CN113388545A

CN113388545A - 一株贝莱斯芽胞杆菌及其清洗低浓度石油污染土壤的应用

Info

Publication number: CN113388545A
Application number: CN202110677961.6A
Authority: CN
Inventors: 任立伟; 王朝宣; 郭珅; 龚大春; 吕育财; 郭金玲
Original assignee: China Three Gorges University CTGU
Current assignee: China Three Gorges University CTGU
Priority date: 2021-06-18
Filing date: 2021-06-18
Publication date: 2021-09-14
Anticipated expiration: 2041-06-18
Also published as: CN113388545B

Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽胞杆菌及其清洗低浓度石油污染土壤的应用。所述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensisW1的保藏编号为CCTCC NO：M2020431。本发明公开的该菌株清洗低浓度石油污染土壤的应用，将贝莱斯芽孢杆菌和/或含有该菌活体的菌剂作为微生物清洗剂，辅以少量的水和氮源，用于清洗低浓度石油污染砂质土壤，以修复低浓度石油污染砂质土壤和回收部分石油。本发明的贝莱斯芽孢杆菌具有耐高温、耐盐、耐碱等特点，且能够以石油为碳源和能源生长，并分泌脂肽类生物表面活性剂。该菌的活体作为微生物清洗剂清洗石油污染土壤时，生长繁殖的同时分泌的生物表面活性剂将土壤与石油剥离，剥离后的石油可在由微生物清洗剂和清洗用于水组成的水相表面聚集，便于石油的回收。

Description

一株贝莱斯芽胞杆菌及其清洗低浓度石油污染土壤的应用

技术领域

本发明属于环境生物技术和石油污染土壤修复领域，具体涉及一株贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis strainW）及其作为微生物清洗剂用于修复低浓度石油污染砂质土壤的方法。

背景技术

我国每年落地原油约60万吨，其中约1/10进入土壤。据不完全统计，2015年我国石油污染土壤面积已达500万公顷。美国环保总局提出的8种新型污染土壤修复技术中，土壤清洗被认为更适合高浓度石油污染土壤的修复。土壤清洗技术起源于油田罐底油泥的处理，目前国内外已经实施的土壤清洗项目一般以无机碱或化学表面活性剂为清洗剂，并在加热（60℃~80℃）的条件下进行。由于石油在土壤或油泥中存在状态和结合力的差异，经多次化学或热碱清洗后土壤一般仍含2%以上的石油，即现有的石油污染土壤清洗技术很难将土壤的含油量降低至2%以下。我国的《土壤环境质量建设用地土壤污染风险管控标准》（GB36600-2018）规定当一类建设用地和二类建设用地的土壤石油烃（C₁₀-C₄₀）含量分别大于0.5%和0.9%时，对人体健康通常存在不可接受的风险，应采取风险管控或修复措施。

我国的几大石油产区，如塔里木油田、青海油田，以及世界的石油主产区，如海湾地区，均分布于沙漠或戈壁地区。由于此前环保意识的淡泊，各大油田几乎均存在不同数量、不同程度的石油污染砂质土壤。沙漠和戈壁地区存在运输困难、水资源匮乏（主要是缺少淡水）、砂质土壤盐碱含量较高等问题。低浓度石油污染砂质土壤和经化学或热碱法清洗后的砂质土壤（一般含2%-5%的石油烃，以下统称为低浓度石油污染砂质土壤）一般采用生物堆的方式处理，即将低浓度石油污染砂质土壤与微生物菌剂以及其它必要的营养成份混合、堆成堆体，保持一定的温度、湿度，并在间歇或连续性的曝气条件下进行，通过微生物对石油的降解作用，从而使低浓度石油污染砂质土壤的石油烃含量降低至0.9%以下，但生物堆修复技术存在工程量大（堆体的构建，并需要建设保温、保湿、曝气等辅助设施）、周期长（一般>30天）、能耗高（需长时间的曝气和保温、保湿）、石油不能回收（被微生物分解利用）等不足。因此，创建一种针对低浓度石油污染土壤，尤其是适用于沙漠和戈壁等石油主产区的修复方法，使修复后土壤的石油烃含量能够降低至0.9%以下，达到国标GB36600-2018的要求，并实现石油回收具有十分广阔的应用前景。

