CN107893047A

CN107893047A - 一株石油芳香烃降解菌及其应用

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Publication number: CN107893047A
Application number: CN201810004789.6A
Authority: CN
Inventors: 马立安; 詹亚斌; 余维初; 陶兴玲; 何山文; 宋淑芬; 幸晶晶
Original assignee: Yangtze University
Current assignee: Yangtze University
Priority date: 2018-01-03
Filing date: 2018-01-03
Publication date: 2018-04-10
Anticipated expiration: 2038-01-03
Also published as: CN107893047B

Abstract

本发明公布了一种石油芳香烃降解菌G‑40，其分类学命名为侧孢芽孢杆菌Brevibacillus laterosporus.G‑40，属芽孢杆菌属Brevibacillus，已于2017年6月30日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2017400，该菌株从潜江广华油田采油区石油污染土壤中筛选得到，该菌株G‑40呈椭球形，革兰氏染色结果为阳性，本发明的石油芳香烃降解菌株G‑40在温度为35℃、pH值为7.3、油浓度为0.6%、盐浓度为0.5%、接种量为10%、N源(NH₄)₂SO₄、P源Na₂HPO₄的条件下培养30天后对石油芳香烃的降解率达到53.02%，且菌株G‑40具有广泛的温度、pH值和盐度适应能力，在消除石油污染物，生物修复石油芳香烃污染土壤和污染水体方面具有较好的应用前景和经济价值。

Description

一株石油芳香烃降解菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株石油芳香烃降解菌及其应用，属微生物降解石油污染物技术领域。

背景技术

在原油的开采、运输、储存、炼制和使用过程中，大量原油及其衍生产品不可避免地进入环境中，对土壤和水体造成严重污染。原油的化学组成复杂，包括烷烃、环烷烃、芳香烃等多种有毒物质，其中一些芳香烃化合物具有潜在或被证实的致癌变、致突变和致畸变的作用，并能通过食物链在动植物及人体内富集，对生态环境和人类健康造成巨大威胁。

微生物降解已被证实是一种非常有效的石油污染清除技术，其具有经济高效、环境友好、不产生二次污染等优点，其技术的关键是筛选出高效降解目标污染物的微生物，现有的降解微生物由于对生长环境和降解环境耐受性差导致对原油的降解能力存在较大差异，因此，有必要筛选出具有对生长环境要求低、生长速度快、降解速度快的原油芳香烃降解菌，研究其降解特性，为原油污染环境的芳香烃化合物的生物降解提供菌株和基因材料。

发明内容

本发明的目的在于：提供一株能够高效降解石油芳香烃的菌株，使其应用于石油污染土壤或石油污染水体的生物修复，该菌株在35℃、pH7.3、油浓度0.6%、盐浓度0.5%、接种量10%、N源(NH₄)₂SO₄、P源Na₂HPO₄的条件下培养30天后对石油芳香烃的降解率达到53.02%。

本发明的技术方案是：

一株石油芳香烃降解菌，其分类学命名为侧孢芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus. ）G-40，已于2017年6月30日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2017400。

所述的侧孢芽孢杆菌G-40菌落特征和生理生化特征为：椭球形，直径为2.01mm，革兰氏染色为阳性，菌落呈米黄色，边缘整齐，中部凸起，表面光滑；明胶液化试验、吲哚试验、过氧化氢酶试验、甲基红试验、产氨试验和产硫化氢试验阳性，柠檬酸盐试验、V-P试验、淀粉水解试验、油脂水解试验、硝酸盐还原试验和苯丙氨酸脱氢酶试验阴性。

所述的侧孢芽孢杆菌G-40通过16S rRNA基因序列比对结果分析，与芽孢杆菌属（Brevibacillus）的16S rRNA基因序列的同源性最高，相似性为99%。

所述的侧孢芽孢杆菌G-40在降解石油芳香烃污染的土壤或石油芳香烃污染的水体中的应用。

所述的侧孢芽孢杆菌G-40对石油芳香烃的最适宜降解条件为：温度为35℃、pH值为7.3、油浓度为0.6%、盐浓度为0.5%、接种量为10%、N源(NH₄)₂SO₄、P源Na₂HPO₄。

所述的侧孢芽孢杆菌G-40对石油芳香烃的降解率达53.02%。

所述的侧孢芽孢杆菌G-40能以石油作为唯一碳源的无机盐培养基上进行生长，侧孢芽孢杆菌G-40的最适宜生长条件为：温度为25-45℃，pH为6.0-9.0，盐浓度为0.2%-1.0%。

