CN114107064A - 苯并[a]芘高效降解真菌LJD-6及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了苯并[a]芘高效降解真菌LJD‑6及其应用。Aspergillus elsenburgensis LJD‑6于2021年8月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：61887。本发明从杭州石油污染土壤中富集分离获得1株能以苯并[a]芘为碳源生长的苯并[a]芘降解菌LJD‑6。该菌株LJD‑6为专性好氧菌，可形成3‑7mm，棕绿色，边缘不规则的类圆形，灰色绒毛状菌丝向上生长的菌落，背面呈黄色。LJD‑6是一种能够高效降解苯并[a]芘的菌株，对多环芳烃适应性强，在生物修复苯并[a]芘方面也将具有较好的应用潜力。

Description

苯并[a]芘高效降解真菌LJD-6及其应用

技术领域：

本发明属于有机污染物降解领域，具体涉及苯并[a]芘高效降解真菌Aspergilluselsenburgensis LJD-6及其应用。

背景技术：

在石油开采过程中，结构稳定、毒性强、难以降解的有机污染物以多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)为主，主要集聚在石油开采区的土壤或者水体环境中，通过食物链逐级放大，最终对人类和生态健康造成危害。由于这类污染物结构稳定，极性低，由两个及两个以上苯环组成，是很难降解的持久性有机污染物，其中苯并(a)芘，,简称BaP，是一种由五个苯环构成的多环芳烃化合物。BaP是一种有代表性的强致癌性物质。由于它对人体的危害严重，早在1972年斯得哥尔摩人类环境会议上就把它作为环境污染物必测项目。大量研究证实微生物降解是处理环境中苯并(a)芘的有效方法,它经济、方便、无二次污染。

目前，已报道的苯并[a]芘降解真菌菌株较少，主要包括Trichoderma，Fusarium和Penicillium等。由于环境中的大部分微生物都是不可培养的，很多微生物尤其是具有特定功能的微生物都不能通过纯培养的方式分离获得。此外，PAHs的生物可降解性随苯环数和苯环密集程度的增加而降低，尤其是四环以上的PAHs常以共代谢的方式进行降解。因此，筛选出能以苯并[a]芘为唯一碳源，且能够有效降解高浓度苯并[a]芘的降解菌株具有重要的应用价值和现实意义。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种具有苯并[a]芘降解能力的Aspergilluselsenburgensis LJD-6，于2021年8月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：61887。

本研究报道菌株为Aspergillus elsenburgensis LJD-6，目前关于该菌对污染物的降解研究较少，国内外也暂未有其对苯并[a]芘降解的相关报道。本研究从杭州某石油污染场地中驯化和分离得到1株以高浓度苯并[a]芘作为碳源的菌株LJD-6，并对其进行菌种鉴定，生长特性研究。此外，我们还探究了LJD-6对苯并[a]芘的降解特性，为石油污染土壤中高分子量PAHs的生物修复提供参考。

本发明的第二个目的是提供Aspergillus elsenburgensis LJD-6在降解苯并[a]芘中的应用。

优选，所述的降解苯并[a]芘是降解土壤中的苯并[a]芘。特别是石油污染土壤中的苯并[a]芘。

优选是将Aspergillus elsenburgensis LJD-6应用在苯并[a]芘污染的环境中对苯并[a]芘进行降解。

本发明的第三个目的是提供一种苯并[a]芘降解菌剂，其包含Aspergilluselsenburgensis LJD-6作为活性成分。

本发明的第四个目的是提供一种降解苯并[a]芘的方法，将所述的Aspergilluselsenburgensis LJD-6洒于含有苯并[a]芘的环境中，对苯并[a]芘进行降解。

优选，是将Aspergillus elsenburgensis LJD-6洒于苯并[a]芘污染的环境中对苯并[a]芘进行降解。进一步优选是将Aspergillus elsenburgensis LJD-6洒于石油污染的土壤中对苯并[a]芘进行降解。

本发明从杭州石油污染土壤中富集分离获得1株能以苯并[a]芘为碳源生长的苯并[a]芘降解菌LJD-6。该菌株LJD-6为专性好氧菌，可形成3-7mm，棕绿色，边缘不规则的类圆形，灰色绒毛状菌丝向上生长的菌落，背面呈黄色。根据分子生物学手段分析，可得出本实验所分离的真菌LJD-6为Aspergillus elsenburgensis菌株，并绘制了其进化树。目前针对该菌株应用的报道很少，且尚未有关于利用该菌降解PAHs和苯并[a]芘的研究报道。菌株的最佳生长条件为确定菌株的最佳生长条件为温度28℃，pH 6.0。LJD-6能够以苯并[a]芘作为唯一碳源，并对其进行降解。在苯并[a]芘初始浓度在50mg·L^-1的无机盐培养液中，培养14天后，其降解率可达95.5％。综上，LJD-6是一种能够高效降解苯并[a]芘的菌株，对多环芳烃适应性强，在生物修复苯并[a]芘方面也将具有较好的应用潜力。

