CN105349481B - 一种红豆杉根际多环芳烃降解菌的筛选方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红豆杉根际多环芳烃降解菌的筛选方法及应用，取2mL 100g/L活化土样加入到48mL 25mg/L芘溶液中，28℃振荡培养5d；取2mL富集液加入到48mL 50mg/L芘溶液，28℃振荡培养5d；循环往复，直到芘浓度为0.2g/L。经筛选驯化得到三株能高效降解多环芳烃的真菌：踝节菌，残孔菌和尖孢镰刀菌。在优化条件下，踝节菌对多种多环芳烃均能高效降解，尤其对芘的降解效果优于其它菌株。利用HPLC和质谱证实了踝节菌对多种多环芳烃的降解。从踝节菌和残孔菌提取的生物絮凝剂亦能降解芘，菲，萘，苊等多环芳烃。筛选得到的踝节菌属对高岭土的絮凝率达到90％。

Description

一种红豆杉根际多环芳烃降解菌的筛选方法及应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种红豆杉根际多环芳烃降解菌的筛选方法及应用。

背景技术

多环芳烃(PAHs)是一类分子中含有两个以上苯环的有机化合物。这类物质化学性质稳定，毒副作用大，易对人类造成致畸性、致癌性和致突变性等危害。环境中多环芳烃的沉积主要来源于煤和石油的燃烧，工业生产、垃圾焚烧、汽车尾气排放等也会造成PAHs的大量增加。环境中PAHs数量多分布广，难以集中治理，用物理和化学修复方法难以将它们完全消除，还会对环境造成二次污染，生物修复技术能很好的解决上述问题。

我国有多种红豆杉属植物，其次生代谢产物紫杉醇具有抗癌功效。对红豆杉的药用价值研究很多。目前，红豆杉属植物内生菌种类及其次生代谢产物已成为研究热点。南方红豆杉是我国特有物种，其内生真菌种类丰富多样，李冬利等从南方红豆杉的叶、枝条、树皮及果实中共分离到内生真菌55株，通过形态学和分子生物学鉴定，发现其中4株菌可能为新种。宋培勇等从南方红豆杉的茎、皮和叶分离出52株细菌，用分子生物学方法确定其种属。郝大程等用克隆测序方法首次揭示南方红豆杉根际微生物多样性，但至今对其功能潜力所知甚少，从中分离出能降解多种PAHs的微生物具有重要的理论价值和工程实践意义，并有利于红豆杉资源的可持续综合利用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种红豆杉根际多环芳烃降解菌的筛选方法。该方法对红豆杉根际真菌进行驯化，筛选出以芘为唯一碳源的三个菌株，解决环境中多环芳烃的污染问题。操作简便易行，可直接应用于生产实践。

其具体技术方案为：

一种红豆杉根际多环芳烃降解菌的筛选方法，包括以下步骤：

取2ml 100g/L活化根际土样加入到48ml 25mg/L芘溶液中，28℃振荡培养5d；取2ml富集液加入到48ml 50mg/L芘溶液，28℃振荡培养5d；循环往复，直到芘浓度为0.2g/L；经过形态观察及rDNA-ITS序列分析鉴定出踝节菌属(Talaromyces verruculosus，T)，残孔菌属(Abortiporus biennis，R)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum，F)，踝节菌属和残孔菌属是用浓度为0.2g/L芘驯化筛选出的优势菌，尖孢镰刀菌不能耐受高浓度芘，只能在含50mg/L芘的平板上生长。将纯化的踝节菌属接入装有50mL发酵培养基的250mL摇瓶中，在30℃、150r/min的摇床中培养2d；取发酵液测絮凝率，经多次连续传代，踝节菌属的絮凝率均达到90％。

进一步，所述踝节菌属(简称T)于2014年11月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC No：M 2014542。

