CN113046267A

CN113046267A - 一种赤红球菌及其应用

Info

Publication number: CN113046267A
Application number: CN202110303122.8A
Authority: CN
Inventors: 王继华; 胥梦
Original assignee: Harbin Normal University
Current assignee: Agricultural Science Center Of Northeast Institute Of Geography And Agricultural Ecology Of Chinese Academy Of Sciences; Harbin Normal University
Priority date: 2021-03-22
Filing date: 2021-03-22
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2041-03-22
Also published as: CN113046267B

Abstract

一种赤红球菌及其应用，涉及环境污染生态修复技术领域。本发明的目的是要解决目前现有的微生物针对环境中多溴联苯醚尤其是BDE‑47存在降解效率低的问题。一种赤红球菌，它为赤红球菌(Rhodococcus ruber)WX‑1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年12月28日，保藏号为CCTCC NO:M2020979。所述赤红球菌用于降解多溴联苯醚。本发明可获得一种赤红球菌及其应用。

Description

一种赤红球菌及其应用

技术领域

本发明涉及环境污染生态修复技术领域，具体涉及一种赤红球菌及其应用。

背景技术

多溴联苯醚(PBDEs)作为一类重要的添加型溴代阻燃剂，因其优良的热稳定性和阻燃性能及价格低廉等特点，广泛应用于电子电器、石油化工和建材纺织等工业品中。目前商业生产使用的阻燃剂以四溴联苯醚、八溴联苯醚和十溴联苯醚为主，由于2’,4,4’-四溴联苯醚的毒性最高，且2,2’,4,4’-四溴联苯醚在土壤中的含量仅次于十溴联苯醚(BDE-209)，是许多高溴代联苯醚的次级代谢产物，因而受到越来越多研究者的关注。

随着阻燃剂的大量使用，PBDEs极易经挥发扩散、干湿沉降和水体沉积等多种途径进入土壤、大气和水体环境中。PBDEs在不同环境介质和生物体组织中均有广泛检出，且通过迁移转化与生物链传递作用威胁生态系统安全与人体健康。大量研究证实，PBDEs由于具有神经毒性，对内分泌系统有干扰作用，生殖发育毒性、免疫毒性和致癌毒性，对人体健康和生态环境造成很大的威胁。因此，必须不断深入对降解技术的研究。

对于PBDEs的降解，我国目前主要采用的方法有光降解法和生物法(包括微生物降解、零价铁还原和电催化还原)，在诸多降解技术研究过程中，生物降解被认为是当前对于多溴联苯降解最具有前景的手段之一，是污染修复和降低暴露风险的有效技术手段。微生物降解作为环境中有机污染物的重要降解途径，由于其成本低廉且降解效果明显，以及不会对环境造成二次污染，而受到人们广泛的关注。

PBDEs好氧微生物降解比厌氧微生物降解更高效快速且降解更彻底。然而目前所获得的微生物中，能够降解2,2’,4,4’-四溴联苯醚的好氧微生物并不多且降解效果不显著。因此，寻找针对2,2’,4,4’-四溴联苯醚(BDE-47)的高效降解菌株，是对多溴联苯醚污染进行环境治理和污染修复研究的热点问题。

发明内容

本发明的目的是要解决目前现有的微生物针对环境中多溴联苯醚尤其是BDE-47存在降解效率低的问题，而提供一种赤红球菌及其应用。

一种赤红球菌，它为赤红球菌(Rhodococcus ruber)WX-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年12月28日，保藏号为CCTCCNO:M 2020979。

一种赤红球菌的应用，所述赤红球菌用于降解多溴联苯醚。

本发明的有益效果：

本发明采集浙江省台州市某电子垃圾拆解场地的BDE-47污染土壤为样品，采用污染物浓度梯度驯化法和最大污染物浓度法来驯化土壤微生物，然后进一步采用梯度稀释涂布法、四区和一区划线对土壤微生物进行分离和纯化，再对目标菌株进行形态观察、生理生化鉴定及16S rDNA鉴定，确定该赤红球菌WX-1属于红球菌属。最后测定赤红球菌WX-1对BDE-47污染土壤样品的降解能力，降解率测试结果表明：该赤红球菌WX-1对BDE-47的降解率高达62.4％，而恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和侧孢芽孢杆菌(Bacilluslaterospora)对BDE-47的降解率分别为49.96％和47.5％，表明赤红球菌WX-1对BDE-47具有极强的降解能力。

