CN111560319B - 一株稻田固氮蓝藻及其在降低镉对水稻毒害方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株稻田固氮蓝藻及其在降低镉对水稻毒害方面的应用。该蓝藻的名称为多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)SCAU‑G01，保藏编号为CCTCC NO：M 2020056，保藏日期为2020年3月24日，保藏单位为位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。该菌株能够在镉含量为1mg/L的BG11₀培养液中快速生长，能显著促进水稻幼苗的生长以及降低水稻幼苗地上部的镉累积，提高水稻产量，并能大幅降低在镉污染土壤中种植的水稻的糙米镉含量。

Description

一株稻田固氮蓝藻及其在降低镉对水稻毒害方面的应用

技术领域

本发明涉及重金属污染微生物钝化剂应用领域，特别涉及一株稻田固氮蓝藻及其在降低镉对水稻毒害方面的应用。

背景技术

人类的活动造成了镉，铅，锌等重金属不断向环境中释放，并在土壤中累积。人类从农产品直接或间接地获取重金属并在人体内累积，对人体产生危害。我国耕地土壤点位超标率为19.4％，其中轻微、轻度、中度和重度污染点位比例分别为13.7％、2.8％、1.8％和1.1％，主要污染物为镉、镍、铜、砷、汞、铅、滴滴涕和多环芳烃，尤其土壤镉污染涉及面广，形势严峻，是我国稻米超标的主要原因。在污染的农田中，中轻度污染具有生产价值但存在较大污染风险，如何在利用污染土地的同时降低其污染风险显得尤为重要。镉进入土壤后，由于土壤的固定作用很难消除。常用的污染土壤利用方法中，用物理，化学防治法进行污染物的去除或降低其生物有效性的费用较高且易产生二次污染。添加土壤钝化剂等易造成土壤的理化性质及土壤微生物群落的变化。植物修复技术因原位修复且环境友好备受关注，但现有高富集植物通常生长缓慢，植株矮小，地上部生物量小，且通过间套作模式容易使高富集植物与作物产生营养竞争。

蓝藻是一个非常大的类群，既有单细胞的也有多细胞丝状的，既有固氮的也有不固氮的。固氮蓝藻是一类具有固氮能力的藻类，死亡的固氮蓝藻能够为土壤提供氮素和有机质，改善水稻的生长环境，从而具有促进水稻生产的效果。但是，土壤中重金属的污染会对固氮蓝藻的生长状态造成一定影响。另外，有的研究结果表明固氮蓝藻具有一定的吸附重金属镉的能力，但由于微生物活动机制复杂，微生物和植物共培养时，重金属镉很可能在微生物代谢作用的影响下反而有利于植物对重金属镉的吸收利用。因此，在利用固氮蓝藻对水稻促产时，需要考虑水稻籽实重金属含量是否在安全食用范围。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株稻田固氮蓝藻。该稻田固氮蓝藻在对水稻促产时，能有效降低水稻籽实重金属镉含量。

本发明的另一目的在于提供上述稻田固氮蓝藻的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一株耐镉固氮蓝藻，名称为多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)SCAU-G01，保藏编号为CCTCC NO：M 2020056，保藏日期为2020年3月24日，保藏单位为位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。

所述的稻田固氮蓝藻在降低镉对水稻毒害方面的应用，优选包含如下步骤：往稻田中施加所述的稻田固氮蓝藻。该稻田固氮蓝藻不仅能降低镉对水稻毒害，促进水稻的生长，并且大幅降低糙米镉含量。

所述的施加的时机是环境条件有利于所述的稻田固氮蓝藻存活；优选为温度是25～30℃、阳光充足、放藻后5天内没有大雨的环境条件，或温度低于15℃的环境条件。

所述的稻田固氮蓝藻在放入稻田时的状态优选为生长到对数生长期的藻(培养14d，OD₆₈₀高于1)，长势良好。

所述的稻田固氮蓝藻优选通过如下步骤培养得到：

(1)在无菌条件下将所述的稻田固氮蓝藻培养到对数生长期，得到藻种液；

(2)将步骤(1)得到的藻液接种到无菌的液体培养基中，自然环境下培养，得到稻田固氮蓝藻藻液。

步骤(1)中所述的培养优选为于25～30℃、光照2500～3500lx、光暗时间为14～18h：6～10h进行培养；更优选为于28℃、光照3000lx、光暗时间为16h:8h进行培养。

