CN115216428B - 一种抗汞细菌及其在汞污染治理方面的应用 - Google Patents

一种抗汞细菌及其在汞污染治理方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗汞细菌及其在汞污染治理方面的应用，该抗汞细菌为肠杆菌属(Enterobacter sp.)的植物内生菌，将其命名为AN‑11，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:18740。该菌株具有能使Hg2+挥发和固定化的特性。一方面，通过挥发作用，该抗汞细菌可以降低土壤中以及植物内汞浓度；另一方面，通过固定(吸附/沉淀)作用，该抗汞细菌可以降低汞的生物有效性，减少植物对其吸收利用，从而达到土壤修复和植物修复的目的。本发明提供的抗汞细菌可用于治理汞污染土壤和作物安全生产的生物修复剂，具有广阔的应用前景。

Description

一种抗汞细菌及其在汞污染治理方面的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗汞细菌及其在汞污染治理方面的应用。
背景技术
汞(Hg)是一种剧毒的重金属，由于其在环境中的强迁移性和持久性，对人类健康和生态系统构成了严重威胁。汞土壤污染已导致严重的环境问题，并成为全球关注的焦点。具体来说，汞阳离子(Hg2+)作为土壤中的主要存在形式会损害肾脏和肺；有机汞形式，特别是甲基汞(MeHg)作为一种有效的神经毒素，随着人们摄入被其污染的农产品而被人体放大，可以导致脑功能受损。
在工业化过程中，人为来源释放出大量的汞，例如化石燃烧、水泥生产、黄金生产、采矿和冶炼生产以及氯碱工业等。汞释放的最终目的地主要是土壤。特别是1.6％的农田中的汞含量超过了国家标准限值，这对粮食的安全产生了负面影响。因此，制定可行的汞污染土壤修复策略势在必行。
目前治理土壤汞污染的方法中，除污染源控制外，还采用了物理、化学和生物方法来修复汞污染的土壤，主要包括“去除”和“固定”。去除技术是从受污染的土壤中去除汞，例如热脱附、土壤淋洗和植物吸收，不过这些方法不适合大规模、汞含量低含量的农田污染问题。至于固定化技术，许多固定剂作为土壤改良剂被用于通过调节土壤的pH值，来沉淀和吸附降低汞的生物利用度，从而降低农作物中Hg的积累。然而，在长期的农业活动中，仍应进行系统的评估，以确定外部修复对土壤健康和植物生长以及汞迁移的负面影响。
本领域技术人员希望开发一种新的修复和治理汞污染土壤的方法，从而实现对汞污染土壤的大规模、长期性的治理。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗汞细菌及其在汞污染治理方面的应用，该抗汞细菌为肠杆菌属的植物内生菌，其具有能使Hg2+挥发和固定化的特性。一方面，通过挥发作用，该抗汞细菌可以降低土壤中以及植物内汞浓度；另一方面，通过固定(吸附/沉淀)作用，该抗汞细菌可以降低汞的生物有效性，减少植物对其吸收利用，从而达到土壤修复和植物修复的目的。
为此，本发明的第一方面提供一种肠杆菌(Enterobacter sp.)AN-11，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址为中国北京，保藏编号为CGMCC NO:18740，保藏日期为2019年10月25日。
将所述肠杆菌AN-11进行16s rDNA基因测序以鉴定菌株，发现其与白色肠杆菌(Enterobacter asburiae)相似性为98.76％，与烟粉杆菌(Enterobacter tabaci)的相似性为98.76％。通过MEGA 5.0软件推断出肠杆菌AN-11的系统发育树，表明该菌株为肠杆菌属(Enterobacter sp.)。经鉴定，其表现出高Hg2+耐受性。
本发明的第二方面，提供一种肠杆菌培养物，所述肠杆菌为本发明第一方面所述的肠杆菌AN-11。
进一步，所述肠杆菌培养物的制备方法包括，对所述肠杆菌AN-11进行菌种活化，然后接种于培养基中，于28-37℃、有氧条件下进行培养。
进一步，所述菌种活化包括：取所述肠杆菌AN-11在固体培养基表面进行划线，以培养得到单菌落。
根据本发明的技术方案，可根据需要选用培养基的种类及培养时间。
在一些实施方式中，所述培养基为LB液体培养基或者LB固体培养基。