本发明的有益效果在于：

本发明所提供的菌株对石油芳香烃污染物具有高效快速地降解能力，该菌株能够以石油作为唯一碳源，对石油芳香烃的降解率达到53.02%，具有广泛的温度、pH值和盐度适应能力，在消除石油污染物方面具有较好的应用前景和经济价值。

附图说明

图1为本发明侧孢芽孢杆菌G-40的菌落形态和菌体照片；

图2为本发明侧孢芽孢杆菌G-40的系统发育树图；

图3为本发明侧孢芽孢杆菌G-40以石油为唯一碳源条件下的生长曲线图；

图4为本发明侧孢芽孢杆菌G-40不同温度条件下的芳香烃降解曲线图；

图5为本发明侧孢芽孢杆菌G-40不同pH条件下的芳香烃降解曲线图；

图6为本发明侧孢芽孢杆菌G-40不同油浓度条件下的芳香烃降解曲线图；

图7为本发明侧孢芽孢杆菌G-40不同盐浓度条件下的芳香烃降解曲线图；

图8为本发明侧孢芽孢杆菌G-40不同接种量条件下的芳香烃降解曲线图；

图9为本发明侧孢芽孢杆菌G-40不同N源条件下的芳香烃降解曲线图；

图10为本发明侧孢芽孢杆菌G-40不同P源条件下的芳香烃降解曲线图。

具体实施方式

本发明通过以下方法来筛选、确认菌株种类，同时提供该菌株各项优异性能，具体内容如下：

1 材料与方法

1.1 石油污染土壤样品采集

石油污染土壤样品来源于潜江广华油田采油区石油污染土壤，经

测定污染土壤的含水率为35%，pH值为8.0。

1.2 培养基

1.2.1 无机盐培养基

NaNO₃ 1.5 g、(NH₄)₂SO₄ 1.5 g、K₂HPO₄ 1.0 g、MgSO₄·7H₂O 0.5 g、KCl 0.5 g、NaCl5.0 g、FeSO₄·7H₂O 0.01 g、CaCl₂ 0.02 g、蒸馏水1000 mL、pH7.0、石油0.5%，每支三角瓶装100 mL。

1.2.2 细菌选择性培养基

牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂20 g，无菌制霉菌素50mg、自来水1000mL、pH7.0。

1.2.3 牛肉膏蛋白胨固体培养基

牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、琼脂20 g、自来水1000 mL、pH7.0。

1.2.4牛肉膏蛋白胨液体培养基

1.3 降解菌的分离和形态观察

降解菌的分离操作步骤如下：

（1）称取5 g新鲜的石油污染土壤样品，加入至100 mL的无机

盐液体培养基中，置于恒温摇床中35℃、150 r/min震荡培养5 d，然后将菌液转接到新鲜的无机盐培养基中，菌液：新鲜的无机盐培养基的体积比为1:20，重新置于恒温摇床中35℃、150 r/min震荡连续培养3代（15 d），获得混合菌群液。

（2）将上述制得的混合菌群液100μL均匀涂布于细菌选择性培养平板上，置于培养箱中37℃恒温培养24 h。

（3）挑取生长速度快的单独菌落，接种于细菌选择性培养基上进行平板划线纯化，直至平板上所有菌落形态一致，即为单一菌株。纯化后的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面固体培养基中，采用20%灭菌甘油冻管法保存于-80℃的冰箱中，以上实验均在无菌操作环境下进行。

1.4 菌株的形态学和分子生物学鉴定

1.4.1 使用正置显微镜（OLYMPUS）对分离菌株进行形态学观察。

在观察前，先进行革兰氏染色：（1）涂片：取干净的载玻片一块，在载玻片上滴一滴水，按照无菌操作法取菌涂片，将G-40做成浓菌悬液。再取干净的载玻片一块，滴一滴水，将浓菌液取1～2环涂上去制成薄涂面；（2）晾干：让薄涂片自然晾干；（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2～3次固定；（3）结晶紫染色：将固定过的涂片放在废弃缸上的搁架上。加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1min；（4）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗；（5）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min；（6）脱色：将玻片倾斜，连续点滴95%乙醇通过涂面脱色20～25s至流出液无色，立即水洗；（7）复染：滴加番红复染3～5min；（8）水洗：用水洗去涂片上的番红染色液；（9）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干；（10）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察。

1.4.2 菌株的分子生物学鉴定

（1）DNA的提取

将上述分离纯化后的菌株接种于LB液体培养基中，在恒温振荡

培养箱中35℃、150 r/min振荡培养24h，按照上海生工生物公司的细菌基因组DNA快速抽提试剂盒的离心法步骤对筛选出的菌株G-40进行总DNA的提取，然后将提取出的DNA置于-20℃温度下保存并尽快进行PCR扩增。