步骤(1)中所述的培养所用到的培养基优选为BG11₀液体培养基；

BG11₀液体培养基的组成如下：K₂HPO₄.3H₂O 0.04g/L、MgSO₄.7H₂O 0.075g/L、CaCl₂.2H₂O 0.036g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L、EDTA0.001 g/L、Na₂CO₃0.02g/L、微量元素A₅ 1mL；

微量元素A₅的组成如下：H₃BO₃ 2.860g/L、NaMoO₄.2H₂O 0.021g/L、ZnSO₄.7H₂O0.222g/L、CuSO₄.5H₂O 0.079g/L、MnCl₂.4H₂O 1.810g/L、NiSO₄.6H₂O 0.479g/L。

步骤(2)中所述的接种中藻种液的加入量优选按培养液体积的5％计算。

步骤(2)中所述的培养基优选为不含硝酸钠的BG11液体培养基(BG11₀)。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明通过分离纯化筛选得到一株耐镉的稻田固氮蓝藻，可以在水稻田作为生物肥料提高水稻产量的同时作为生物钝化剂降低水稻糙米中的镉含量。

附图说明

图1是固氮蓝藻在镉含量为1mg/L的培养液中培养4天后的照片图。

图2是固氮蓝藻在镉含量为1mg/L的培养液中培养4天的生长曲线图(A)和培养液镉含量变化图(B)。

图3固氮蓝藻降低水稻镉积累的实验收获照片图，从左至右分别为CK、SCAU-G01、SCAU-13、SCAU-22和SCAU-26。

图4是华南农业大学生态农场固氮蓝藻-水稻共培养实验的照片图。

图5是固氮蓝藻降低水稻糙米镉积累实验照片图。盆栽从左至右分别为CK、SCAU-G01和SCAU-26。

图6为SCAU-G01在光学显微镜下放大1000倍(油镜)的照片图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：固氮蓝藻藻株的分离纯化

(1)藻种分离纯化

藻种的分离和纯化：取广东和海南等地稻田和湿地土壤样品按1g加入20mL BG11₀液体培养基中，在光照培养箱中温度28℃、光照3000lx、光暗时间为16h:8h预培养7天。然后取上层含藻的清液，涂布于直径9cm含BG11₀固体培养基的平皿上。待长出肉眼可见的菌落后，小心挑出重新划平板，镜检，此过程重复3次以上以获得单种培养的固氮蓝藻。

然后再经紫外线照射和多种抗生素联合处理得到无菌藻株。具体方法为：将分离培养得的固氮蓝藻藻液的OD₆₈₀调至0.05左右的藻液20μL小心涂布在石英比色皿内壁上，在波长254nm的紫外灯下距离20cm照射10分钟。处理后用40μL的BG11₀培养基将藻细胞冲洗下来后涂布于含BG11₀培养基的琼脂固体平板上。待长出肉眼可见菌落后，挑出置于含20mL的无菌BG11₀液体培养基的50mL玻璃三角瓶中培养至对数生长期(OD₆₈₀约为1)。取对数生长期藻液1mL，置于含19mL的无菌BG11₀液体培养基的50mL玻璃三角瓶中，加入经过滤灭菌的青霉素溶液使培养体系中最终青霉素浓度为10mg/L。培养处理3天后，离心取藻细胞，用无菌BG11₀培养基冲洗离心，再次悬浮于20mL的无菌BG11₀液体培养基中。按上述青霉素的处理方法再用庆大霉素和卡那霉素依次处理后(两者的最终浓度均为1mg/L)，离心，无菌BG11₀培养基冲洗，最终悬浮于BG11₀培养基即得到无菌藻细胞。

BG11₀培养基的配方如下所示：

表1 BG11₀培养基药品清单

表2微量元素A₅清单

按上述方法分离纯化获得8株藻，分别进行测序，依据16rDNA序列比对，分别鉴定为如下藻株：SCAU-02(Nostocpiscinale)、SCAU-04(Nostoc sp.)、SCAU-05(Nostoc sp.)、SCAU-G01(Anabaena variabilis)、SCAU-13(Nostoc sp.)、SCAU-15(Anabaenavariabilis)、SCAU-22(Nostocpiscinale)和SCAU-26(Anabaena variabillis)

