CN104531585B - 一种戴尔福特菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种戴尔福特菌及其应用。该戴尔福特菌命名为戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)12#,保藏编号为CCTCC No:M2014389。所述应用包括该菌株在制备重金属吸附剂中的应用、在回收水体或吸附土壤中的重金属中的应用、在修复重金属污染水体或重金属污染土壤中的应用。本发明的戴尔福特菌能够高度耐受三种以上重金属,能够作为或用于制备重金属吸附剂以修复多种重金属污染土壤或水体,同时也为构建高度重金属污染土壤修复工程菌提供了一个十分有效的宿主。
Description
技术领域
本发明属于微生物种质资源领域,具体涉及一种戴尔福特菌及其应用。
背景技术
近年来,随着工农业生产的快速发展,环境中重金属污染日趋严重,土壤及水体重金属污染已成为全球关注的环境问题之一。农业部调查结果显示,我国遭受重金属污染的土地面积占污水灌区总面积的64.8%。重金属是土壤环境中最常见的污染物,它们通过多种途径进入土壤并在其中累积,不断退化土壤肥力,降低作物产量与品质,同时恶化水体环境,并通过食物链危及人类的生命安全和身体健康。近几年,我国特大重金属污染事件层出不穷,影响比较大的主要有:2005年广东北江、2006年湘江湖南株洲段、2009年湖南省浏阳市和2012年广西龙江等均遭受较为严重的镉污染,其中以广西龙江的镉污染事件最为突出,几乎波及到龙江下游约300公里的河段,镉含量更是超过《地表水环境质量标准》Ⅲ类标准约80倍,在国内尚属首例。因此,重金属污染土壤及水体的治理,成为当今农业可持续发展和环境质量改善中诸多学科研究的难点和热点,相关应用性研究多集中于重金属污染的来源、预防及治理措施和环境修复等方面。
针对重金属污染土壤及水体的修复,以往的研究主要集中在化学修复和生物修复方面,随着微生物污染生态研究的不断深入以及研究方法的改进,采用微生物学指标评价重金属污染以及利用微生物修复重金属污染越来越受到人们的关注。微生物具有种类繁多、分布广、表面积巨大、带电荷、繁殖快和代谢旺盛等特点,在重金属污染的环境中,细菌又可通过对重金属的吸附富集、氧化还原、成矿沉淀、淋滤等作用修复环境中的重金属污染。金属污染的微生物修复具有费用低且能够处理低浓度污染或大面积污染等方面的独特优势,具有良好的生态效益和应用前景。
土壤中微生物种类丰富,从受重金属污染的土壤中分离到的微生物因受到重金属的胁迫,很可能对重金属有较好的耐受性,同时对重金属具有高效的吸附能力,因此具有成为高效重金属吸附剂的潜力,在重金属污染水体中重金属的去除具有新的应用前景,从而充分发挥耐重金属微生物的净化功能,使微生物修复发挥更大的作用。
戴尔福特(代尔夫特)菌属是1999年建立的一个新菌属,属于变形菌β亚纲、丛毛单胞菌科,广泛分布于自然界,如河水、沟渠水、土壤等环境。迄今为止,戴尔福特菌属由食酸戴尔福特菌属和Delftia tsuruhatesis两个菌种组成。Delftia tsuruhatesis是2003年日本学者Shigematsu等分离于熊本地区Tsuruhata活性污泥的1株(T7T株)苯二甲酸盐吸收细菌,16S rRNA序列分析表明该菌属于戴尔福特菌属。但因其与已知的食酸戴尔特菌表型和遗传特性有明显差异,故认为是该属的一个新菌种,建议命名为D.tsuruhatensis,模式株为T7T(=IFO16741T=ATCCBAA-554T)。
目前,关于戴尔福特菌的应用主要集中在苯胺类、微囊藻毒素生物降解方面的研究,也有将其应用到甲磺隆、丁草胺、有机磷类农药等各种农药的降解研究中。有少量报道将其应用在重金属铅、锌、硒、砷等污染修复的研究中(参见文献:Dorian A.Bautista-Hernández1,Landy I.Ramírez-Burgos2,Enrique Duran-Páramo3,Luis Fernández-Linares.Zinc and Lead Biosorption by Delftia tsuruhatensis:A Bacterial StrainResistant to Metals Isolated from Mine Tailings.Journal of Water Resource andProtection,2012,4,207-216.;Dhan Prakash,Janmejay Pandey,B.N.Tiwary,RakeshK.Jain.Physiological adaptations and tolerance towards higher concentrationof selenite(Se+4)in Enterobacter sp.AR-4,Bacillus sp.AR-6and Delftiatsuruhatensis AR-7.Extremophiles(2010)14:261–272.;砷污染土壤中砷氧化菌的筛选。刘玲。广西工业大学硕士学位论文,2007.)