如前所述，微生物可以降解石油，其中部分微生物除以石油为碳源和能源生长外，还能够分泌生物表面活性剂。如果以此类微生物代替传统土壤清洗技术中的无机碱或化学表面活性剂作为微生物清洗剂，即在土壤清洗过程中加入活体微生物，利用微生物生长繁殖的同时不断产生的生物表面活性剂作为清洗剂清洗低浓度石油污染砂质土壤，不仅可以进一步降低土壤清洗的成本（主要是清洗剂的成本），更有望打破传统土壤清洗技术的石油在污染土壤与清洗液（由水和清洗剂组成）之间的溶解平衡，使清洗后的土壤石油烃含量降低至0.9%以下。为了回收石油，需要使被微生物清洗出的石油能够由土壤进入清洗液水相，并在清洗液水相的表面聚集和与水相分层，清洗过程应该在高温条件下进行（防止被清洗出的石油遇冷再次与细小的土壤结合形成含油量更高的油泥小球），这就要求所选用的微生物应具有一定的耐热性。为了使该方法能够适用于沙漠或戈壁地区的盐碱性土壤和利用非淡水进行清洗，这就要求所选用的微生物具有一定的耐盐、耐碱能力。专利CN104593298A公开了一株嗜热耐盐降解原油产乳化剂的不产气芽孢菌株及其在油井提高采油率中的应用，该菌可在65℃条件下生长且产生物表面活性剂，但该菌最适盐的质量分数仅为3.0%，且不具有耐碱性。专利CN105441351A公开了一株嗜热产表面活性剂降解石油的地衣芽孢杆菌，该菌的耐盐度可达到70000 mg/L，但产生的生物表面活性剂产品仅在55℃温度下有效的乳化柴油。

综上所述，目前已分离得到的具有耐高温、耐盐、降解石油、产生物表面活性剂功能的一些微生物主要用于提高油井的采油率或将微生物分泌的生物表面活性剂从发酵液中提取出来单独作为油品的乳化剂，鲜有利用微生物活体直接作为清洗剂用于石油污染土壤修复的案例，更缺少针对沙漠或戈壁等特定环境下的、实际清洗难度更大的低浓度石油污染土壤修复技术。针对上述不足，寻找适宜的微生物，并建立相应的低浓度石油污染砂质土壤的清洗方法，仍是当前石油污染土壤修复领域的一项重要工作。

发明内容

为了克服石油污染土壤修复技术中存在的上述不足，特别是创建一种成本低、周期短、针对石油主产区沙漠或戈壁环境下和清洗难度更大的低浓度石油污染土壤的修复技术，本发明提供了一株贝莱斯芽胞杆菌及其作为微生物清洗剂用于修复低浓度石油污染砂质土壤的方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensisstrainW），该菌是从青海油田尕斯三号作业区附近石油污染的砂质土壤中经大量筛选实验分离得到的。该菌能够在含盐量≤12wt%、pH 7.5~9.5、以石油为唯一碳源和能源、60℃的环境下快速生长繁殖，并分泌脂肽类生物表面活性剂。该菌已于2020年9月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020431，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

本发明还提供了一种含有上述贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis strainW）活菌体的菌剂及其作为微生物清洗剂的应用。由于本发明将上述贝莱斯芽孢杆菌的活菌体作为清洗剂，因此对菌剂的形式没有特别的限制，只要能够从上述贝莱斯芽孢杆菌的发酵液中富集菌体即可，例如通过离心富集得到的菌膏，或再将菌膏通过喷雾干燥制备成干粉菌剂，甚至直接使用上述贝莱斯芽孢杆菌的发酵液，只要控制应用时加入的活菌体的数量，均可满足本发明将上述贝莱斯芽孢杆菌活菌体作为清洗剂的要求，而所述的离心、喷雾干燥等条件可以为公知的条件，具体如下：

一种液体菌剂，为所述的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis strainW经发酵培养后得到的液体菌剂。或者为将所述得到的液体菌剂经加入体积分数为30-40%的甘油形成的另一种液体菌剂。