Aspergillus elsenburgensis LJD-6于2021年8月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：61887。

附图说明：

图1是LJD-6在PDA培养基上生长72小时的正面和反面。

图2是LJD-6和其相关菌的基于ITS基因序列的系统发生关系，构建方法为邻接法，自展值设定重复1000次，图中仅展示了自展值大于50％的结果，比例尺0.01代表每个核苷酸的替换率。

图3是LJD-6在不同条件下生长：(a)温度；(b)pH。

图4是LJD-6在苯并[a]芘的无机盐培养基中的降解效率(初始浓度50mg·L^-1)。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：Aspergillus elsenburgensis LJD-6的分离和鉴定

1、材料与方法

1.1样品来源

供试土壤采自杭州某石油污染场地表层土壤，以高浓度苯并[a]芘为碳源对其进行长期驯化，通过多次筛选和分离纯化得到高效苯并[a]芘降解真菌。

1.2培养基

1.2.1无机盐培养基

无机盐培养基用于样品中微生物的富集培养以及纯菌条件下苯并[a]芘的降解实验。该培养基配方见表1。其配制方法是将各成分加入到溶剂水中，混合均匀，灭菌制得。

表1无机盐培养基配方

1.2.2营养培养基

营养培养基用于苯并[a]芘降解真菌的分离、纯化、保藏、活化等常规微生物的培养。本实验所用的液体营养培养基种类及成分见表2。若实验需要配制固体培养基，仅需在原有培养基配方的基础上增添质量分数1.5-2％的琼脂粉。若菌株的培养条件无特别说明，培养基pH均调节至6。其配制方法是将各成分加入到溶剂水中，混合均匀，灭菌制得。

表2 Potato-Dextrose broth培养基(PDB)成分

1.3菌株的驯化、筛选和分离

将样品土壤加入到无机盐培养基中，并加入硫酸链霉素和青霉素(浓度分别为100ug·mL^-1)以抑制细菌生长。之后加入50mg·L^-1的苯并[a]芘作为降解底物，于28℃培养箱中避光震荡培养。利用以苯并[a]芘为碳源的无机盐培养基进行菌株驯化，7d为一个驯化周期。取10％的接种量转接到新鲜的含50mg·L^-1的苯并[a]芘的无机盐培养基中，并重复上述富集过程三次。

将获得的第四代富集培养样品在营养培养基(PDB)上以稀释平板法涂布分离。涂布好的样品于28℃培养箱中避光震荡培养48小时左右时，培养基表面形成了明显的单菌落。根据菌落的形态大小、颜色、菌丝等特征，挑取不同的若干单菌落于营养培养基平板上划线纯化及培养。经划线纯化的平板上，若仍有不同特征的单菌落，则将其再次划线分离，直至同一平板上只能观察到相同特征的单菌落为止。

本实验筛选得到1株对苯并[a]芘有高效降解性能的菌株LJD-6。将其单菌落挑取到相应固体试管营养培养基中培养，将培养后的菌液加至无菌液体石蜡中封存，并放置于4℃长期保存。

A、形态特征：

LJD-6是一株从杭州石油污染土壤中分离出的真菌，经活化以后，在PDA平板上，于28℃有氧的条件下，培养72h后，可形成直径为3-7mm，棕绿色，边缘不规则的类圆形，灰色绒毛状菌丝向上生长的菌落，背面呈黄色(图1)。该菌为专性好氧菌。

B、菌株LJD-6的分子生物学特征

分子生物学特性鉴定主要包括测序及系统发育树的构建。在进行测序和构建系统发育树之前，需先用真菌基因组DNA快速提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取真菌DNA。为了对真菌的分类学进行研究，通常需要扩增ITS基因以及构建系统发育树，扩增的基因为真核中编码rRNA所组成部分中的一段DNA，因其具有高度的保守性、特异性和较合适的序列长度，通常被用于检测和鉴定真菌。

