CN110257272A

CN110257272A - 丛毛单胞菌和肠杆菌的复合菌剂高效固定镉及在镉污染修复的应用

Info

Publication number: CN110257272A
Application number: CN201910272883.4A
Authority: CN
Inventors: 王革娇; 王杏; 胡康; 禄凌飞; 廖水娇
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-04-04
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2019-09-20
Anticipated expiration: 2039-04-04
Also published as: CN110257272B

Abstract

本发明属于农业环境微生物应用技术领域，具体涉及丛毛单胞菌和肠杆菌的复合菌剂高效固定镉及在镉污染修复中的应用。本发明证实，分离筛选自农田中的肠杆菌A11(保藏编号为CCTCC NO:M2019149)和丛毛单胞菌A23(保藏编号为CCTCC NO:M2019148)复合菌剂具有高效固定农业环境中钝化镉的能力。盆栽试验表明，上述分离菌株组成的复合菌剂具有钝化或固定土壤中镉的能力，该复合菌剂可减少蔬菜对镉的富集、吸收，可作为农田中镉污染环境修复的新型微生物菌剂。

Description

丛毛单胞菌和肠杆菌的复合菌剂高效固定镉及在镉污染修复的应用

技术领域

本发明属于农业环境微生物应用技术领域，具体涉及丛毛单胞菌和肠杆菌的复合菌剂高效固定镉及在镉污染修复中的应用。

背景技术

Cd在元素周期表中，是第五周期第二副族元素，同族元素还有Zn、Hg和Cn。Cd在地壳中的含量是0.11ppm，其化学性质表现为可溶于酸不溶于碱。氧化态有+2价和+1价两种。+1价镉在化合物中以双聚离子形式出现，但其存在不稳定，在水中立刻发生歧化反应，即转化为+2 价镉和单质镉。因此，镉多以+2价形式存在。Cd广泛的应用于电池制造，染料生产和量子点材料制造领域。在自然界中，Cd不能降解，工业生产活动均增加了Cd释放到环境中的风险，增大了人体暴露于镉污染中的几率。Cd会随着食物链进入人体，引起线粒体损伤、加速细胞死亡，引起肺癌、膀胱癌和肾癌。比较常见的是对成骨系统的损伤，导致痛痛病产生。研究表明，经细胞膜进入胞内的Cd，可以与胞内的巯基基团结合，或者被胞内的多聚磷酸固定而达到解毒的作用。过量的Cd²⁺会使胞内氧化自由基增加，从而造成对细胞器的损伤。

目前，Cd去除的方式主要有：化学方法如，沉淀和胶结。物理方法，如离子交换，溶剂萃取，膜过滤和活性炭吸附。生物Cd去除方法，主要有吸附和沉淀两种。生物吸附是细胞分泌的胞外多糖或生物大分子物质如草酸、苹果酸等鳌合Cd²⁺。生物沉淀是生物可以使游离态的Cd²⁺形成CdS或Cd(OH)₂沉淀而达到去除的目的。与物理和化学方法相比，生物去除法具有价格便宜，环境友好等优点，而受到人们的关注。