本发明所述踝节菌属在去除环境中PAHs污染物过程中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明不仅修复成本低、无二次污染，还可以大面积的应用到环境治理中，是去除环境中PAHs等污染物的重要而有效的途径。

保藏信息

踝节菌属DJTU-SJ5(Talaromyces dalianensis DJTU-SJ5)，已经保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2014542，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2014年11月2日。

附图说明

图1为本发明的实验流程图；

图2为苯并芘的降解图；

图3为芘的降解图；

图4为菲的降解图；

图5为萘的降解图；

图6为苊的降解图；

图7为苯并芘的色谱图；

图8为菌株T降解苯并芘的代谢产物的LC-MS分析和推测的结构图，其中图8a产物1的离子碎片，图8b产物2的离子碎片，图8c产物3的离子碎片；

图9为尖孢镰刀菌；

图10为踝节菌；

图11为残孔菌；

图12为菌株T在优化条件下对芘、菲、萘、苊的降解图；

图13为菌株R在优化条件下对芘、菲、萘、苊的降解图；

图14为混合菌T+R在优化条件下对芘、菲、萘、苊的降解图；

图15为pH对T和R的絮凝活性的影响；

图16为时间对T和R絮凝活性及生长的影响；

图17为发酵温度对T和R絮凝活性的影响；

图18为碳源种类对T和R絮凝活性的影响；

图19为菌株的絮凝图。从左至右：对照(未加菌)，T(加踝节菌)，R(加残孔菌)；

图20为絮凝剂T和R对四种PAHs的降解。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1产物液相实验

1.1实验试剂

苯并芘(97％)，CAS号：50-32-8，百灵威科技有限公司；芘(97％)，CAS号：129-00-0，阿拉丁试剂有限公司；菲(97％)，CAS号：85-01-8，阿拉丁公司；萘(95％)，CAS号：91-20-3，上海信裕生物科技有限公司；苊(95％)，CAS号：83-32-9，上海信裕。

1.2培养基及溶液

(1)多环芳烃丙酮溶液：取0.25g多环芳烃溶于50mL丙酮溶液中，配成5g/L储备液备用。

(2)种子培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL。

(3)无机盐培养基：磷酸缓冲溶液6mL、MgSO₄·H₂O(24.5g/L)3mL、CaCl₂(1g/L)1mL、FeCl₃(1g/L)2mL、ZnSO₄·H₂O(1g/L)2mL、MnSO₄·H₂O(0.5g/L)1mL，定容至1L。

(4)磷酸缓冲溶液：K₂HPO₄·3H₂O 26.12g、KH₂PO₄·H₂O 6.8g、NH₄Cl 5.0g、Na₂HPO₄·12H₂O35.8g，蒸馏水1000mL。

1.3多环芳烃降解实验

本实验通过均匀设计优化，提高菌株对高浓度底物的降解率，测定菌株T在7天内对100mg/L芘、150mg/L菲、200mg/L萘和200mg/L苊的降解，同时证实菌株T对20mg/L苯并芘的降解效果。

(1)菌悬液制备：挑取纯化后的菌株T放入100mL种子培养基中进行摇瓶培养，30℃，150r/min振荡培养48h。对20mL培养液，在6000r/min离心20min，去掉上清液保留菌体，用磷酸缓冲液清洗并离心，再用该缓冲液将清洗后的菌体配成5mL较浓的菌悬液。

(2)苯并芘降解实验：取1mL 1g/L苯并芘丙酮溶液加入无机盐培养液中，使体系体积为50mL，苯并芘浓度20mg/L。用纱布封住瓶口，35℃，150r/min振荡50min，促使培养液中的丙酮挥发，以减少丙酮对菌体的毒副作用。加入菌悬液，30℃，150r/min振荡培养7天，测定降解率。