在一些实施方式中，所述培养时间为8-48h，例如8h、12h、24h、36h、48h等。
本发明的第三方面，提供所述肠杆菌AN-11在植物培养中的应用，所述植物生长于含汞的培养基质中，所述肠杆菌AN-11用于降低所述培养基质和/或所述植物中的汞浓度。
本发明的第四方面，提供所述肠杆菌AN-11在修复汞污染土壤中的应用。
本发明的第五方面，提供一种植物培养方法，其包括：用本发明第二方面所述的肠杆菌培养物处理所述植物的种子或根，得到经处理的植物；将所述经处理的植物栽种至培养基质中。
进一步，所述处理的方式为浸泡，所述浸泡的时间为1-5天，例如1天、2天、3天、4天、5天等。
进一步，所述培养基质含有汞离子。
进一步，所述培养基质中汞离子的含量小于等于22mg/L，例如所述培养基质中汞离子的含量为约5mg/L、8mg/L、10mg/L、12mg/L、15mg/L、20mg/L、22mg/L等。
进一步，所述植物为小麦或番茄。
本发明的第六方面，提供一种汞污染土壤的修复方法，其包括，向所述汞污染土壤施用本发明第一方面所述的肠杆菌AN-11和/或本发明第二方面所述的肠杆菌培养物。
进一步，向所述汞污染土壤施用所述肠杆菌AN-11的用量为105-107CFU/g，例如105CFU/g、5×105CFU/g、106CFU/g、5×106CFU/g、107CFU/g等。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明提供的菌株AN-11具有良好的抗汞性能，汞最小抑制浓度MIC为22.14mg/L。同时，该菌株对Hg2+具有挥发和吸附/沉淀作用，通过将Hg2+挥发为Hg0，可以达到直接降低土壤中或者溶液中汞浓度。通过吸附/沉淀Hg2+，可以达到固定化的作用，减少汞在土壤/水体中的迁移，降低生物有效性，从而降低了通过食物链进入人体的可能。
(2)本发明提供的菌株AN-11在土壤修复方面具有广阔前景。通过传统方法如物理、化学方法来降低土壤中汞污染，不仅价格昂贵、修复效果一般、实施比较困难，而且还容易产生二次污染，破坏土壤本身的生态系统结构。而通过微生物修复，不仅成本低、修复效果好，而且环境友好，可以作为原位修复的一种修复手段。
(3)本发明提供的菌株AN-11在植物修复方面具有广阔前景。实验结果表明，该菌株可以减少植物对重金属汞的吸收，同时可以促进植物生长。这表明该菌株可以应用于汞污染环境的安全作物生产。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1：肠杆菌AN-11的系统发育树；
图2：肠杆菌AN-11在LB培养基中培养48h后的汞抗性曲线；
图3：肠杆菌AN-11在初始汞浓度为4.4mg/L的LB培养基中进行摇瓶培养的实验结果；
图4：肠杆菌AN-11对小麦幼苗和番茄幼苗在含汞土壤中生长的修复作用的实验结果；
图5：肠杆菌AN-11对汞污染土壤的修复作用的实验结果。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1菌株筛选
收集样品：样品来自中国云南省安宁市废弃的氯碱工厂，取重金属废料堆中生长的番茄、油菜、大豆和辣椒的根。将样品保存在无菌塑料袋中，运送到实验室并保存在4℃下。剪一厘米左右根，洗净后用75％酒精消毒1min，再用次氯酸钠溶液消毒5min，放入灭菌后的研钵研磨，磨碎后用生理盐水冲洗，然后倒入离心管中，取上清液100μL稀释10倍后，在P2A培养基(培养基已经过120℃，灭菌30min)中涂布平板，在培养箱(30℃)中培养两天后，根据菌落形态分离不同菌株，划平板接种到P2A培养基上。培养三天后，选单独菌落再次接种在新的P2A培养基上，从而纯化出单个菌株。
把上述步骤中纯化好的不同菌株分别接种到含20mg/L和40mg/L Hg2+的LB培养基中，培养三天后观察培养基中菌落的生长状况，选出生长状况良好的菌株，划线进行分离纯化。
通过上述方法，筛选出一株耐汞细菌，命名为AN-11，对其16s rDNA基因序列的分析表明，AN-11与白色肠杆菌(Enterobacter asburiae)相似性为98.76％，与烟粉杆菌(Enterobacter tabaci)的相似性为98.76％。该菌株在系统发育树中的位置表明为肠杆菌属(Enterobacter sp.)。
实施例2汞抗性生长曲线实验