聚合酶链式反应(PCR)主要是用来扩增不同的基因片段，PCR需要不同的引物(ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，PCR扩增反应的体系：10×buffer 2.5μl，Mg²⁺(25mmol/l)1.5μl，dNTP(25mmol/l)0.3μl，正向引物(10mmol/l)0.5μl，反向引物(10mmol/l)0.5μl，Taq酶0.25μl，DNA组模板0.1μl，去离子水19.35μl。PCR扩增反应条件：95℃预变性3min；95℃变性45s，56℃退火30s，72℃延伸45s，循环30次；72℃延伸10min；反应结束后于4℃条件下保存。扩增所需基因后，将核酸染色剂GelRed加至0.75-1％的琼脂糖中，配制成凝胶块，在凝胶块中加入PCR产物和包含各种长度片段的DNA标记物(maker)，之后将其放置于装有TBE(Tris硼酸)缓冲液的电泳仪内，并在一定电压下使其工作20min。电泳结束后，将凝胶块取出，并放置于300nm的紫外灯下进行观察，以确定PCR产物扩增反应是否成功。之后，将扩增成功的PCR产物送往华大基因科技有限公司测序，测序引物与扩增引物相同。

将测序所得的真菌ITS基因序列上传到NCBI上，此网站会将提交的序列与已被公认的典型菌株的ITS基因序列进行比对，得到序列间的相似度信息。根据序列比对的结果分析即可选取相应的典型菌株作为本实验分离菌株的模式菌，同时还可以获得模式菌的ITS基因序列，构建系统发育分析以证明模式菌与实验分离菌株具有差异，从而鉴定分离的菌株。系统发育树的构建主要通过MEGA 5.05程序，采用邻接法构建，自展值常设定为重复1000次计算。

通过PCR和基因测序得到菌株LJD-6的长为602bp ITS基因序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)。通过ITS基因比对发现，该菌株LJD-6与Aspergillus elsenburgensisstrain CMV011G4的基因相似度为100％。由以上结果可得出本实验所分离的真菌LJD-6为Aspergillus elsenburgensis这个种。

利用LJD-6的ITS基因序列和与其相似度较高的ITS基因序列制作系统发育树，从而获得LJD-6的ITS基因和其相似性较高的ITS基因之间的同源性结果。采用邻位相接法构建的系统发育树如图2所示。

因此，本发明的菌株LJD-6命名为Aspergillus elsenburgensis LJD-6，于2021年8月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：61887。

目前，在环境领域内关于该菌株的应用报道较少。因此，高效苯并[a]芘降解菌的获得对PAHs污染水土的处理和深度修复，尤其是苯并[a]芘污染的治理，具有重要的理论指导和实际应用意义。

实施例2：生长条件

A、生长温度的测定：

配置菌株生长所需液体营养培养基(PDB)，灭菌后，将已活化的菌种LJD-6接种到培养基内(实验组)，同时以不接种真菌的培养基作为对照(对照组)，于不同温度(18℃、23℃、28℃、33℃、38℃)下培养7天，所有样品均设置三个重复。每日观察真菌生长情况，7天后将培养基倒入已知重量的离心管中，以5000rpm转速离心30min后，倒掉上清液，放入60℃烘箱烘至恒重，称重计算真菌菌丝干重。

B、生长pH的测定：

配置菌株生长所需液体营养培养基(PDB)，用如下缓冲体系调节培养液的pH，pH4.0-5.0，0.1mol/l柠檬酸钠和0.1mol/l柠檬酸；pH 6.0–8.0，0.1mol/l NaOH和0.1mol/lKH₂PO₄；pH 9.0，0.1mol/l NaHCO₃和0.1mol/l Na₂CO₃。将真菌LJD-6接种到不同pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)的培养基内，每个pH做三个重复，用不接种真菌的培养基作为对照，将培养基放入生长最适温度下培养7天，每日观察真菌生长情况，7天后将培养基倒入已知重量的离心管中，以5000rpm转速离心30min后，倒掉上清液，放入60℃烘箱烘至恒重，称重计算真菌菌丝干重。

如图3所示，LJD-6能够在18-38℃的温度条件下生长，最适生长温度为28℃；该菌能够在4.0-9.0的pH条件下生长，最适生长pH为6.0。

实施例3：苯并[a]芘降解率试验

将活化培养7天后的菌株LJD-6按质量比10％的接种量分别接种于含有初始为50mg·L^-1的苯并[a]芘的无机盐培养基(实施例1)中，同时以不添加纯菌LJD-6的处理为对照处理。，所有处理各设置3个重复，于温度28℃避光振荡培养14d。

取各处理样品用于化学分析，具体步骤如下：

(1)样品预处理：将各培养样品加入二氯甲烷萃取，同时添加5μL浓度为200mg/L的苝-d12作为回收率指示剂，充分震荡后，转移至分液漏斗中。静置分层后，收集有机相，把下层液体放回摇瓶中，再用等体积二氯甲烷重复萃取，合并萃取液，并将其转移至含有适量已活化铜片的平底烧瓶中，旋转蒸发浓缩至2mL左右，加入少量正己烷(约5mL)，再次旋转蒸发至2mL左右，重复洗三次，以达到将有机溶剂置换为正己烷的目的。置换后的浓缩液用玻璃填充柱(直径约为9mm)净化。柱填料自下而上为3cm 3％去活化中性氧化铝，3cm3％去活化硅胶和1cm的无水硫酸钠。用适量正己烷活化柱子，用15mL正己烷/二氯甲烷(体积比为1:1)混合试剂淋洗填充柱，并用棕色试剂瓶收集洗脱液约15mL，氮吹使其浓缩至约0.5mL，最后转移至1.5mL细胞瓶中，冷冻保存。上机测定前，加入5μL，浓度为200mg/L的六甲基苯作为内标物。