(3)芘、菲、萘、苊的降解过程同上述苯并芘的降解实验。

1.4固相萃取-液相色谱检测降解产物

具体过程：降解液6000r/min离心25min。去掉菌体收集上清液，用0.22μm滤膜进行过滤处理，然后用固相萃取仪将溶液中的苯并芘洗脱出来。萃取采用C-18固相萃取柱，二氯甲烷作洗脱溶剂，萃取过程：①活化C-18柱子：依次用10mL二氯甲烷、10mL甲醇、10mL超纯水冲洗柱子，冲洗速度3mL/min；②过样：加入待萃取样品，洗脱速度1～2mL/min，使待测组分保留在吸附柱上，真空抽滤10min；③洗脱：用10mL二氯甲烷以1～2mL/min速率通过吸附柱，将待测组分洗脱出来。洗脱样品在60℃水浴锅浓缩至1mL，将样品真空抽干，抽干后用2mL乙腈溶解。

色谱条件：色谱柱为C18柱，250×4.6×5μm，柱温30℃，进样量10μL，流速1mL/min，流动相水/乙腈，紫外检测波长242nm，洗脱梯度表1：

表1

1.5液相色谱结果

下述色谱图中1、2、3号色谱线分别为只含有菌株的培养液、底物、含有菌株和底物的培养液。液相色谱仪：岛津LC-10ATVP-UV。

如图2所示，可见两个明显的产物峰，其中底物c(苯并芘20mg/L)出峰时间19.834min；产物a出峰时间为1.821min，产物b出峰时间10.896min。

图3为芘的降解图，b为底物芘(100mg/L)，出峰时间14.654min。推测有1个主要产物峰为a，出峰时间为10.904min。从峰面积可见芘的降解率偏低，可能是由于芘浓度偏大，对菌体有一定的毒副作用，使得代谢效果较差。

图4为菲的降解图，图中a代表底物菲(150mg/L)，出峰时间13.641min。未见产物峰，可能是萃取过程中底物菲和其产物未被洗脱出来，也可能是菌株对菲的转化较为彻底，将其代谢为小分子的终产物。

图5为萘的降解图，a代表底物萘(200mg/L)，出峰时间9.384min，可见降解样品中没有检测到底物峰和产物峰，可能由于菌株对萘的利用率较高，使其降解比较完全。

图6为苊的降解图，b代表苊(200mg/L)，出峰时间12.401min，可见菌株对苊的代谢效果较好。a为产物峰，出峰时间6.306min。

1.6苯并芘的质谱结果

液质联用色谱条件：仪器：岛津LC-MS-2010EV，色谱柱为C18柱，250×2.1×5μm，柱温30℃，进样量5μL，流速0.4mL/min，流动相水/乙腈，紫外检测波长232nm，洗脱梯度表2：

表2

图7为苯并芘降解72h的色谱图，底物出峰时间9.944min，按照出峰时间将产物标记为1、2、3，出峰时间分别为6.009min，8.097min，9.601min。

图8中，a为产物1的离子碎片，可见4个主要的离子碎片，m/z值分别为83、122、279、280，推测分子量为122的代谢产物为苯甲酸，m/z值为280的代谢产物可能是苯并芘添加一个-CHO，如图8a所示。b为产物2的6个离子碎片，m/z值分别为136、150、334、406、422、466，分子量为136的可能是邻甲基苯甲酸，分子量为150的可能是2-乙基-苯甲酸，m/z值334的可能是苯并芘添加-CHCH₂和-COCHO这两个基团，m/z值406的产物可能是m/z334的产物添加-COOH和-CHO两个基团，m/z值422产物可能是由m/z406的产物添加一个-OH形成，m/z值从422变为466可能是增加一个-COOH，如图8b所示。c为产物3的离子碎片，m/z值339，可能是苯并芘增加-OH和-CHCHCOOH这两个基团，如图8c所示。