(2)固氮蓝藻的筛选

将固氮蓝藻扩培至对数生长期后，测量OD₆₈₀值，转移部分固氮蓝藻至装有20ml镉含量为1mg/L的BG11₀的50mL玻璃三角瓶中，使培养液初始OD₆₈₀值为0.1，在温度28℃、光照3000lx、光暗时长为16h:8h光照培养箱中培养4天，测量其OD₆₈₀值。

用于筛选的藻株除上述分离纯化的8株藻以外，还包括从中国科学院淡水藻种库(FACHB)购买的6株丝状固氮蓝藻：FACHB-85(Nostoc sp.)、FACHB-89(Nostocpaludosum)、FACHB-113(Anabaena variabilis)、FACHB-119(Anabaena azotica)、FACHB-131(Nostocsp.)、FACHB-168(Calothrix sp.)。

筛选结果如图1和表3所示。

表3固氮蓝藻筛选结果

按照最终OD值大小，筛选到在1mg/L镉处理条件下生长最好的4株固氮蓝藻，分别为SCAU-G01、SCAU-13、SCAU-22和SCAU-26，进行下一步检测。

(3)固氮蓝藻的镉耐受性和去除能力评估

将筛选到的四株固氮蓝藻进行检测。

取对数生长期藻液1mL，置于含19mL的BG11₀液体培养基的50mL玻璃三角瓶中，加入1000mg/L的镉母液20μL，使培养液最终镉含量为1mg/L，封口后放置在温度28℃、光照3000lx、光暗时长为16h:8h的光照培养箱中培养。4天后测定OD₆₈₀值，抽滤后测定溶液镉含量，以不加固氮蓝藻为对照，处理和对照各三个重复。评估了固氮蓝藻对镉的耐受性，结果见图2。

结果表明四种固氮蓝藻在镉含量为1mg/L的培养液中均能够生长，并显著降低培养液中的镉含量。

(4)固氮蓝藻降低水稻幼苗镉积累评估

用于接种的固氮蓝藻藻液的制备过程如下：在实验室无菌条件下，将生长到对数生长期的固氮蓝藻母液按5％的比例接种到BG11₀液体培养基中，于温度28℃、光照3000lx、光暗时间为16h:8h的光照培养箱中进行培养，培养至对数生长期再转接到培养基中扩大培养，从20mL培养放大到1L水平，培养14d的藻即可用于实验。

在1L的盆栽杯中装入700g从华南农业大学校内农场水稻填的土壤(人工添加镉使其最终总镉含量为8mg/kg，老化3周)，将生长至三叶一心的黄华占(种子购自隆平高科)水稻幼苗移栽入盆，每盆三株水稻苗。同时接入上述固氮蓝藻1g(湿重)，加入蒸馏水使水高出土壤表面2cm。以不加藻处理为对照，整个杯子用黑色塑料袋包裹以防止藻污染。瓶口封上保鲜膜后在恒温培养箱(昼/夜温度：28.5℃/25℃，湿度75％，水稻苗位置光照16000lx左右，光暗比：16h:8h)中培养。处理30天后，测量水稻幼苗生长参数和镉含量，结果如图3和表4所示。

表4耐镉固氮蓝藻处理对水稻幼苗生长和镉含量的影响

注：数据为3次重复的平均值±标准差，表中同列不同小写字母表示在0.05水平差异显著

从实验结果看，在4株藻中，降低水稻幼苗地上部镉含量最有效的是SCAU-G01。

实施例2：固氮蓝藻对水稻产量的影响

固氮蓝藻的扩大培养方法如下：在实验室无菌条件下，用BG11₀液体培养基于温度28℃、光照3000lx、光暗时间为16h:8h的光照培养箱中进行培养，从20mL培养放大到1L水平，培养14d的藻直接用于施加水泥池。

实验设计：于2019年4月-8月在华南农业大学生态农场水泥池开展实验。试验设2个处理，水泥池实验每个小区为1m*1m(长*宽)，每个处理3个重复。水稻品种为黄华占，在育苗长至三叶一心时进行移栽，每个水泥池等距移栽16株水稻，株距和行距均为20cm。在移栽后第3天加入上述培养好的固氮蓝藻。