近来，应用微生物直接修复镉污染环境，或制备成微生物菌剂、采用植物-微生物联合修复的方法、微生物固定化技术修复的方式多有报道(见表1)。蒋慧丹等(申请号：201810065127.X)报道了由异养微生物硫还原泥土杆菌(Geobacter metallireducens)、脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus sp.)、固氮醋酸杆菌(Acetobacter diazotrophicus)、厌氧粘细菌 (Anaeromyxobacter sp.)、木霉(Streptophyta sp.)和自养微生物嗜酸氧化硫硫杆菌 (Acidithiobacillus thiooxidans)、喜温硫杆菌(Acidithiobacilluscaldus)、嗜酸杆菌(Acidiphilium cryptum)混合而成的功能菌群，可将镉含量为21mg/kg的镉污染土样中酸溶态镉和可氧化态镉去除87.17％和63.20％。余秀梅等(申请号：201711119185.8)报道了一株根瘤菌(Rhizobium pusense)KG2，可在50mg/kg的Cd ²⁺土壤中使大豆植株根部Cd含量降低45.9％。陈正军等(申请号：201110215364.8)报道了一株恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)HN103，在试验室条件下，42h镉去除率分别为60％和90％(50mg/L和10mg/L起始Cd²⁺含量)。刘学端等(申请号：201710448604.6)利用隐性嗜酸杆菌(Acidiphilium cryptum)、皱褶假丝酵母菌(Candida rugosa)、固氮醋酸杆菌(Acetobacter diazotrophicus)、粘红酵母菌(Rhodotorula glutinis)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，在5天内将镉含量为1.12mg/kg的土壤去除50.6％。蒲强等(申请号：201611116120.3)，采用固定化技术，利用蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)B19，使植株镉含量降低了37％，土壤有效态镉含量降低了8％。孙莹等(申请号：201610339703.6)，发现嗜碱贪铜菌(Cupriavidusalkaliphilus strain LYTTJ)，在Cd²⁺含量为1000mg/L、2000mg/L、 3000mg/L条件下，在5d、9d和15d可完全将溶液中的Cd²⁺去除。何池全等(申请号：201610474065.9)，采用嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)联合电动可渗透反应墙修复装置，对土壤镉的去除率为63.6％。庄会德等(申请号：201610488744.1)，采用光合作用细菌、放线菌属、酵母菌和乳酸菌与化学物质联合，制备的复合型土壤重金属污染固定修复剂，对镉、铬、铜、锌、汞、砷、铅中的单一型或复合型重金属污染的土壤，有一定的修复能力。徐卫红等(申请号号：201610645716.6)，发现摩西球囊霉(Glomuseburneun)、幼套球囊霉(Glomus etunicatum)、根内球囊霉(Glomus intraradices)与纳米材料联合，可使土壤有效镉含量降低8.3％～36.3％，全镉含量降低18.9％～33.1％。林森等(申请号： 201510564707.X)，制备的地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)菌剂，对镉的去除率达73.49 ％。朱晓丽等(申请号：201410402653.2)，通过诱变处理的路德维希肠杆菌(Enterbacter ludwigii)SRB-2-5u-2和解糖假苍白杆菌(Pseudochrobactrumsaccharolyticum)LB-4-4-1c，可在一定程度上促进植物生长和减少植物中镉含量。唐八生等(申请号：201310289456.X)报道了制备的沼泽红假单胞菌(Rhodop seudanonaspalustris)菌剂，使土壤镉含量降低了32.5％。

虽然对镉污染环境有修复作用的微生物已有大量报道，但寻找新的具有镉固定能力的微生物资源，高效、快捷、环保、低成本的镉固定方法仍然是修复镉污染环境，亟待解决的问题。表1汇总了近年来相关专利文献中涉及微生物对镉修复应用情况。

表1相关专利文献中微生物对镉修复情况表

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，分离筛选能高效去除环境中对镉有作用的菌株，例如肠杆菌和丛毛单胞菌，通过微生物的应用，修复环境中镉的污染。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人分离、筛选得到两株能高效去除镉(Cd²⁺)的微生物菌株，根据经典微生物学形态特征分类和生物信息学分类，对这两株菌株分别分类和命名。其中一株菌株为肠杆菌A11， Enterbacter sp.A11，于2019年3月15日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:M2019149；另一株菌株为丛毛单胞菌A23，Comamonas sp.A23，于2019年3月15日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:M2019148。

本发明的肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23的筛选方案参见图1。由图1所示，采集中国湖南省株洲市某镉污染的农田土壤样品，加一定浓度(见后面的详细描述，下同)镉(CdCl₂)进行富集培养，再对富集培养的土样进行稀释并涂布含有一定浓度Cd²⁺的LB固体培养基平板，培养长出镉抗性菌，挑取不同形态的菌落划线得单菌落。分别对单一菌株，不同方式组合的菌株进行镉去除能力试验，筛选出镉去除高效的组合模式。对检测出的镉去除菌做16S核糖体 RNA基因序列鉴定，结合形态学和基因组分析等相关鉴定工作，最终得到肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23。