本发明可获得一种赤红球菌及其应用。

附图说明

图1为菌株WX-1的系统发育树。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式一种赤红球菌，它为赤红球菌(Rhodococcus ruber)WX-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年12月28日，保藏号为CCTCC NO:M 2020979。

具体实施方式二：本实施方式一种赤红球菌的应用，所述赤红球菌用于降解多溴联苯醚。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同点是：所述赤红球菌用于降解水体和土壤中的多溴联苯醚，所述多溴联苯醚为2,2’,4,4’-四溴联苯醚。

其他步骤与具体实施方式二相同。

本实施方式的有益效果：

本实施方式采集浙江省台州市某电子垃圾拆解场地的BDE-47污染土壤为样品，采用污染物浓度梯度驯化法和最大污染物浓度法来驯化土壤微生物，然后进一步采用梯度稀释涂布法、四区和一区划线对土壤微生物进行分离和纯化，再对目标菌株进行形态观察、生理生化鉴定及16S rDNA鉴定，确定该赤红球菌WX-1属于红球菌属。最后测定赤红球菌WX-1对BDE-47污染土壤样品的降解能力，降解率测试结果表明：该赤红球菌WX-1对BDE-47的降解率高达62.4％，而恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和侧孢芽孢杆菌(Bacilluslaterospora)对BDE-47的降解率分别为49.96％和47.5％，表明赤红球菌WX-1对BDE-47具有极强的降解能力。

采用以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1：一种赤红球菌；

1.样品来源：选取台州市路桥区峰江街道为采样点。台州市是国内电子产品拆解最为密集的乡镇之一，是我国最大的垃圾回收再利用之地，也是世界上进口废旧电器最多的地区之一。电子垃圾中含有的BDE-47等大量有害物质已危害到周边各环境介质，是重要的污染源，严重危害人体健康及生命安全。采集自某电子垃圾拆解场地(0～20cm)土壤，去除样品中杂质，置于无菌袋中，灭菌采样袋收集并用样品冷藏箱迅速带回实验室。

2.主要实验试剂及培养基成分：

主要实验试剂包括：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、酵母膏、BOD浓缩液和BDE-47等，以上药品均购置于哈尔滨鑫禹奥科技开发有限公司。

驯化培养基(g/L)：用正己烷配置20mg/L的BDE-47储备液，取一定量BDE-47储备液，置于灭菌的锥形瓶中，待正己烷挥发完全后加入灭菌的无机盐液体培养基。

无机盐液体/固体培养基(g/L)：Na₂HPO₄·2H₂O，3.5g；K₂HPO₄，1g；(NH4)₂SO₄，0.5g；MgCl₂·6H₂O，0.1g；Ca(NO₃)₂·4H₂O，0.05g。固体培养基在液体培养基的基础上加入15～20g琼脂，培养基倒入锥形瓶中，在121℃高温蒸汽下灭菌30min，备用。

牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂15～20g和蒸馏水1000mL，pH为7.0～7.2，在121℃下灭菌20min。

LB富集培养基配方(液体)：蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g和蒸馏水1000mL，pH为7.0，在121℃下灭菌20min。

LB富集培养基配方(固体)：蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g、琼脂15～20g和蒸馏水1000mL，pH为7.0，在121℃下灭菌20min。

3.主要实验仪器：

电子天平、烧杯、玻璃棒、锥形瓶、三角烧瓶、电炉、XFH-40CA型电热式压力蒸汽灭菌器、试管、接种环、酒精灯、CJ-2D型超净工作台、DH6000BⅡ型恒温培养箱、NHY振荡培养箱，离心机、离心管和移液枪。