一种固体菌剂，为将所述得到的液体菌剂经离心后富集得到的菌膏。或者为将所述得到的菌膏与麦芽糊精：水按质量比1:1-2:1.2-3混合调浆，经喷雾干燥得到的干粉。

本发明的又一技术方案是将所述的贝莱斯芽孢杆菌、液体菌剂、固体菌剂作为微生物清洗剂上的应用。

所述的微生物清洗剂在清洗石油烃类污染物上的应用，所述的石油烃类污染物为砂质土壤中的石油烃类污染物。

本发明还提供了一种修复低浓度石油污染砂质土壤的方法，所述方法包括：将上述贝莱斯芽孢杆菌和/或上述菌剂作为清洗剂，用于低浓度石油污染砂质土壤样品的清洗，可将土壤样品中的石油烃含量降低至0.9%以下，且清洗后不残留其它有害成份，同时实现低浓度石油污染砂质土壤的修复和回收部分石油。

本发明的贝莱斯芽孢杆菌能够以污染物石油为碳源和能源生长，并且对氮、磷等其它元素需求亦较低，以本发明的贝莱斯芽孢杆菌和/或上述菌剂作为清洗剂，除必要的清洗用水（水土质量比1.5:1~4.5:1）外，仅需要提供少量的无机和/或有机氮源（污染物石油中的总碳与添加的氮源中的总氮的摩尔比为5:1~15:1）。贝莱斯芽孢杆菌的活菌体作为清洗剂，清洗过程中菌体不断生长繁殖，同时菌体分泌的表面活性剂将土壤与石油剥离，从而降低土壤的石油烃含量。本发明的贝莱斯芽孢杆菌能够耐受较高的温度（60℃），高温清洗可使剥离后的石油可在清洗液（由水和清洗剂组成）的表面聚集，便于石油的回收。本发明的贝莱斯芽孢杆菌还具有一定的耐盐、耐碱的能力，使该方法能够适用于沙漠或戈壁地区的盐碱性土壤和利用非淡水进行清洗。例如，石油烃含量为2%~5%的砂质土壤样品，采用本发明的清洗方法进行修复，60℃、pH 7.5~9.5、150~250 rpm搅拌4~12 h，土壤样品的石油烃含量可降至0.3%~0.8%，石油回收率约为50%~70%。

本发明的修复低浓度石油污染砂质土壤的方法包括：将保藏编号为CCTCC NO：M2020431的贝莱斯芽孢杆菌和/或含有该菌活体的菌剂作为清洗剂，用于低浓度石油污染砂质土壤的清洗，以修复石油污染砂质土壤和回收部分石油。本发明的贝莱斯芽孢杆菌具有耐高温、耐盐、耐碱等特点，且能够以石油为碳源和能源生长，并分泌脂肽类生物表面活性剂。该菌的活体作为清洗剂清洗石油污染土壤时，能够以污染物石油为碳源和能源生长（对氮、磷等其它元素需求亦较低），同时不断分泌的生物表面活性剂将土壤与石油剥离，剥离后的石油可在清洗的水相表面聚集，便于石油的回收。可适用于缺少淡水的沙漠或戈壁地区，修复清洗难度更大的低浓度石油污染砂质土壤。