每个水泥池均施加复合肥22.5g(含15％N、15％P₂O₅和15％K₂O)作为基肥，在分蘖期再追施尿素22.5g。

处理1：不施加固氮蓝藻对照CK。

处理2：施加固氮蓝藻SCAU-G01，每个池6g湿藻。

处理3：施加固氮蓝藻SCAU-13，每个池6g湿藻。

处理4：施加固氮蓝藻SCAU-22，每个池6g湿藻。

处理5：施加固氮蓝藻SCAU-26，每个池6g湿藻。

等水稻成熟后取样进行产量因子测定，计算理论产量。实验现场如图4所示，数据如表5所示。

表5固氮蓝藻处理对水稻产量的影响

注：数据为3次重复的平均值±标准差，表中同列不同小写字母表示在0.05水平差异显著

结果表明在相同的施肥条件下，在四株藻中藻株SCAU-G01处理的水稻理论产量最高，相比对照提高约27％。

实施例3：镉污染土壤盆栽实验

试验设计：在5L的塑料盆中加入4kg镉含量为6.2mg/kg的水稻土，土壤来自清远电子厂镉污染水稻田，风干过2mm筛，每盆施加复合肥2g(含15％N、15％P₂O₅和15％K₂O)作为基肥，在分蘖期和灌浆期再各追施尿素1g作为追肥。将生长至三叶一心的水稻移栽到盆中，每盆1株，加入适量蒸馏水使水高出土壤表面2cm左右。每个处理三个重复。

处理一：不施加固氮蓝藻并在表面覆盖一层锡箔纸以防藻类生长。

处理二：分别在水稻移栽当天及分蘖期在水稻根部施加固氮蓝藻SCAU-G01各1次，每次0.5g湿藻。用于接种的藻培养方式同实施例2。

实验结果如图5和表6所示。

表6盆栽实验施加固氮蓝藻对水稻镉含量(mg/kg)的影响

注：数据为3次重复的平均值±标准差，表中*表示同列中两个处理间在0.05水平差异显著

实验结果表明，固氮蓝藻SCAU-G01处理能够降低水稻糙米镉含量，降幅达85.3％。

实施例4：藻种保藏

藻株SCAU-G01分离自海南省白沙县卫星农场15队水稻田土壤。藻株形态如图6所示，为具有异形胞的丝状固氮蓝藻，其16SrRNA序列如下：

CGTGTACTGCTTACCATGCAGTCGAACGGAATCTTCGGATTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGAATCTAGCTTCAGGTCGGGGACAACCACTGGAAACGGTGGCTAATACCGGATGTGCCGAAAGGTGAAAGATTTATTGCCTGAAGATGAGCTCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGTGGTAAGAGCGCACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGGAGGAAGGCTTTTGGGTTGTAAACCTCTTTTCTCAGGGAATAAGAAAGTGAAGGTACCTGAGGAATAAGCATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATGCAAGCGTTATCCGGAATGATTGGGCGTAAAGCGTCCGCAGGTGGCACTGTAAGTCTGCTGTTAAAGAGCAAGGCTCAACCTTGTAAAGGCAGTGGAAACTACAGAGCTAGAGTACGTTCGGGGCAGAGGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAAGAACACCGGTGGCGAAAGCGCTCTGCTAGGCCGTAACTGACACTGAGGGACGAAAGCTAGGGGAGCGAATGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGATACTAGGCGTGGCTTGTATCGACCCGAGCCGTGCCGGAGCCAACGCGTTAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGCACGCAAGTGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGACTTGACATGTCGCGAATCTTCTTGAAAGGGAAGAGTGCCTTAGGGAGCGCGAACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTTTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCAGCATGCCCCTTACGTCTTGGGCTACACACGTACTACAATGCTACGGACAGAGGGCAGCAAGCTAGCGATAGCAAGCAAATCCCGTAAACCGTAGCTCAGTTCAGATCGCAGGCTGCAACTCGCCTGCGTGAAGGAGGAATCGCTAGTAATTGCAGGTCAGCATACTGCAGTGAATTCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGCTGGCAACGCCCGAAGTCATTACTCCAACCATTCGTGGGGGAGGAGCCCAAGGCGGACG。

通过BLAST分析表明，藻株与已知的Trichormus(Anabaena)variabilis 0441(登录号CP047242.1)序列同源性极高，达99.2％。因此，将藻株SCAU-G01命名为多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)SCAU-G01。该藻株保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020056，保藏日期为2020年3月24日。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一株稻田固氮蓝藻及其在降低镉对水稻毒害方面的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1383

<212> DNA

<213> 多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)