目前报道的抗重金属的微生物很多(包括细菌和真菌),但大多都只偏向于高抗一种或两种重金属,对于同时抗三种及以上重金属的菌株报道较少;能够同时抗多种重金属的戴尔福特菌更是少见。
发明内容
本发明提供了一种戴尔福特菌,该戴尔福特菌能同时抗三种及以上重金属。
一种戴尔福特菌,分类命名为戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis),株号为12#,已于2014年8月22日保藏于位于中国武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC No:M2014389。
该戴尔福特菌是用含有1000mg/L Cd2+的筛选培养基,从农药厂沉淀池底层活性淤泥中筛选获得的。在牛肉膏蛋白胨固体培养基上,该菌株的菌落圆形,呈乳白色,黏稠,表面光滑、边缘整齐,菌落隆起,不透明;在pH 5.0-9.0范围内均可生长,最适生长pH为7.0;在10-40℃之间均能生长,最适生长温度为37℃;16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
本发明的戴尔福特菌可以在常规的细菌培养基中生长,如牛肉膏蛋白胨培养基、LB培养基。对该菌株的生理生化指标进行测定,发现其脂肪酶(吐温80水解)、精氨酸双水解酶、接触酶和氧化酶均阳性,不水解淀粉,不液化明胶,具有还原硝酸盐的能力;可利用乙酰胺、柠檬酸盐、甘露醇、果糖作为能量和碳源,但不利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖、麦芽糖、鼠李糖、蜜二糖、纤维二糖、丙二酸盐等。
因此,本发明还提供了一种所述戴尔福特菌的生长培养基,该生长培养基包括碳源,所述碳源为乙酰胺、柠檬酸盐、甘露醇和果糖中的至少一种。
本发明还提供了所述戴尔福特菌在制备重金属吸附剂中的应用。其中,所述重金属是指铅、锰、锌和镉中的至少一种。试验发现,所述戴尔福特菌对镉的富集量达到103.3mg/g,富集率达62%;对锰、锌、铅的吸附量也在100mg/g以上,其中对铅的吸附量达到132.6mg/g,对铅的吸附率达到90.2%。
除铅、锰、锌和镉之外,所述戴尔福特菌对铬、砷、铜也具有一定的吸附性能。
本发明还提供了一种重金属吸附剂,该重金属吸附剂的活性成分即为所述戴尔福特菌。
作为优选,所述戴尔福特菌的浓度为1.0×108~1010CFU/mL。
基于该戴尔福特菌对重金属优异的吸附性能,本发明还提供了所述戴尔福特菌在回收水体或吸附土壤中的重金属中的应用;提供了所述戴尔福特菌在修复重金属污染水体或重金属污染土壤中的应用。
作为优选,所述重金属是指铅、锰、锌和镉中的至少一种。
所述应用包括:将戴尔福特菌菌液投加到重金属污染水体或重金属污染土壤中。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明的戴尔福特菌能够高度耐受多种重金属,其中对镉的富集量达到103.3mg/g,富集率达62%;对锰、锌、铅的吸附量也在100mg/g以上,其中对铅的吸附量达到132.6mg/g,对铅的吸附率达到90.2%;能够作为或用于制备重金属吸附剂以修复多种重金属污染土壤或水体,同时也为构建高度重金属污染土壤修复工程菌提供了一个十分有效的宿主。
附图说明
图1为本发明戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)12#的扫描电镜观察结果;
图2为本发明戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)12#的系统发育树。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
实施例1具有镉抗性的戴尔福特菌株的筛选
(1)牛肉膏蛋白胨固体培养基配方(液体培养基不加琼脂):
牛肉膏3g/L,蛋白胨10g/L,NaCl 5g/L,琼脂20g/L,pH 7.2。
(2)耐镉菌株的筛选分离步骤:
取农药厂沉淀池底层活性淤泥样品5g溶于45mL无菌水中,150rpm下振荡2h后静置5min,取上清液1mL,制备10-1~10-4稀释度的菌悬液;从每个浓度梯度的菌悬液中吸取0.1mL分别涂布在含镉浓度为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000mg/L的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上,涂布均匀,于37℃培养箱中倒置培养1d。
根据不同镉浓度及不同稀释梯度平板上细菌生长情况,选取1000mg/L镉浓度的平板培养基上生长的菌落进行划线纯化,观察菌落生长情况,获得纯培养后保存于-80℃冰箱中,备用。
(3)菌株鉴定:
①菌落形态观察
配制牛肉膏蛋白胨固体培养基,灭菌;待平板培养基冷却后将菌株划线接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基上,于37℃培养箱中倒置培养1d后,观察其菌落形态。
观察结果:菌落圆形,呈乳白色,黏稠,表面光滑、边缘整齐,菌落隆起,不透明。
②显微结构观察
将菌活化后接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中,于37℃,150rpm摇床培养24h,取菌液滴在盖玻片上,干燥后,置于扫描电镜下观察菌株的显微结构,观察结果见图1。
由图1可见,菌株的菌体呈杆状,细胞单个或成双排列。
③基于16S rDNA的系统发育分析
将活化后的菌株接种到新鲜灭菌的LB液体培养基中培养24h,取新鲜细菌培养液1mL于1.5mL无菌离心管中,8000rpm离心1min,弃上清,菌体用0.5mL无菌磷酸缓冲液洗涤三次后,加入200μL无菌重蒸水,旋涡混匀后,沸水浴3min,8000rpm离心5min,上清液直接用做PCR反应的模板。
用于16S r DNA PCR反应的引物:
正向引物27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID No.2);
反向引物1492R:5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID No.3)。
50μL PCR反应体系如下:10×PCR缓冲液5μL(含MgCl2),dNTP1μL,上下游引物各2.0μL,模板DNA 2μL,Taq酶(10000U/mL)0.5μL,ddH2O 37.5μL。
PCR程序为:⑴94℃,5min;⑵94℃,1min;54℃,1min;72℃,1min;⑶第2步循环30次;⑷72℃,10min;⑸4℃10min;⑹-20℃保存。分别以无菌去离子水、E.coli作为阴性和阳性对照。
PCR产物的纯化和测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。测序得到该菌株的16S rDNA序列大小为1433bp(SEQ ID No.1)。所得序列用BLAST程序与GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中的菌株进行比对,选取一些具有代表性的菌株用于系统发育树的构建,运用软件CLUSTAL X进行DNA序列同源性比较;比对结果用MEGA软件中的Neighbor-Joining的距离模进行UPGA分析后生成系统发育树,分析结果见图2。
NCBI比对结果:该菌株(登录号:KJ191561)的16S rDNA序列与已报道的戴尔福特菌属的模式菌株Delftia tauruhatensis DSM17581T(登录号:AB075017)的16S rDNA序列核酸同源性最高(100%),可以初步鉴定为Delftia tauruhatensis,是Delftiatsuruhatensis的一个新菌株。
对该菌株进行了保藏,命名为戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)12#,保藏号为CCTCC No:M 2014389,保藏单位为中国典型培养物保藏中心,保藏单位地址为中国湖北省武汉市武汉大学,保藏时间是2014年8月22日。
实施例2戴尔福特菌12#的生长特性检测
(1)最适生长pH