（2）PCR扩增

模板是提取的该菌株G-40的总DNA，然后利用细菌16Sr RNA

基因的通用引物进行PCR扩增，扩增引物为：

27F：5’-A GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

1492R：5’-GGTTACCT TG T TACG ACTT-3’

PCR 反应体系为 Mix 25 μL，模板3μL，27F（10 μM）0.5 μL，1492R（10 μM）0.5 μL，10×TaqBuffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mM）2 μL，ExTaq （5 U/μL）0.25 μL，dd H2O 16.25μL共25 μL。

PCR扩增反应程序见表1：

表1 PCR扩增反应程序

（3）PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测

操作步骤如下：

1）、配制琼脂糖凝胶：称取0.25g琼脂糖加入25mL TAE(1×),加热，放在微波炉上煮沸。

2）、倒胶：将煮沸的琼脂糖液体放置40℃时，加入2μL GeneGreen核酸染料，摇匀后，倒入制胶板中。

3）、点样：将5μL DNA模板与1μL 6× Loading Buffer 混匀后点入胶孔中。

（4）PCR产物测序

委托生工生物（武汉）股份有限公司对菌株G-40PCR产物进行测序工作，菌株G-40的PCR产物测序结果见侧孢芽孢杆菌G-40的序列表，然后通过NCBI网站提供给的Basic LocalAlignment Search Tool( BLAST )功能与Genbank中的DNA基因序列进行比对，分析该菌株的16S rRNA基因序列测序结果。下载相似度≥98％的基因序列，利用BioEdit与MEGA5.0两种软件确定菌株的属。

1.5菌株G-40的最适降解条件

将活化后的菌株G-40接种于装有50mL 含石油液体培养基的150mL 三角瓶中，采用单因素实验，在其它条件因素相同的情况下，分别改变温度、盐度、pH 值和油浓度进行摇瓶培养，培养30 d，每组实验做三个平行，空白组不接种降解菌。采用紫外分光光度法测定培养基中石油芳香烃含量，计算降解率η（%）：

η：石油芳香烃降解率，%； C₀：空白组石油芳香烃含量 mg/L；C_S：接菌组石油芳香烃含量，mg/L。

温度、pH、油浓度、盐浓度、接种量、N源、和P源值分别设定为以下几个梯度：（1）温度：（25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）；（2）pH：6.0、7.0、7.5、8.0、9.0；（3）油浓度：0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%；（4）盐浓度：（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）；

单因素实验结果如附图4-7所示，当温度为30℃，pH值为7.5，油浓度为0.6%，盐浓度为0.4%时对石油芳香烃的降解率达到最大，最大降解率分别为28.26%、30.19%、31.04%、24.59%。

选取温度、pH、油浓度和盐浓度为主要因素设计成四因素三水平（不同接种量、不同N源和不同P源）的正交试验，如表2所示。正交试验结果表明G-40菌株对石油芳香烃的最佳降解条件为：温度为35℃、pH7.3、油浓度0.6%、盐浓度0.5%、接种量10%、N源(NH₄)₂SO₄、P源Na₂HPO₄。

（5）接种量：（2%、4%、6%、8%、10%）；（6）：N源（(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl、NH₄NO₃、KNO₃）；（7）P源：（K₂HPO₄、KH₂PO₄、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄）。

表2 因素水平表

A：温度； B：pH； C：油浓度； D：盐浓度

表 3 G-40菌株降解石油芳香烃正交试验设计表

K：代表极差即每个因素下对应水平的实验结果的和，例如：K_I在温度这一列中代表30℃实验结果的总和，在pH这一列中代表pH7.3实验结果的总和，在油浓度这一列中代表0.4%实验结果的总和，在盐浓度这一列代表0.3%实验结果的总和，极差越大，该因素所在水平对实验结果影响越大；

R：代表方差即每个因素下K的最大值减最小值，R值越大，则对应列的因素对实验结果影响最大。

将侧孢芽孢杆菌G-40接种入含有5000mg（饱和烃:芳香烃:非烃=4.78:1:1.50）原油的1000mL无机盐培养基中，在30℃、pH7.5、油浓度0.6%、盐浓度0.5%、接种量10%、N源(NH₄)₂SO₄、P源Na₂HPO₄的环境下培养30 d，石油芳香烃含量从860.81 mg降低至404.41mg，对石油芳香烃的降解率达到53.02%，本发明侧孢芽孢杆菌G-40对石油污染的水体或土壤环境具有较强的修复能力。