本发明的积极效果：

Cd²⁺广泛存在于土壤和水体中，会随着食物链进入人体，大量的镉积累在体内会有致畸、致癌和致突变作用。本发明筛选到的肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23在单独培养时，几乎没有钝化镉的能力，但是组合培养后，36h后对培养基中CdCl₂(0.1mM)的去除率为97.76％。将其应用到盆栽试验中，两菌在盆栽试验中定殖稳定。与对照相比，组合菌的加入，含镉量为5mg/kg 的土壤中，可提取态镉含量减少了25％，可还原态镉含量减少了8％。含镉量为10mg/kg的土壤中，可提取态镉含量减少了12％，可还原态镉含量减少了2％。在盆栽植物试验中，可食用部分的镉含量分别减少37％和45％(以5mg/kg和10mg/kg土壤中计算)。在低镉条件下(镉含量5mg/kg土壤)，可使上海青蔬菜的可食用部分中的镉的含量，下降到国家安全标准，因此本发明的微生物有望在农业镉污染修复方面发挥重要作用。

本发明的这种组合模式下具有钝化镉能力的肠杆菌和丛毛单胞菌目前还没有报道，本发明可丰富微生物固定镉资源库，且本发明具有操作简单，无需额外添加化学试剂、改变土壤条件和菌株改造的优点，试验菌株克服了在自然环境中难以定殖的问题，具有积极的效果。

附图说明

图1：本发明的技术路线图。

图2：本发明的肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23的系统发育进化树图。

图3：本发明的肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23的扫描电镜照片，附图标记说明：图3中的A 图是肠杆菌A11扫描电镜照片图，图3中的B图是丛毛单胞菌A23的扫描电镜照片图。

图4：本发明的肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23在LB培养基中镉去除的曲线图。附图标记说明：图4中的A图起始Cd²⁺浓度为50μM时，肠杆菌A11，丛毛单胞菌A23以及肠杆菌A11+丛毛单胞菌A23组合条件下的镉去除曲线图；图4中的B图是起始Cd²⁺浓度为100μM时，肠杆菌A11，丛毛单胞菌A23以及肠杆菌A11+丛毛单胞菌A23组合条件下的镉去除曲线图；图4中的C图是起始Cd²⁺浓度为200μM时，肠杆菌A11，丛毛单胞菌A23以及肠杆菌A11+丛毛单胞菌A23组合条件下的镉去除曲线图。

图5：本发明的肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23在盆栽试验中的生长曲线图。附图标记说明：图5中的A图是土壤镉含量为5mg/kg的试验组中，肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23在土壤中的定殖曲线图；图5中的B图是土壤镉含量为10mg/kg的试验组中，肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23 在土壤中的定殖曲线图。

图6：本发明的肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23在盆栽试验中使形态镉变化的柱形图。附图标记说明：图6中的A图是土壤镉含量为5mg/kg的试验组(不加菌+不种菜，不加菌+种菜，加菌+种菜)中土壤形态镉含量图；图6中的B图是土壤镉含量为10mg/kg的试验组(不加菌+ 不种菜，不加菌+种菜，加菌+种菜)中土壤形态镉含量图。

图7：本发明的肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23在盆栽试验中使植物中含镉量变化的柱形图。附图标记说明：图7中的A图是土壤镉含量为5mg/kg的试验组中蔬菜地上部分和根部镉含量图；图7中的B图是土壤镉含量为10mg/kg的试验组中蔬菜地上部分和根部镉含量图。

具体实施方式

对序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:1序列的说明。

序列表SEQ ID NO:1是肠杆菌A11的16S核糖体RNA基因序列。

序列表SEQ ID NO:2是丛毛单胞菌A23的16S核糖体RNA基因序列。

实施例1：肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23的分离鉴定

⑴样品采取：微生物的采集和分离地点为湖南省株洲市某镉污染的农田表层土壤。

⑵样品富集：精确称取土样100g于250mL灭菌三角瓶中，加10μL 1mM的氯化镉CdCl₂(Cd²⁺)，轻轻搅匀置28℃培养箱中培养一周，注意补加无菌水，确保样品不干燥。