4.实验方法：

4.1污染物浓度梯度驯化法：

细菌驯化体系中BDE-47的浓度按100μg/L、200μg/L、500μg/L和1000μg/L依次增加，7天为一个周期驯化，驯化共四个周期。

4.2最大污染物浓度驯化法：

细菌驯化体系BDE-47浓度为500μg/L，每7天一个周期进行驯化，驯化共四个周期，得到可以在BDE-47为唯一碳源的生长环境中存活或生长的菌群。

4.3固体无机盐培养基上菌株的驯化：

用平板划线法将得到的降解菌株转接至BDE-47浓度为100μg/L的固体培养基上进行培养。3天后，将长出的单菌落转接于BDE-47浓度为200μg/L的灭菌固体培养基上，每培养3天便将长出的单菌落接种至新鲜、灭菌的固体培养基中，直到BDE-47浓度增加至500μg/L，则完成降解菌在无机盐固体培养基中的进一步驯化过程。直至最后一次驯化完成，挑取平板中长出的菌落在牛肉膏蛋白胨培养基上进行多次划线，直到平板中出现单一菌落，即得到纯种BDE-47降解菌株。

4.4梯度稀释涂布法：

吸取最后一个周期降解菌株筛选培养基中菌液1mL，按10倍稀释法将所取菌液稀释为10^-1～10^-6梯度的液体，取100μL液体涂布于酵母膏固体培养基上，用灭菌涂布棒涂抹均匀，放于37℃的恒温培养箱中进行培养。

4.5细菌的分离与纯化：

将已培养完毕梯度稀释涂布的平板在超净工作台中完成细菌的分离及纯化工作。长出单菌落之后，根据各菌落形态特征进行筛选，根据观察到的菌株的形态、直径大小、颜色和粘稠度等，将不同类型的菌株进行分离，利用已灭菌的接种环蘸取菌株体在牛肉膏蛋白胨平板培养基上进行四区划线，四区平板在恒温培养箱中培养24小时后将四区长出的单菌落挑出在牛肉膏蛋白胨平板培养基上进行一区划线。待一区划线平板长出菌株后在显微镜下观察菌株是否为单一类型的纯菌株，若不是则反复划线纯化直至筛选单一菌落得到纯菌。

4.6菌株降解能力测定：

将250μL、20mg/L的BDE-47正己烷储备液添加至锥形瓶中，无菌条件下待正己烷挥发后，添加无机盐液体培养基50mL，BDE-47充分溶解后，使反应体系中BDE-47的最终浓度为500μg/L，PH值为7.0；将待测菌无菌条件下接种于装有无机盐的锥形瓶中，充分混匀；将降解反应体系置于恒温振荡培养箱中35℃、150r/min培养7d，测定体系中BDE-47含量，计算菌株的降解率，筛选出BDE-47降解率最高的菌株为目标菌株，命名为WX-1。

4.7菌株鉴定：

4.7.1菌株形态鉴定：

将菌株WX-1在LB平板上培养两天，对其进行形态观察和革兰氏染色，结果如表1所示。

表1

颜色

直径

质地

形状

边缘

表面

革兰氏染色

粉色

0.5cm

粘稠

圆形

整齐

平整

阳性

4.7.2菌株生理生化鉴定：

对菌株WX-1进行生理生化鉴定，结果如表2所示。

表2

VP测定	氧化酶	接触酶	淀粉酶	甲基红
					-	-	+	-	+

生理生化鉴定结果：伏普试验反应阴性，氧化酶反应阴性，接触酶反应阳性，淀粉水解阴性，甲基红反应阳性。

4.7.3菌株16S rDNA鉴定：

采用菌落PCR方法，直接取单菌落裂解液为模板进行PCR。利用PCR扩增16S rDNA的通用引物。27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3。PCR反应条件为：95℃、5min，95℃、30s，58℃、30s，72℃、1min30s，35个循环，72℃、7min；引物及测序工作皆由深圳微生太科技有限公司完成。16S rDNA序列如下：

TGCAGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCTCGGGATGCATGTTCCGGGGTGGAAAGGTTTTCCGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTACCGACGAAGCGCAAGTGACGGTAGGTACAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTCTGTGAAAACCCGCAGCTCAACTGCGGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATACACCGGACCGCCCCAGAGATGGGGTTTCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGGACTCGCAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTCGTGGGAGGGAGCC。

测序结果与通过MEGA7.0软件Alignment中的CLUSTAL W对目的序列和参考序列进行比对，参数为默认值。构建的系统发育树如图1所示。

结果显示，本发明所提供的菌株WX-1与赤红球菌的同源性达99.93％，再结合对菌株WX-1进行形态观察和生理生化鉴定的结果，确定该赤红球菌WX-1属于红球菌属，命名为WX-1。

经降解率测试，该赤红球菌WX-1对BDE-47的降解率高达62.4％，而恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterospora)对BDE-47的降解率分别为49.96％和47.5％，表明赤红球菌WX-1对BDE-47具有极强的降解能力。降解率数据如表3所示：

表3

PBDEs	微生物	降解率
			500μg/L BDE-47	赤红球菌(Rhodococcus ruber)WX-1	7d，62.4％
50μg/L BDE-47	恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)	7d，49.96％
			100μg/L BDE-47	侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterospora)	8d，47.5％

序列表

<110> 哈尔滨师范大学

<120>一种赤红球菌及其应用

<160> 1

<210> 1

<211> 1388

<212> DNA

<213>赤红球菌(Rhodococcus ruber）。

tgcagtcgaa cgatgaagcc cagcttgctg ggtggattag tggcgaacgg gtgagtaaca 60

cgtgggtgat ctgccctgca cttcgggata agcctgggaa actgggtcta ataccggata 120

ggacctcggg atgcatgttc cggggtggaa aggttttccg gtgcaggatg ggcccgcggc 180

ctatcagctt gttggtgggg taacggccca ccaaggcgac gacgggtagc cggcctgaga 240

gggcgaccgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg 300

ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg atgacggcct 360

tcgggttgta aacctctttc agtaccgacg aagcgcaagt gacggtaggt acagaagaag 420

caccggccaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggtgcgagcg ttgtccggaa 480

ttactgggcg taaagagctc gtaggcggtt tgtcgcgtcg tctgtgaaaa cccgcagctc 540

aactgcgggc ttgcaggcga tacgggcaga cttgagtact gcaggggaga ctggaattcc 600

tggtgtagcg gtgaaatgcg cagatatcag gaggaacacc ggtggcgaag gcgggtctct 660

gggcagtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtgggtagcg aacaggatta gataccctgg 720

tagtccacgc cgtaaacggt gggcgctagg tgtgggtttc cttccacggg atccgtgccg 780

tagctaacgc attaagcgcc ccgcctgggg agtacggccg caaggctaaa actcaaagga 840

attgacgggg gcccgcacaa gcggcggagc atgtggatta attcgatgca acgcgaagaa 900

ccttacctgg gtttgacata caccggaccg ccccagagat ggggtttccc ttgtggtcgg 960

tgtacaggtg gtgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 1020

aacgagcgca acccttgtcc tgtgttgcca gcacgtaatg gtggggactc gcaggagact 1080

gccggggtca actcggagga aggtggggac gacgtcaagt catcatgccc cttatgtcca 1140

gggcttcaca catgctacaa tggccggtac agagggctgc gataccgcga ggtggagcga 1200

atcccttaaa gccggtctca gttcggatcg gggtctgcaa ctcgaccccg tgaagtcgga 1260

gtcgctagta atcgcagatc agcaacgctg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca 1320

ccgcccgtca cgtcatgaaa gtcggtaaca cccgaagccg gtggcctaac ccctcgtggg 1380

agggagcc 1388

Claims

1.一种赤红球菌，其特征在于它为赤红球菌(Rhodococcus ruber)WX-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年12月28日，保藏号为CCTCC NO:M 2020979。

2.如权利要求1所述的一种赤红球菌的应用，其特征在于所述赤红球菌用于降解多溴联苯醚。

3.根据权利要求2所述的一种赤红球菌的应用，其特征在于所述赤红球菌用于降解水体和土壤中的多溴联苯醚，所述多溴联苯醚为2,2’,4,4’-四溴联苯醚。