(2)仪器分析：采用安捷伦7890气相色谱仪-5975质谱仪联用测定各处理样品中PAHs含量。色谱柱为安捷伦DB 5-MS毛细管色谱柱(柱长30m，内径0.25mm，膜厚度0.25μm)。所得数据用安捷伦色谱工作站处理分析，苯并[a]芘定量的分析用6点校正曲线和内标法进行。微生物细胞浓度的测定采用烘干称重法。

根据GC-MS的测定结果可知，菌株LJD-6能够降解苯并[a]芘(图4)，且在含有50mg/L的苯并[a]芘的无机盐培养液中，培养14天后，LJD-6的降解率可达到95％以上。由此可见，菌株LJD-6是一种能够降解苯并[a]芘的高效菌株。

3结论

A、从杭州石油污染土壤中富集分离获得1株能以苯并[a]芘为碳源生长的苯并[a]芘降解菌LJD-6。

B、该菌株LJD-6为专性好氧菌，可形成3-7mm，棕绿色，边缘不规则的类圆形，灰色绒毛状菌丝向上生长的菌落，背面呈黄色。根据分子生物学手段分析，可得出本实验所分离的真菌LJD-6为Aspergillus elsenburgensis菌株，并绘制了其进化树。目前针对该菌株应用的报道很少，且尚未有关于利用该菌降解PAHs和苯并[a]芘的研究报道。

C、菌株的最佳生长条件为确定菌株的最佳生长条件为温度28℃，pH 6.0。LJD-6能够以苯并[a]芘作为唯一碳源，并对其进行降解。在苯并[a]芘初始浓度在50mg·L^-1的无机盐培养液中，培养14天后，其降解率可达95.5％。综上，LJD-6是一种能够高效降解苯并[a]芘的菌株，对多环芳烃适应性强，在生物修复苯并[a]芘方面也将具有较好的应用潜力。

序列表

<110> 中国科学院广州地球化学研究所

<120> 苯并[a]芘高效降解真菌LJD-6及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 602

<212> DNA

<213> Aspergillus elsenburgensis LJD-6

<400> 1

ccgtaggtga acctgcggaa ggatcattac cgagtgaggg ccctctgggt ccaacctccc 60

acccgtgttt attgtacctt gttgcttcgg cgggcccgcc gttttcgaac ggccgccggg 120

gaggccctgt gcccccgggc ccgcgcccgc cgaagacccc aacatgaact ctgttctgaa 180

agtatgcagt ctgagtttga ttaccataat caattaaaac tttcaacaac ggatctcttg 240

gttccggcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca 300

gtgaatcatc gagtctttga acgcacattg cgccccctgg tattccgggg ggcatgcctg 360

tccgagcgtc attgctgccc tcaagcacgg cttgtgtgtt gggcccccgt ccccggttca 420

ccccggggac gggcccgaaa ggcagcggcg gcaccgcgtc cgatcctcga gcgtatgggg 480

ctttgtcacc cgctctgtag gcccggccgg cgccagccga caccccaact ttatttttct 540

aaggttgacc tcggatcagg tagggatacc cgctgaactt aagcatatca ataagcggag 600

ga 602

Claims (9)

1.Aspergillus elsenburgensis LJD-6，保藏编号为：GDMCC No：61887。

2.权利要求1所述的Aspergillus elsenburgensis LJD-6在降解苯并[a]芘中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的降解苯并[a]芘是降解土壤中的苯并[a]芘。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的降解苯并[a]芘是降解石油污染土壤中的苯并[a]芘。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是将Aspergillus elsenburgensis LJD-6应用在苯并[a]芘污染的环境中对苯并[a]芘进行降解。

6.一种苯并[a]芘降解菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的Aspergilluselsenburgensis LJD-6作为活性成分。

7.一种降解苯并[a]芘的方法，其特征在于，将所述的Aspergillus elsenburgensisLJD-6洒于含有苯并[a]芘的环境中，对苯并[a]芘进行降解。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，是将Aspergillus elsenburgensis LJD-6洒于苯并[a]芘污染的土壤中对苯并[a]芘进行降解。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，是将Aspergillus elsenburgensis LJD-6洒于石油污染的土壤中对苯并[a]芘进行降解。

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