⑶镉抗性菌分离：精确称取Cd²⁺富集土样10g于装有90mL无菌生理盐水的三角瓶中，置28℃摇床中振荡半小时，再依次取1mL到9mL无菌生理盐水中逐步稀释至10^-3、10^-4、10^-5，分别取0.1mL涂布含0.1mM Cd²⁺的LB固体培养基平板，每个稀释度涂布3个平板，置28℃培养箱中培养一周，长出的菌株为候选的镉抗性菌，将平板置于4℃冰箱中待用。配制常用的LB 液体培养基，配方如下(1L)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，补充蒸馏水至1L。在121℃高压蒸汽下灭菌20min。LB固体培养基的成分同液体培养基，LB固体培养基需添加1.6％的琼脂。

⑷划线分离：将步骤(3)中得到的候选镉抗性菌挑取不同的菌落划线，确保得到单克隆，划线用R2A培养基平板，待候选菌长出后放4℃冰箱并用甘油冷冻管保存一份于-80℃冰箱。配制R2A培养基。R2A培养基配方如下(按1L体积计算)：酵母粉0.5g，可溶性淀粉0.5g，蛋白胨0.5g，磷酸氢二钾0.3g，酪蛋白氨基酸0.5g，丙酮酸钠0.3g，葡萄糖0.5g，MgSO₄·7H₂O0.05g，补充蒸馏水至1L。在121℃高压蒸汽下灭菌15min。

⑸镉去除菌株的筛选：将步骤(4)中得到的镉抗性菌单克隆转接到LB培养基中，该培养基添加有100μM的氯化镉，测定单一菌株、两两组合菌株，溶液中剩余Cd²⁺含量。筛选能高效去除镉的菌株及组合模式。

⑹镉去除菌的分类鉴定：一是利用16S rDNA鉴定，即采用原核生物16S rDNA通用引物 27F(5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3')和1492R(5'GGYTACCTTGTTACGACTT3')做PCR (具体PCR方法参见华中农业大学授权专利“一种土壤总DNA小量快速提取方法”，专利号：2005101205847，2008年7月31日授权)。扩增肠杆菌A11的16S rDNA并测序，再与NCBIGenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)核苷酸数据库进行比对，本发明分离的肠杆菌A11的核苷酸序列同源性为99.59％。采用MEGA 6.0软件构建系统发育进化树，发现本发明分离的肠杆菌A11 菌株能稳定地与肠杆属的菌株聚在一起(见图2)，将该菌株鉴定为肠杆菌Enterbacter sp.A11。本发明检测到丛毛单胞菌A23的核苷酸序列的同源性为99.93％，系统发育进化树中能稳定地与丛毛单胞菌属的菌株聚在一起(见图2)，将该菌株鉴定为丛毛单胞菌Comamonas sp.A23。二是利用扫描电子显微镜进行对分离的菌株进行形态学鉴定(结果见图3，革兰氏染色分析和生长特性鉴定)。

肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23菌学特征：

肠杆菌A11菌株：菌体杆状，长0.5-1.0μm，宽0.5-0.8μm(图3中的A图)，革兰氏阴性菌，适宜生长温度为15-37℃，适宜pH为5.0-10.0，兼性厌氧，在R2A培养基中菌落为白色圆形。

丛毛单胞菌A23菌株：菌体杆状，长1.0-2.0μm，宽0.5-0.8μm(图3中的B图)，革兰氏阴性菌，适宜生长温度为15-37℃，适宜pH为5.0-10.0，好氧，在R2A培养基中菌落为白色圆形。

镉抗性基因的鉴定：

分别接种肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23于LB液体培养基中，该培养基补加有5μL 1M的 Cd²⁺，使其终浓度为100μM，置28℃摇床中振荡培养，12h后收集菌体抽其DNA(按常规方法)并进行基因组的测定。其基因组已提交至National Center for BiotechnologyInformation Search database(NCBI)网站进行注释，肠杆菌A11的注册号为RSDS00000000，丛毛单胞菌A23 的注册号为RSDT00000000。

肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23的保藏：

肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23都可以在R2A、1/10TSB液体或固体培养基上在28℃培养，培养后可在4℃下作短期保藏。若长期保藏，可使用甘油冷冻管或冷冻干燥管(参见：赵斌，何绍江，微生物学实验第一版，科学出版社.北京，2002：202－205)保藏菌株的方法比较合适。

实施例2：肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23的镉去除曲线

挑取肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23的单克隆接种到100mL的LB液体培养基，于28℃摇床中振荡培养至OD₆₀₀为0.5左右，将其作为种子液，以1％(体积)的接种量接种于新鲜的100mL LB液体培养基(起始OD₆₀₀<0.01)，并向培养基中添加10μL 1M的Cd²⁺，使其终浓度至100μM。将配制后的培养基置于28℃摇床中振荡培养，每隔12小时取一次样，测定溶液中剩余的镉含量。溶液中镉浓度可用氢火焰原子吸收仪(AAS)进行测定。

实施例3：肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23在盆栽试验中的定殖情况

盆栽试验土壤取自华中农业大学校园农田土(为常规的黄棕壤，pH为酸性)。取地表下 5-20cm的的土壤，去除土壤中可见杂质，将其自然风干后过2mm筛网，每盆(规格：长50cm、宽14cm、高5cm)分装10kg土样。试验分为4个处理组(即：处理组1：向土壤中加入终浓度为5mg/kg的Cd²⁺，并加入终浓度为10⁷CFU/g的组合菌液(肠杆菌A11+丛毛单胞菌A23，下同，两种菌的体积比1:1)；处理组2：向土壤中加入终浓度为5mg/kg的Cd²⁺，作为处理组1的不加菌液对照组；处理组3：向土壤中加入终浓度为10mg/kg的Cd²⁺，并加入终浓度为10⁷CFU/g的组合菌液(配比同处理组1)；处理组4：向土壤中加入终浓度为10mg/kg的Cd²⁺，作为处理组3的不加菌对照组)每组设置4个重复。试验用蔬菜品种为小白菜“上海青”(Brassicachinensis var.chinensis)，取播种后两周苗高为7-10cm长势良好的上海青进行移栽，四个处理组均进行移栽，每盆移栽5株，株间距为5-8cm。

分别用红色荧光蛋白质粒pTn7-RFP(携带有Gentamicin抗性基因，来源于华中农业大学试验室构建，为科研领域交流生物材料)标记肠杆菌A11，用绿色荧光蛋白质粒pHc60-GFP (携带Tetracyclines抗性基因，来源于华中农业大学农业微生物学国家重点系重点试验室构建)标记丛毛单胞菌A23。取0d，3d，5d，9d，14d，20d和30d土壤样品，采用平板计数法判断A11和A23菌株在盆栽试验中的定殖情况。具体步骤如下：取10g土样加入90mL0.85％浓度的无菌生理盐水，置于250mL三角瓶(加入5-8粒玻璃珠)中，于28℃150rpm/min振荡培养2h后，再依次取1mL至9mL无菌生理盐水中逐步稀释至10^-3、10^-4、10^-5，分别取0.1mL涂布含抗生素(Gentamicin/Tetracyclines)的LB固体培养基平板，每个稀释度涂布3个平板，置28℃培养箱中培养一周，将含菌落的平板置于体式荧光显微镜下观察，分别计数平板中发红色和绿色荧光的菌落数。

实施例4：盆栽试验中的形态镉的变化柱形图

采用BCR连续提取法(Senol Kartal,ZekiSerifeJournal ofHazardous Materials 132(2006)80–89)，提取到的土壤中的各形态镉，分别为可提取态(exchangeable and bound to carbonates)、可还原态(reducible)、可氧化态(oxidizable)和残渣态(residual)。具体步骤如下：

第一步(酸可提取态镉):