制备肠杆菌AN-11种子液，然后将其分别接种于下组的培养基中进行培养。实验组：配制含有梯度浓度(0-40mg/L)Hg2+(HgCl2)的LB培养基，用试管分别取5mL不同汞浓度的LB培养基，向其中加入0.25mL肠杆菌AN-11菌液。以接种了肠杆菌AN-11的无汞LB培养基作为阳性对照；以含汞的无菌LB培养基作为阴性对照。
随后，将所有试管置于摇床中(150rpm，28℃)培养。48小时后，使用分光光度计(UV-5500，Metash，上海，中国)在波长为600nm下确定每个试管中培养基的OD值。其中，无菌LB培养基用作分光光度计的调零校准物体。使用SigmaPlot软件分别计算导致肠杆菌AN-11生长完全停止的最小抑菌浓度(MIC)和导致肠杆菌AN-11生长降低50％的半抑菌浓度(EC50)，绘制得到汞抗性生长曲线，如图2所示。
根据图2的实验结果，可知本发明提供的菌株AN-11具有较好的耐汞性能，最小抑菌浓度MIC为22.14mg/L。
实施例3汞去除实验
本实施例通过摇瓶培养确定菌株AN-11从含汞的LB培养基中挥发以及沉淀/吸附Hg2+的能力。具体步骤如下：
实验组：摇瓶中配制100mL含4.4mg/L Hg2+的LB培养基，经静置一晚后，加入8％的肠杆菌AN-11培养液，使其OD600调整为0.6。阳性对照组：与实验组相比，培养基中不含Hg2+。阴性对照组：与实验组相比，不加入肠杆菌AN-11培养液。将各组的摇瓶在150rpm，28℃条件下进行培养。分别于开始培养后的0h，3h，6h，9h，12h，24h，48h取出13mL培养液进行检测，其中10mL培养液用于测量OD600，3mL培养液用于测量汞含量。其中测量汞含量的方法为：于1000rpm，4℃离心得到上清液和菌体沉淀，将上清液和洗过两次的菌体沉淀用超纯水适当稀释后测量汞含量，测量仪器为测汞仪(HGA-100，北京海光仪器有限公司，检测限：1-200ng)。汞含量测量结果如图3所示。
由图3可知，在摇瓶培养48h后，肠杆菌AN-11在LB培养基中对Hg2+的总去除率大于95％，其中73.63％的Hg2+通过挥发去除，22.64％的Hg2+通过吸附/沉淀去除。与在24小时内去除Hg2+相比，48小时内通过挥发去除的Hg2+增加到73.6％，而细菌菌体中的Hg2+下降到22.6％，这表明沉淀物中的Hg2+可以转运到细胞中，通过细胞的代谢转化成Hg0进行挥发。同时，在溶液中观察到了黑色沉淀。
此外，在没有接种肠杆菌AN-11的对照LB培养基中仅损失了少量的Hg2+(<5％)，这表明从溶液中去除汞主要是通过生物方法而非非生物方法。综上表明，本发明提供的肠杆菌AN-11具有挥发和吸附/沉淀Hg2+的能力，肠杆菌AN-11菌株可用于去除环境中汞污染或者降低固定Hg2+从而降低其迁移性。
实施例4对植物幼苗的修复实验
番茄或小麦作为一种生物指标，对汞胁迫敏感，可以有效反映汞的生物毒性。本实施例通过盆栽实验以评估在Hg2+暴露下，肠杆菌AN-11对小麦幼苗和番茄幼苗的影响。根据本实施例的实验结果，表明肠杆菌AN-11能够降低植物对汞的吸收作用，其对于生长在汞污染环境中的植物具有明显修复作用。实验的具体步骤如下：
将小麦种子在培养皿中预先浸泡的高压灭菌滤纸上发芽后，选择均匀生长的幼苗按照12株/组随机分组处理：实验组：用肠杆菌AN-11培养液浸泡幼苗3天，然后将幼苗移植到装有含20mg/L Hg2+(HgCl2)的高压灭菌石英砂的无菌容器中；对照组1：用无菌水浸泡幼苗3天，然后将幼苗移植到装有高压灭菌石英砂(不含汞)的无菌容器中；对照组2：用无菌水浸泡幼苗3天，然后将幼苗移植到装有含20mg/L Hg2+(HgCl2)的高压灭菌石英砂的无菌容器中。每组设置三个重复。
番茄播种实验的处理方法与小麦种子类似，区别在于将高压灭菌石英砂替换为高压灭菌石土壤。
将上述实验盆栽放入培养室，小麦种子培养50天，番茄种子培养15天。每周为植物提供Hoagland溶液以补偿营养不足，并添加超纯水以保持水分含量。随后，收获植物样品用于后续分析。
分别测量收获得到的小麦幼苗的株高、根长、鲜重和根重，番茄幼苗的株高、根长、干重和根重。测量结果如表1-2所示。将收获的小麦和番茄幼苗洗净，分成地上部分(幼苗shoot)和地下部分(根root)，然后在-20℃冷冻8小时，真空干燥12小时。将地上部分和地下部分的样品分别在95℃水浴中，用HNO3/H2SO4混合物(v/v＝4：1)消解3小时。然后使用测汞仪(HGA-100)测量消解溶液中的汞含量，测量结果如图4所示。