2结果与讨论

2.1菌株G-40的分离和形态

通过正置显微镜观察到菌株G-40菌株呈椭球形（图1），该菌株

为革兰氏阳性菌。

2.2菌株G-40的16Sr RNA基因鉴定

测序结果显示细菌的16SrRNA 基因序列长度约为1500 bp，将得到的基因序列与GenBank 数据库中的序列进行比对，获得各序列的同源性信息（表4）

表4 菌株的BLAST 比对结果以及GenBank登录号

经鉴定，该菌株G-40属于侧孢芽孢杆菌属（Brevibacillus laterosporus），与菌株Brevibacillus laterosporus DSM 25 AB112720相似性最高，相似度为99%。

2.3 菌株G-40的最适降解条件

通过单因素的初步探究结果表明：当温度为30℃，pH值为7.5，油浓度为0.6%，盐浓度为0.4%时对石油芳香烃的降解率达到最大，最大降解率分别为28.26%、30.19%、31.04%、24.59%。通过进一步的正交试验结果表明：该菌株G-40对石油芳香烃最适宜降解条件如下：温度为35℃、pH值为7.3、油浓度为0.6%、盐浓度为0.5%、接种量为10%、N源(NH₄)₂SO₄、P源Na₂HPO₄，上述条件下培养30 天后，该菌株G-40对石油芳香烃降解率达到53.02%。

序列表

<110> 长江大学

<120> 一株石油芳香烃降解菌及其应用

<141> 2018-01-03

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1440

<212> DNA

<213> 侧孢芽孢杆菌G-40(Brevibacillus laterosporus)

<400> 1

cggggggcgt gctatacatg cagtcgagcg agggtcttcg gaccctagcg gcggacgggt 60

gagtaacacg taggcaacct gcctgtgaga ctgggataac atagggaaac ttatgctaat 120

accggatagg gttttgcttc gcctgaagcg aaacggaaag atggcgcaag ctatcactta 180

cagatgggcc tgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgatg 240

cgtagccgac ctgagagggt gaccggccac actgggactg agacacggcc cagactccta 300

cgggaggcag cagtagggaa ttttccacaa tggacgaaag tctgatggag caacgccgcg 360

tgaacgatga aggctttcgg gtcgtaaagt tctgttgtta gggaagaaac agtgctattt 420

aaataaggta gcaccttgac ggtacctaac gagaaagcca cggctaacta cgtgccagca 480

gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgca 540

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aacacccgaa gtcggtgagg taaccgcaag gagccagccg ccgaagttgg gtttaatttt 1440

Claims

1.一株石油芳香烃降解菌，其分类学命名为侧孢芽孢杆菌Brevibacillus laterosporus.G-40，已于2017年6月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2017400。

2.根据权利要求1所述的一株石油芳香烃降解菌，其特征在于：所述的侧孢芽孢杆菌G-40菌落特征和生理生化特征为：圆形，直径为2.01mm，革兰氏染色为阳性，菌落呈米黄色，边缘整齐，中部凸起，表面光滑；明胶液化试验、吲哚试验、过氧化氢酶试验、甲基红试验、产氨试验和产硫化氢试验阳性，柠檬酸盐试验、V-P试验、淀粉水解试验、油脂水解试验、硝酸盐还原试验和苯丙氨酸脱氢酶试验阴性。

3.根据权利要求1所述的一株石油芳香烃降解菌，其特征在于：所述的侧孢芽孢杆菌G-40通过16S rRNA基因序列比对结果分析，与芽孢杆菌属Brevibacillus的16S rRNA基因序列的同源性最高，相似性为99%。

4.根据权利要求1所述的一株石油芳香烃降解菌，其特征在于：所述的侧孢芽孢杆菌G-40在降解石油芳香烃污染的土壤或石油芳香烃污染的水体中的应用。

5.根据权利要求1所述的一株石油芳香烃降解菌，其特征在于：所述的侧孢芽孢杆菌G-40对石油芳香烃的最适宜降解条件为：温度为35℃、pH值为7.3、油浓度为0.6%、盐浓度为0.5%、接种量为10%、N源(NH₄)₂SO₄、P源Na₂HPO₄。

6.根据权利要求1所述的一株石油芳香烃降解菌，其特征在于：所述的侧孢芽孢杆菌G-40对石油芳香烃的降解率达53.02%。

7.根据权利要求1所述的一株石油芳香烃降解菌，其特征在于：所述的侧孢芽孢杆菌G-40能以石油作为唯一碳源的无机盐培养基上进行生长，侧孢芽孢杆菌G-40的适宜生长条件为：温度为25-45℃，pH为6.0-9.0，盐浓度为0.2%-1.0%。