgt cagctcgtgt 1020
cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgtcctgtgt tgccagcacg 1080
taatggtggg gactcgcagg agactgccgg ggtcaactcg gaggaaggtg gggacgacgt 1140
caagtcatca tgccccttat gtccagggct tcacacatgc tacaatggcc ggtacagagg 1200
gctgcgatac cgcgaggtgg agcgaatccc ttaaagccgg tctcagttcg gatcggggtc 1260
tgcaactcga ccccgtgaag tcggagtcgc tagtaatcgc agatcagcaa cgctgcggtg 1320
aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacgtca tgaaagtcgg taacacccga 1380
agccggtggc ctaacccctc gtgggaggag ccgtcgaagg tggatttgcc gct 1433

Claims (7)

1.赤红球菌(Rhodococcus ruber)FQ-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017565，保藏日期：2017年9月30日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
2.一种权利要求1所述赤红球菌FQ-2在降解有机污染物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述有机污染物包括丙酮、正己烷、二硫化碳、氯苯、乙酸丁酯、乙酸乙酯或α-蒎烯。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用方法为：将赤红球菌FQ-2接种至含有机污染物的无机盐培养基中，在30℃、160r/min条件下进行降解反应，实现对有机污染物的降解；所述无机盐培养基组成为：KH2PO4 0.234g·L-1、K2HPO4·3H2O 0.942g·L-1、MgCl20.2033g·L-1、NH4Cl 0.98g·L-1、CaCl2 0.0111g·L-1、NaNO3 1.7g·L-1、FeCl3 0.0162g·L-1，微量元素母液5mL·L-1，溶剂为去离子水，pH 7.0；其中微量元素母液组成：CuSO4·5H2O0.02g·L-1、FeSO4·7H2O1.0g·L-1、MnSO4·4H2O 0.10g·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.02g·L-1、CoCl2·6H2O 0.02g·L-1、H3BO3 0.014g·L-1、ZnSO4·7H2O 0.10g·L-1，溶剂为去离子水。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述有机污染物的初始加入浓度为50-200mg/L，所述赤红球菌FQ-2接种量以OD600计为0.05～0.20。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述有机污染物为丙酮、正己烷、氯苯或乙酸乙酯。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述赤红球菌FQ-2接种前先进行活化培养，然后将活化培养后的菌液离心，收集赤红球菌FQ-2细胞接种至无机盐培养基中，所述的活化培养是将赤红球菌FQ-2接种至LB液体培养基，在30℃、160r/min恒温振荡培养至OD600为0.50～0.80，获得活化的赤红球菌FQ-2菌液；所述LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH值＝7。
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