附图说明

图1 实施例1菌株W1以石油-无机盐固体培养基培养24 h后的生长状况和形成的透明圈。

图2 实施例1菌株W1在含1wt%~15wt%的NaCl的LB液体培养基中培养24 h后的菌浓度。

图3 实施例1菌株W1在pH 5.5~10.5的LB液体培养基中培养24 h后的菌浓度。

图4 实施例1菌株W1和相近菌株的16S rRNA序列构建的系统发育树。

图5 实施例2菌株W1分泌的表面活性剂初提物的红外图谱（FT-IR）。

图6 实施例2菌株W1分泌的表面活性剂初提物的核磁共振图谱（H-NMR）。

图7 实施例2菌株W1分泌的表面活性剂初提物的核磁共振图谱（C-NMR）。

图8 实施例2菌株W1分泌的表面活性剂初提物的飞行时间质谱图（MALDI-TOF）。

图9 实施例3应用实验1清洗结束后静置0.5 h土壤、清洗液水相和清洗出的石油分层情况。

图10 实施例3应用实验1清洗4~12 h土壤样品石油烃（C₁₀-C₄₀）含量及石油回收率变化。

图11 实施例3应用实验1清洗12 h后土壤样品的性状变化，A为清洗前， B为清洗后。

图12 实施例3应用实验2清洗4~12 h土壤样品石油烃（C₁₀-C₄₀）含量及石油回收率变化。

图13 实施例3应用实验2清洗12 h后土壤样品的性状变化，A为清洗前， B为清洗后。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。

实施例1

菌株W1的分离、筛选及鉴定

菌株的分离：将取自青海油田尕斯三号作业区附近的石油污染砂质土壤样品（开采时的落地原油污染的土壤）5 g，放入装有50 mL无菌水的三角瓶中，200 rpm室温振荡30min，取上清液为菌悬液。取10 mL菌悬液，加入无菌试管，并在沸水浴中加热10 min。将加热后的菌悬液用无菌水稀释10⁷倍，取稀释液0.1 mL涂布于以石油为唯一碳源的石油-无机盐固体培养基表面。培养基配方： KCl 1.1 g、NaCl 1.1 g、KH₂PO₄ 3.4 g、K₂HPO₄ 4.4 g、(NH₄)₂SO₄ 1g、玉米浆干粉 0.1g、琼脂 20 g、溶于995 mL去离子水，再加入5 mL的微量元素溶液（ZnSO₄ 0.29 g/L、CaCl₂ 0.24 g/L、CuSO₄0.25 g/L、MnSO₄ 0.17 g/L），调节pH至7.2。制备方法：培养基灭菌后取适量倒入培养皿，待培养基凝固后，在无菌操作台中将3 mL石油-氯仿溶液均匀涂抹在固体培养基表面，待氯仿溶液挥发、石油形成不可流动的油膜后，即得到石油-无机盐固体培养基。石油-氯仿溶液配方：取1.0 g石油溶解于3 mL氯仿，混匀。石油为青海油田开采的原油。将涂布好的平板60℃培养，3天内能够生长的，挑取菌落反复在石油-无机盐固体培养基上划线分离，直至分离得到单菌落，供下一步筛选。

菌株的筛选：将分离得到的各个单菌落分别以点样的方式接种到新的石油-无机盐固体培养基表面，放入60℃培养箱中培养。记录接种后培养基表面形成的透明圈直接和菌落直径，并计算其直径比和记录透明圈形成的时间。透明圈与菌落的直径比代表菌种分泌表面活性剂能力的强弱。其中菌株W1培养24 h后在石油-无机盐固体培养基表面的生长状况和形成的透明圈如图1所述，透明圈与菌落的直径比普遍大于2:1，在所有分离得到的菌株中其直径比最大，形成透明圈的时间也最短。因此，选择其进行下一步研究，并将该菌命名为W1。

菌株的耐盐性检测：将菌株W1分别接种到装有50 mL含不同NaCl浓度的LB液体培养基的摇瓶中，60℃，200 rpm培养24 h，测定培养液的菌浓度（OD值）。含不同NaCl浓度的LB液体培养基配方：胰蛋白胨10.0 g、酵母浸粉5.0 g、NaCl 10.0~150.0 g、去离子水1.0 L，pH 8.0。结果如图2所示，菌株W1在含12 wt% NaCl的LB液体培养基中培养24 h后得到的培养液的菌浓度仍为含1 wt% NaCl培养液的75%左右，说明菌株W1具有良好的耐盐性。

菌株的pH耐受性检测：将菌株W1分别接种到装有50 mL不同pH值的LB液体培养基的摇瓶中，60℃，200 rpm培养24 h，测定培养液的菌浓度（OD值）。不同pH值的LB液体培养基配方：胰蛋白胨10.0 g、酵母浸粉5.0 g、NaCl 10.0 g、去离子水1.0 L，分别用浓度为1mol/L的HCl或NaOH的水溶液，将配制后的LB液体培养基的pH值调节至5.5~10.5。结果如图3所示，菌株W1最适pH为8.0，并在pH 7.5~9.5的范围内长势良好（菌浓度为最适pH条件下的85%以上），说明菌株W1具有一定的耐碱性。