配制牛肉膏蛋白胨液体培养基若干瓶,调节pH,使其pH分别为2.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0;接种对数生长期的戴尔福特菌12#菌液,接种量为1%,摇床培养,观察并记录菌株的生长状况。
观察结果:菌株12#在pH 5.0-9.0范围内均可生长,最适生长pH为7.0。
(2)最适生长温度
配制牛肉膏蛋白胨液体培养基,将活化后的菌株12#以1%接种量接种到营养肉汤液体培养基中,将其置于温度为10、20、25、30、37、40℃的恒温摇床中150rpm培养,观察并记录菌株12#的生长状况。
观察结果:菌株12#在10-40℃之间均能生长,最适生长温度为37℃。
实施例3戴尔福特菌12#的生理生化指标
生理生化指标的测定采用广东环凯微生物科技有限公司生产的生化鉴定管,具体操作按生化鉴定管使用说明进行。
菌株12#的生理生化指标的鉴定结果如表1。
表1 戴尔福特菌12#的生理生化指标表
由表1可见,戴尔福特菌12#的脂肪酶(吐温80水解)、精氨酸双水解酶、接触酶和氧化酶均阳性;不水解淀粉,不液化明胶;具有还原硝酸盐的能力;可利用乙酰胺、柠檬酸盐、甘露醇、果糖作为能量和碳源;但不利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖、麦芽糖、鼠李糖、蜜二糖、纤维二糖、丙二酸盐等。
实施例4戴尔福特菌12#的重金属吸附效果
将斜面保存的戴尔福特菌12#接种于未添加重金属的牛肉膏蛋白胨液体培养基中,活化24h后,将菌株以2%的接种量分别接种到含重金属(Cd2+、Mn2+、Cu2+、Cr2+、As2+、Zn2+和Pb2+)终浓度为100mg/L的牛肉膏蛋白胨液体培养基中,37℃下摇床150rpm振荡培养24h,取样离心,收集菌体。
分别测定上清液和经三次去离子水洗涤后的沉淀物硝酸酸解液中所含的重金属离子浓度,离心得到的菌体在70℃下烘至恒重测量。菌株对重金属的吸附量(q)以及吸附率(A)按照下列公式计算:
q=(C0-Ce)×V/W (1);
A=(C0-Ce)/C0×100% (2);
上式中,C0、Ce分别为上清液中重金属离子的起始浓度和经戴尔福特菌12#吸附后的浓度(mg/L);V为溶液体积(L);W为菌体干重(g)。样品重复测定三次。戴尔福特菌12#的重金属吸附结果见表2。
表2 戴尔福特菌12#的重金属吸附结果
从表2中可以看出,戴尔福特菌12#对镉的富集量达到103.3mg/g,富集率为62%;对锰、锌、铅的吸附量也在100mg/g以上;其中,对铅的吸附量达到132.6mg/g,对铅的吸附率达到90.2%。
由此可见,戴尔福特菌12#可以同时抗三种以上的高浓度重金属(包括镉、铅、锰、锌),吸附量在103.3mg/g到132.6mg/g,吸附容量高于目前常见的细菌类吸附剂,在重金属污染土壤和水体的生物修复及重金属回收方面具有新的应用前景,将菌种活化后可直接作为重金属吸附剂,操作简便;而且,在整个重金属吸附剂的制备过程中不需添加任何有机试剂,绿色环保。
Claims (8)
1.一种戴尔福特菌,其特征在于,命名为戴尔福特菌Delftia tsuruhatensis 12#,保藏编号为CCTCC No:M2014389。
2.如权利要求1所述戴尔福特菌在制备重金属吸附剂中的应用。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述重金属是指铅、锰、锌和镉中的至少一种。
4.一种重金属吸附剂,其特征在于,活性成分为如权利要求1所述的戴尔福特菌。
5.如权利要求4所述的重金属吸附剂,其特征在于,所述戴尔福特菌的浓度为1.0×108~1010CFU/mL。
6.如权利要求1所述戴尔福特菌在修复重金属污染水体或土壤中的应用;所述重金属是指铅、锰、锌和镉中的至少一种。
7.如权利要求1所述戴尔福特菌在回收水体或吸附土壤中的重金属中的应用;所述重金属是指铅、锰、锌和镉中的至少一种。
8.如权利要求6或7所述的应用,其特征在于,包括:将戴尔福特菌菌液投加到重金属污染水体或土壤中。
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