称取1.000g样品(湖南株洲镉污染的农田表层土壤)于50mL聚丙烯离心管中，加入15mL 0.11mol/L乙酸(HAc)提取液，在室温下震荡16h后，离心分离(5000r/min， 10min)；将上层清液倒入聚乙烯瓶中(取10mL提取液和10mL HNO₃于烧杯中，加盖后置于电热板上消解定容后待测，下同)。加入20mL去离子水洗涤残余物，振荡20min，离心，弃去清洗液。

第二步(可还原态镉):

向第一步的残余物中加入15mL 0.5mol/L NH₂OH·HCl提取液，在室温下震荡16h，离心分离。其余操作同第一步。

第三步(可氧化态镉):

向第二步的残余物中加入10mL H₂O₂，盖上离心管盖，在室温下消解1h，然后去盖置于85℃水浴锅中消解1h，加热至溶液蒸发近干，再加入10mL H₂O₂，加热至溶液近干。冷却后，加入15mL 1mol/L乙酸铵(NH₄OAc)提取液，在室温下震荡16h。其余操作同第一步。

第四步(残渣态镉):

将经过第三步提取后的残渣称取0.200g，转移到50mL聚四氟乙烯烧杯中，然后加入 10mL HNO₃、1mL氢氟酸(HF)和1mL HClO₄，加盖后于185℃电热板上消解至澄清透明。离心取上清测定镉浓度。

最后，采用空气-乙炔火焰原子吸收光谱法测定提取的不同形态的镉。

实施例5：盆栽试验中的植物总镉含量变化的柱形图

取盆栽试验第30d成熟的小白菜样品，将小白菜品种“上海青”小心的从花盆中移出，确保根茎不被弄断。用去离子水反复冲洗植株表面，将沾有的土壤冲洗干净。分别测量植株整株鲜重，根部和地上部鲜重。

小白菜“上海青”中镉含量的测定，参照中华人民共和国国家标准(编号GB5009.15-2014) 《食品中镉的测定》推荐的测定方法。测试结果见图4。

由图4可以看出，与单一菌株相比，组合菌株(菌液)肠杆菌A11+丛毛单胞菌A23在初始时的镉浓度为50μM、100μM和200μM的条件下，36h时后镉的去除率分别为97.84％、97.76％和93.09％。其中：图4中的A图为初始镉离子浓度为50μM，单一菌株肠杆菌A11，丛毛单胞菌A23和组合菌株(组合菌液)在72h内的镉去除曲线图。图4中的B图为初始镉离子浓度为100μM，单一菌株肠杆菌A11，丛毛单胞菌A23和组合菌株(组合菌液)肠杆菌A11+丛毛单胞菌A23在72h内镉的去除曲线图。图4中的C图为初始镉离子浓度为200μM，单一菌株肠杆菌A11，丛毛单胞菌A23和组合菌株肠杆菌A11+丛毛单胞菌A23在72h内的镉去除曲线图。

由图5可知，肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23菌株在30d的盆栽试验中，均可以在土壤中稳定存在。在镉含量为5mg/kg的土壤中，20d内肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23的菌落数维持在 10⁶-10⁷CFU/g之间，第30d时两菌的菌落数减少到10⁴CFU/g(图5中的A图)。在镉含量为10mg/kg的土壤中，20d内肠杆菌A11和丛毛单胞菌A23也维持在10⁶-10⁷CFU/g之间；第30d时两菌的菌落数减少到10⁵CFU/g(图5中的B图)。