表1番茄幼苗在汞胁迫下的生长参数
组别 根长(cm) 株高(cm) 干重(g) 根重(g)
对照组1 20.30±0.78a 8.73±1.19ab 0.22±0.013ab 0.11±0.01a
对照组2 14.45±0.35b 8.50±0.26bc 0.17±0.008bc 0.077±0.0019b
实验组 19.23±1.34a 8.03±1.10c 0.19±0.038c 0.053±0.0036c
表2小麦幼苗在汞胁迫下的生长参数
组别 根长(cm) 株高(cm) 鲜重(g) 根重(g)
对照组1 20.30±3.10a 27.80±0.70a 0.42±0.04a 0.060±0.008a
对照组2 3.55±0.21b 15.45±3.29c 0.09±0.02b 0.007±0.0011c
实验组 5.65±0.38b 20.33±1.42b 0.19±0.02c 0.022±0.0013b
通过表1表2可知，整体来讲，通过对比对照组1和对照组2，表明在未经肠杆菌AN-11处理的情况下，添加Hg2+明显抑制了植物的生长。对于番茄幼苗，经肠杆菌AN-11培养液处理后，幼苗根长和干重与对照组2相比具有显著差异；对于小麦幼苗，经肠杆菌AN-11培养液处理后，幼苗各生长参数与对照组2相比都有显著差异。上述结果表明，在汞胁迫条件下，经肠杆菌AN-11培养液处理后的小麦和番茄幼苗的生长情况比未经处理的更好，肠杆菌AN-11对植物在汞胁迫条件下的生长具有明显促进作用。
根据图4所示的结果，表明经肠杆菌AN-11培养液处理能降低植物对汞的吸收，从而表明可以将肠杆菌AN-11应用于汞污染土壤的安全作物生产。
实施例5对汞污染土壤的修复实验
实验组：取肠杆菌AN-11，经划平板纯化后挑取单菌落接种于LB液体培养基，培养18h后，用离心管取出培养液在1000rpm、4℃条件下离心，将菌体用超纯水清洗三次后，再加入超纯水调整OD600＝1(即107CFU/mL)。将20mL调整好OD值的菌液混合均匀后匀速倒入盛有200g含汞土壤的聚丙烯容器中，并保证含水率为35％。同时设置不加入菌液的对照组。将实验组和对照组放入恒温箱中培养，放置20天后测量土壤中的汞含量，测量结果如图5所示。
根据图5所示结果，利用肠杆菌AN-11修复土壤20天后，添加有肠杆菌AN-11的汞污染土壤相比于对照土壤，其汞含量降低了42.07％，表明本发明提供的肠杆菌AN-11在修复汞污染土壤方面具有显著的效果，可以通过进一步扩大施用面积来进行原位土壤修复。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1. 肠杆菌AN-11在植物培养中的应用，其特征在于，所述植物生长于含汞的培养基质中，所述植物为小麦或番茄；所述肠杆菌AN-11用于降低所述植物中的汞浓度；所述肠杆菌AN-11的分类命名为Enterobacter sp.，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO: 18740，保藏日期为2019年10月25日。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物培养的方法包括用肠杆菌AN-11的培养物处理所述植物的种子或根，得到经处理的植物；将所述经处理的植物栽种至含有汞离子的培养基质中。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肠杆菌AN-11的培养物的制备方法包括，对所述肠杆菌AN-11进行菌种活化，然后接种于培养基中，于28-37℃、有氧条件下进行培养。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述培养基为LB液体培养基或者LB固体培养基。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述培养的时间为8-48h。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述处理的方式为浸泡，所述浸泡的时间为1-5天。
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