菌株的鉴定：(1) 菌落特征观察：菌株W1在LB固体培养基上的菌落直径为1-1.5mm，菌落呈白色，中间及边缘颜色无差异，但边缘有光泽、不整齐，符合典型芽孢杆菌的菌落特征。(2) 个体形态观察：取LB固体培养基上形成的W1单菌落，固定于载玻片上进行革兰氏染色，用光学显微镜观察。菌株W1为革兰氏阳性、有芽孢、具有杆菌的典型形貌特征。(3) 菌株测序：将菌株W1接种于LB液体培养基，60℃摇床培养至对数生长期，取适量培养液离心2 min (4000 rpm，4℃)，弃尽上清液，得到菌体，提取菌体基因并测序。通过16S rDNA序列构建的系统发育树分析表明（图4），菌株W1位于Bacillus velezensis分支上。结合生理生化特征将菌株W1鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。该菌株W1已保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；地址：中国.武汉.武汉大学，湖北省武汉市武昌区八一路299号；保藏日期为2020年9月2日；分类命名为Bacillus velezensis strainW,保藏编号为CCTCC NO: M2020431。

实施例2

菌株W1的发酵培养、分泌的表面活性剂的鉴定及含有W1活菌体的菌剂的制备

菌株的发酵培养：将实施例1的菌株Bacillus velezensis strainW (CCTCC NO:M2020431) 接种至葡萄糖-玉米浆干粉液体培养基中发酵扩大培养。50 L发酵罐的发酵条件为pH 8.0，发酵温度为60℃，搅拌速度为150~250 rpm，发酵时间24 h，发酵结束时发酵液中菌浓度OD₆₀₀ = 10~12。所用葡萄糖-玉米浆干粉液体培养基配制方法为：葡萄糖1.5 g/L、玉米浆干粉4 g/L，发酵培养基体积32 L，调节初始pH值至8.0，115℃灭菌30 min。发酵过程当溶氧升高至30%后开始补料，补料培养基配制方法为：葡萄糖15 g/L、玉米浆干粉40 g/L，补料培养基体积3 L，调节初始pH值至8.0，115℃灭菌30 min。

分泌的表面活性剂的提取与鉴定：取1 L 发酵液8000 rpm离心10 min。收集上清液加入6 mol /L HCl 溶液调至pH 2.0，4℃静置过夜，再次离心，收集产生的絮状沉淀。将絮状沉淀用氯仿:甲醇 = 2:1（v/v）的提取液抽提，抽提液65℃旋转蒸发去除溶剂，析出的固体65℃干燥过夜，即得到分泌的表面活性剂的初提物。综合分析初提物的红外图谱（FT-IR、图5)，核磁共振图谱（H-NMR、图6；C-NMR、图7）和飞行时间质谱（MALDI-TOF、图8）可确定菌株W1生长（发酵）过程分泌的表面活性剂为脂肽类生物表面活性剂，相对分子质量约为1056 Da。

含有菌株W1活菌体的菌剂制备：发酵培养得到的W1的菌液，即可视为含有菌株W1活菌体的液体菌剂，该液体菌剂可在4℃条件下保存3天。或向液体菌剂加入体积比为30%的甘油，可在-20℃条件下保存30天（液体菌剂1）。将发酵培养得到的W1的菌液，8000 rpm离心10 min富集得到的菌膏，即为含有菌株W1活菌体的固体菌剂，该固体菌剂可在4℃条件下保存15天。或将离心富集得到的菌膏，按照菌膏：麦芽糊精：水 = 1:1:1.2的质量比混合、调浆后再经喷雾干燥得到的干粉，即为含有菌株W1活菌体的干粉菌剂，该干粉菌剂可在阴凉、通风的环境中保存30天或-4℃条件下保存180天（固体菌剂1）。