如图6所示，加入5mg/kg的原始(即华中农业大学农田土)土壤中各形态镉，可提取态 (exchangeable and bound to carbonates)、可还原态(reducible)、可氧化态(oxidizable)和残渣态(residual)的含量分别为47％，45％，7％和1％。在含5mg/kg Cd的试验组中，与对照组相比，加入组合菌肠杆菌A11+丛毛单胞菌A23的试验组中，可提取态镉含量由41％下降到 16％，减少了25％；而可还原态镉的含量由34％下降到26％，减少了8％。可氧化态镉含量由 3％上升到12％；残渣态镉含量由22％上升到46％。加入10mg/kg的原始土壤(即华中农业大学农田土)中各形态镉，如可提取态、可还原态、可氧化态和残渣态镉的含量分别为52％，43％， 5％和0％。在含10mg/kg Cd的试验组中，与对照组相比，加入组合菌(菌液)肠杆菌A11+丛毛单胞菌A23的试验组中，可提取态镉含量由40％下降到28％，减少了12％；可还原态镉含量由46％下降到44％，减少了2％；可氧化态镉含量由6％上升到11％；残渣态镉含量由8％上升到 17％。与原始土壤相比，加入组合菌株的土壤中，可提取态和可还原态的镉含量均下降，可氧化态和残渣态的镉含量均上升。结果表明，组合菌(组合菌液)肠杆菌A11+丛毛单胞菌A23 的加入，可以使土壤中的可利用态镉转化为不可利用态镉，从而达到钝化镉的效果，这种转化可以应用于镉污染环境的修复中。

由图7中的A图可知，加入组合菌肠杆菌A11+丛毛单胞菌A23(复合菌剂)的含镉量为5 mg/kg的土壤中生长的小白菜“上海青”与对照相比，根部镉含量由6.240mg/kg下降到3.260 mg/kg，下降了64％；地上部可食用部分镉含量由0.282mg/kg下降到0.173mg/kg，下降了37％。由图7中的B图可知，加入组合菌肠杆菌A11+丛毛单胞菌A23(复合菌剂)的含镉量为10mg/kg 的土壤中生长的小白菜“上海青”与对照相比，根部镉含量由9.937mg/kg下降到6.788mg/kg，下降了31％；地上可食用部分镉含量由4.258mg/kg下降到1.479mg/kg，下降了45％。加入组合菌(组合菌液)肠杆菌A11+丛毛单胞菌A23的含镉量为5mg/kg的试验组中，小白菜“上海青”地上可食用部分镉含量下降到0.173mg/kg，低于上述食品安全国家标准《(GB2762-2017) 食品安全国家标准中食品中污染物限量》中镉含量标准，达到了可安全食用的要求。

综上所述，本发明的组合菌株肠杆菌A11+丛毛单胞菌A23(复合菌剂)可高效钝化溶液中的Cd²⁺，在镉污染环境修复中具有较大的应用潜力。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 丛毛单胞菌和肠杆菌的复合菌剂高效固定镉及在镉污染修复的应用

<141> 2019-03-28

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1560

<212> DNA

<213> 肠杆菌(Enterobacter sp.)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1560)

<400> 1

tcattgagca tcaaactttt aaattgaaga gtttgatcat ggctcagatt gaacgctggc 60

ggcaggccta acacatgcaa gtcgagcggt agcacagaga gcttgctctc gggtgacgag 120

cggcggacgg gtgagtaatg tctgggaaac tgcctgatgg agggggataa ctactggaaa 180

cggtagctaa taccgcataa cgtcgcaaga ccaaagaggg ggaccttcgg gcctcttgcc 240

atcagatgtg cccagatggg attagctagt aggtggggta acggctcacc taggcgacga 300

tccctagctg gtctgagagg atgaccagcc acactggaac tgagacacgg tccagactcc 360

tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgca agcctgatgc agccatgccg 420

cgtgtatgaa gaaggccttc gggttgtaaa gtactttcag cggggaggaa ggtgttgagg 480

ttaataacct cagcaattga cgttacccgc agaagaagca ccggctaact ccgtgccagc 540

agccgcggta atacggaggg tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcacgc 600

aggcggtctg tcaagtcgga tgtgaaatcc ccgggctcaa cctgggaact gcattcgaaa 660

ctggcaggct agagtcttgt agaggggggt agaattccag gtgtagcggt gaaatgcgta 720

gagatctgga ggaataccgg tggcgaaggc ggccccctgg acaaagactg acgctcaggt 780

gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgt 840

cgatttggag gttgttccct tgaggagtgg cttccggagc taacgcgtta aatcgaccgc 900

ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg 960

tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc gaagaacctt acctactctt gacatccaga 1020