<220>

<223> 16SrDNA

<400> 1

cgtgtactgc ttaccatgca gtcgaacgga atcttcggat ttagtggcgg acgggtgagt 60

aacgcgtgag aatctagctt caggtcgggg acaaccactg gaaacggtgg ctaataccgg 120

atgtgccgaa aggtgaaaga tttattgcct gaagatgagc tcgcgtctga ttagctagtt 180

ggtgtggtaa gagcgcacca aggcgacgat cagtagctgg tctgagagga tgatcagcca 240

cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga attttccgca 300

atgggcgaaa gcctgacgga gcaataccgc gtgagggagg aaggcttttg ggttgtaaac 360

ctcttttctc agggaataag aaagtgaagg tacctgagga ataagcatcg gctaactccg 420

tgccagcagc cgcggtaata cggaggatgc aagcgttatc cggaatgatt gggcgtaaag 480

cgtccgcagg tggcactgta agtctgctgt taaagagcaa ggctcaacct tgtaaaggca 540

gtggaaacta cagagctaga gtacgttcgg ggcagaggga attcctggtg tagcggtgaa 600

atgcgtagag atcaggaaga acaccggtgg cgaaagcgct ctgctaggcc gtaactgaca 660

ctgagggacg aaagctaggg gagcgaatgg gattagatac cccagtagtc ctagccgtaa 720

acgatggata ctaggcgtgg cttgtatcga cccgagccgt gccggagcca acgcgttaag 780

tatcccgcct ggggagtacg cacgcaagtg tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 840

acaagcggtg gagtatgtgg tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac caagacttga 900

catgtcgcga atcttcttga aagggaagag tgccttaggg agcgcgaaca caggtggtgc 960

atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1020

tcgtttttag ttgccagcat taagttgggc actctagaga gactgccggt gacaaaccgg 1080

aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcagcat gccccttacg tcttgggcta cacacgtact 1140

acaatgctac ggacagaggg cagcaagcta gcgatagcaa gcaaatcccg taaaccgtag 1200

ctcagttcag atcgcaggct gcaactcgcc tgcgtgaagg aggaatcgct agtaattgca 1260

ggtcagcata ctgcagtgaa ttcgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg 1320

gaagctggca acgcccgaag tcattactcc aaccattcgt gggggaggag cccaaggcgg 1380

acg 1383

Claims (9)

1.一株稻田固氮蓝藻，其特征在于：名称为多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)SCAU-G01，保藏编号为CCTCC NO：M 2020056，保藏日期为2020年3月24日，保藏单位为位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。

2.权利要求1所述稻田固氮蓝藻在降低镉对水稻毒害方面的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于包含如下步骤：往稻田中施加所述的稻田固氮蓝藻。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于包含如下步骤：所述的施加的时机为温度是25～30℃、阳光充足、放藻后5天内没有大雨的环境条件，或温度低于15℃的环境条件。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的稻田固氮蓝藻在放入稻田时的状态为处于对数生长期。

6.根据权利要求3～5任一项所述的应用，其特征在于：所述的稻田固氮蓝藻通过如下步骤培养得到：

(1)在无菌条件下将所述的稻田固氮蓝藻培养到对数生长期，得到藻种液；

(2)将步骤(1)得到的藻种液接种到灭菌的培养基中，自然环境下培养，得到稻田固氮蓝藻藻液。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

步骤(1)中所述的培养为于25～30℃、光照2500～3500lx、光暗时间为14～18h：6～10h进行培养；

步骤(1)中所述的培养所用到的培养基为BG11₀液体培养基；

BG11₀液体培养基的组成如下：K₂HPO₄.3H₂O 0.04g/L、MgSO₄.7H₂O 0.075g/L、CaCl₂.2H₂O0.036g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L、EDTA0.001 g/L、Na₂CO₃ 0.02g/L、微量元素A₅ 1mL；

微量元素A₅的组成如下：H₃BO₃ 2.860g/L、NaMoO₄.2H₂O 0.021g/L、ZnSO₄.7H₂O 0.222g/L、CuSO₄.5H₂O 0.079g/L、MnCl₂.4H₂O 1.810g/L、NiSO₄.6H₂O0.479g/L。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：步骤(1)中所述的培养为于28℃、光照3000lx、光暗时间为16h:8h进行培养。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

步骤(2)中所述的接种中藻种液的加入量按培养基体积的5％计算；

步骤(2)中所述的培养基为BG11₀液体培养基。

Images