实施例3

含有菌株W1活菌体的菌剂作为清洗剂修复低浓度石油污染砂质土壤的应用实验

需要说明的是，发明人通过大量的修复应用实验证明，采用含有菌株W1活菌体的液体、固体或干粉菌剂作为清洗剂，在清洗用水与低浓度石油污染土壤样品的质量比为1.5:1~4.5:1，仅提供少量的无机和/或有机氮源（污染物石油中的总碳与添加的氮源中的总氮的摩尔比为5:1~15:1）和搅拌清洗时间为4~12 h的范围内，均可使清洗后的低浓度石油污染土壤样品的石油烃含量降低至0.3%~0.8%，且石油的回收率约为50%~70%，但由于修复方法基本相同，仅将2组清洗效果最优的应用实验作为实施例用于说明本发明，即为本发明修复低浓度石油污染砂质土壤的优选条件。

应用实验1：修复石油开采过程中因落地原油形成的低浓度石油污染砂质土壤。低浓度石油污染砂质土壤样品取自青海油田尕斯三号作业区附近，初始石油烃含量为3.2%，污染（石油老化）时间超过2年。将6.67 g上述土壤样品和30 mL预热至60℃的自来水（水土质量比为4.5:1）装入100 mL三角瓶中，混匀，通过加入适量的NaOH调节水土混合物的pH值为8.0。再向水土混合物中加入有机氮源---玉米浆干粉0.089 g、无机氮源---磷酸氢二铵0.046 g（总C/N比为10:1）和0.03 mL 菌浓度（OD值）为10的菌株W1的发酵液（实施例1制备得到的液体菌剂，现配现用），60℃、200 rpm条件下搅拌4~12 h。每2 h通过注射器吸取回收清洗液上层聚集形成的石油。清洗至规定的时间后，停止搅拌，静置0.5h，待土壤、清洗液水相和清洗出的石油分层后（如图9所示），回收上层石油，小心倾倒弃去清洗液水相，清洗后的土壤样品自然风干，采用国标《土壤和沉积物石油烃（C₁₀-C₄₀）的测定气相色谱法》（HJ1021-2019）规定的检测方法，测定清洗后土壤样品的石油烃含量。

如图10所示，采用该方法修复石油开采过程中因落地原油形成的低浓度石油污染砂质土壤，清洗4 h后，土壤样品的石油烃（C₁₀-C₄₀）含量已将至0.61%，达到国标《土壤环境质量建设用地土壤污染风险管控标准》（GB36600-2018）规定的二类建设用地的土壤石油烃（C₁₀-C₄₀）含量的要求（≤0.9%）。清洗8 h后，土壤样品的石油烃（C₁₀-C₄₀）含量已将至0.38%，达到国标GB36600-2018规定的一类建设用地的土壤石油烃（C₁₀-C₄₀）含量的要求（≤0.5%）。清洗12 h后，土壤样品的石油烃（C₁₀-C₄₀）含量已降至0.29%，清洗后期土壤石油烃含量变化并不明显，即清洗8~12h已基本达到本清洗方法的最佳效果，石油的回收率约为54.0%。空白组（仅不加入微生物清洗剂，其它条件均相同）清洗12 h后土壤样品的石油烃含量为1.54%，说明本发明的微生物清洗剂在清洗过程中发挥了重要的作用。

采用该方法修复石油开采过程中因落地原油形成的低浓度石油污染砂质土壤，清洗12 h后的土壤样品的性状如图11所示。清洗前土壤样品为棕黑色，有明显的石油气味，土壤团聚成小颗粒，并伴随有少量的黑色油泥颗粒。清洗后的土壤样品颜色明显变浅，分为土质部分和沙粒部分。土质部分呈浅棕色，沙粒部分为浅棕色或类似于石英的灰白色，肉眼观察不到黑色的油泥颗粒，无石油气味及其它杂味。说明清洗后土壤样品无残留，基本达到污染前性状，到了土壤修复的效果。