gaactttcca gagatggatt ggtgccttcg ggaactctga gacaggtgct gcatggctgt 1080

cgtcagctcg tgttgtgaaa tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttatcctt 1140

tgttgccagc ggtccggccg ggaactcaaa ggagactgcc agtgataaac tggaggaagg 1200

tggggatgac gtcaagtcat catggccctt acgagtaggg ctacacacgt gctacaatgg 1260

cgcatacaaa gagaagcgac ctcgcgagag caagcggacc tcataaagtg cgtcgtagtc 1320

cggattggag tctgcaactc gactccatga agtcggaatc gctagtaatc gtagatcaga 1380

atgctacggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg 1440

gttgcaaaag aagtaggtag cttaaccttc gggagggcgc ttaccacttt gtgattcatg 1500

actggggtga agtcgtaaca aggtaaccgt aggggaacct gcggttggat cacctcctta 1560

<210> 2

<211> 1544

<212> DNA

<213> 丛毛单胞菌(Comamonas sp.)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1544)

<400> 2

attgaacgct ggcggcatgc tttacacatg caagtcgaac ggtaacaggt cttcggatgc 60

tgacgagtgg cgaacgggtg agtaatacat cggaacgtgc ctagtagtgg gggataacta 120

ctcgaaagag tagctaatac cgcatgagat ctacggatga aagcagggga ccttcgggcc 180

ttgtgctact agagcggctg atggcagatt aggtagttgg tggggtaaag gcttaccaag 240

cctgcgatct gtagctggtc tgagaggacg accagccaca ctgggactga gacacggccc 300

agactcctac gggaggcagc agtggggaat tttggacaat gggcgaaagc ctgatccagc 360

aatgccgcgt gcaggatgaa ggccctcggg ttgtaaactg cttttgtacg gaacgaaaag 420

cctggggcta atatccccgg gtcatgacgg taccgtaaga ataagcaccg gctaactacg 480

tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag 540

cgtgcgcagg cggttttgta agacagtggt gaaatccccg ggctcaacct gggaactgcc 600

attgtgactg caaggctaga gtgcggcaga gggggatgga attccgcgtg tagcagtgaa 660

atgcgtagat atgcggagga acaccgatgg cgaaggcaat cccctgggcc tgcactgacg 720

ctcatgcacg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccctaa 780

acgatgtcaa ctggttgttg ggtcttaact gactcagtaa cgaagctaac gcgtgaagtt 840

gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg ggacccgcac 900

aagcggtgga tgatgtggtt taattcgatg caacgcgaaa aaccttaccc acctttgaca 960

tggcaggaac ttaccagaga tggtttggtg ctcgaaagag aacctgcaca caggtgctgc 1020

atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1080

ttgccattag ttgctacatt cagttgagca ctctaatggg actgccggtg acaaaccgga 1140

ggaaggtggg gatgacgtca agtcctcatg gcccttatag gtggggctac acacgtcata 1200

caatggctgg tacaaagggt tgccaacccg cgagggggag ctaatcccat aaagccagtc 1260

gtagtccgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtgg 1320

atcagaatgt cacggtgaat acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt cacaccatgg 1380

gagcgggtct cgccagaagt aggtagccta accgtaagga gggcgcttac cacggcgggg 1440

ttcgtgactg gggtgaagtc gtaacaaggt agccgtaaat cactagtgaa ttcgcggccg 1500

cctgcaggtc gaccatatgg gagagctccc aacgcgttca tacc 1544

Claims

1.一种分离的修复土壤镉污染的丛毛单胞菌A23(Comamonas sp.)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019148。

2.一种分离的修复土壤镉污染的肠杆菌A11(Enterbacter sp.)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019149。

3.如权利要求1或2所述的所述的丛毛单胞菌A23(Comamonas sp.)和肠杆菌A11(Enterbacter sp.)在制备高效固定镉的复合菌剂中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的应用还包括在修复土壤镉污染中的应用。