应用实验2：修复罐底油泥经热碱法清洗后形成的低浓度石油污染砂质土壤。该样品取自青海油田采油一厂。开采后石油中仍含有的少量土壤，土壤在石油的暂储罐内沉积，与石油混合形成含油量＞20%的油泥。罐底油泥经热碱法清洗后，该样品的石油烃含量仍为2.9%，未能达到国标GB36600-2018规定的建设用地的要求。将12 g上述土壤样品和30 mL预热至60℃的自来水（水土质量比为2.5:1）装入100 mL三角瓶中，混匀，通过加入适量的NaOH调节水土混合物的pH值为8.5。再向水土混合物中加入有机氮源---玉米浆干粉0.033 g、无机氮源---磷酸氢二铵0.103 g（总C/N比为10:1）和0.006 g菌株W1发酵液离心后得到的菌膏（实施例1制备得到的固体菌剂），60℃、150 rpm条件下搅拌4~12 h。每2 h通过注射器吸取回收清洗液上层聚集形成的石油。清洗至规定的时间后，停止搅拌，静置0.5h，待土壤、清洗液水相和清洗出的石油分层后，回收上层石油，小心倾倒弃去清洗液水相，清洗后的土壤样品自然风干，采用国标HJ 1021-2019规定的检测方法，测定清洗后土壤样品的石油烃含量。

如图12所示，采用该方法修复罐底油泥经热碱法清洗后形成的低浓度石油污染土壤，清洗4 h后，土壤样品的石油烃（C₁₀-C₄₀）含量已将至0.60%，达到国标《土壤环境质量建设用地土壤污染风险管控标准》（GB36600-2018）规定的二类建设用地的土壤石油烃（C₁₀-C₄₀）含量的要求（≤0.9%）。清洗8 h后，土壤样品的石油烃（C₁₀-C₄₀）含量已将至0.44%，达到国标GB36600-2018规定的一类建设用地的土壤石油烃（C₁₀-C₄₀）含量的要求（≤0.5%）。清洗12 h后，土壤样品的石油烃（C₁₀-C₄₀）含量已将至0.35%，清洗后期土壤石油烃含量变化并不明显，即清洗8~12 h已基本达到本清洗方法的最佳效果，石油的回收率约为62.0%。空白组（仅不加入微生物清洗剂，其它条件均相同）清洗12 h后土壤样品的石油烃含量为1.63%，说明本发明的微生物清洗剂在清洗过程中发挥了重要的作用。

采用该方法修复罐底油泥经热碱法清洗后形成的低浓度石油污染土壤，清洗12 h后的土壤样品的性状如图13所示。清洗前土壤样品为棕黑色，有明显的石油气味，伴随有少量的黑色油泥颗粒。清洗后的土壤样品为浅棕色或卡其色的沙粒，肉眼观察不到黑色的油泥颗粒，无石油气味及其它杂味。说明清洗后土壤样品无残留，基本达到污染前性状，到了土壤修复的效果。

Claims

1. 一株贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis strainW，于2020年9月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为Bacillus velezensis strainW，贝莱斯芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2020431，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

2. 一种液体菌剂，为将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensisstrainW经发酵培养后得到的液体菌剂。

3.根据权利要求2所述的液体菌剂，为将权利要求2所述得到的液体菌剂经加入体积分数为30-40%的甘油形成的另一种液体菌剂。

4.一种固体菌剂，为将权利要求2所述得到的液体菌剂经离心后富集得到的菌膏。

5.根据权利要求4所述的固体菌剂，为将权利要求4所述得到的菌膏与麦芽糊精：水按质量比1:1-2:1.2-3混合调浆，经喷雾干燥得到的干粉。

6.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌、权利要求2或3所述的液体菌剂、权利要求3或4所述的固体菌剂作为微生物清洗剂上的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的微生物清洗剂在清洗石油烃类污染物上的应用，所述的石油烃类污染物为砂质土壤中的石油烃类污染物。

8.一种修复石油污染的砂质土壤的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂作为清洗剂，与石油烃类污染砂质土壤样品、适量的水和氮源在一定的温度下搅拌，以清洗石油污染土壤至土壤中石油烃含量降低至0.9%以下，即可完成修复修复石油污染的砂质土壤。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的石油污染土壤样品为石油开采过程中因石油落地形成的或罐底油泥经化学或热碱法清洗后形成的石油烃含量为2%~5%的砂质土壤。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的石油烃类的污染物包括C₁₀-C₄₀的烷烃类污染物。