实施例2 PAHs降解菌的驯化、筛选及鉴定

2.1实验材料与方法

本实验所用菌株来自南京南方红豆杉根际土壤深度10～15cm处。

表3实验试剂与材料

2.2菌种筛选

2.2.1培养基及溶液

(1)芘丙酮溶液：取0.25g芘溶于50mL丙酮溶液中，配成5g/L储备液备用。

(2)磷酸缓冲溶液：K₂HPO₄·3H₂O 26.12g、KH₂PO₄·H₂O 6.8g、NH₄Cl 5.0g、Na₂HPO₄·12H₂O35.8g，蒸馏水1000mL。

(3)无机盐培养基：取上述磷酸缓冲液6mL、MgSO₄·H₂O(24.5g/L)3mL、CaCl₂(1g/L)1mL、FeCl₃(1g/L)2mL、ZnSO₄·H₂O(1g/L)2mL、MnSO₄·H₂O(0.5g/L)1mL，定容至1L。

(4)种子培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL。

(5)筛选培养基：K₂HPO₄2.0g、KH₂PO₄0.6g、芘0.2g、NaCl 0.5g、NH₄NO₃1.5g、MgSO₄·7H₂O 0.05g、MnSO₄·H₂O 0.015g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、CaCl₂0.01g、琼脂粉20g、蒸馏水1000mL。

2.2.2 PAH降解真菌筛选

(1)土壤活化：从4℃冰箱中取出适量根际土样，过80目筛，去除土壤中的根须和残渣，在电热恒温鼓风干燥箱中50℃处理15min。取5g干燥土样加入到100mL种子培养基中，25℃，150r/min振荡培养24h。

(2)菌种筛选：将培养后的活化土样静置10min，在无菌操作下，取0.2mL用无菌水稀释10倍的上清液，用涂布法进行平板培养，28℃培养5天，观察菌株生长情况。将筛选出的菌株进行划线分离，然后纯化培养。

(3)菌种驯化：采用逐步提高芘浓度的驯化方法。挑取纯化后的单菌于50mL种子培养基中，28℃，150r/min振荡培养48h。取2mL种子培养液加入到48mL芘浓度25mg/L的种子培养基中，28℃，150r/min振荡培养5d。然后从培养液中取出2mL加入到芘浓度为50mg/L种子培养基中。继续提高芘浓度进行菌培养，直至种子培养基中芘的浓度为200mg/L。

2.3菌种鉴定

2.3.1培养基及溶液

(1)10×TBE缓冲液(pH 8.3)：Tris 108g，硼酸55g，Na₂EDTA·2H₂O 7.44g，用去离子水定容至1L，在常温下保存。

(2)溴乙锭EB(10mg/mL)：溴乙锭1g，去离子水100mL，棕色瓶中室温避光保存。工作浓度为0.5μg/mL。

(3)琼脂糖凝胶(1％)：1×TBE缓冲液100mL，琼脂糖1g，10mg/mL EB 5μL。

(4)蛋白酶k：母液浓度为20mg/L，-20℃保存。

2.3.2分子鉴定方法

(1)用宝生物公司MiniBEST Universal Genomic DNA提取试剂盒提取真菌基因组DNA。

(2)用琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA。

(3)PCR扩增ITS序列：

将引物ITS1和ITS4用TE缓冲液稀释到10pmol/μL备用。依次加入超纯水15μL、Premix 25μL、引物各2μL、模板DNA 6μL，充分混匀。PCR扩增条件：94℃15min；95℃1min，56℃1min，72℃1.5min，35次循环；72℃10min，4℃保存。PCR扩增产物送往大连宝生物公司测序。

2.4结果与讨论

2.4.1真菌筛选结果

以芘为唯一碳源，共筛选出3株真菌，分别为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum，F)、踝节菌(Talaromyces verruculosus，T)和残孔菌(Abortiporus biennis，R)。经逐步提高芘浓度驯化后筛选到两株优良菌，分别属于踝节菌属(Talaromyces verruculosus)和残孔菌属(Abortiporus biennis)。

图9为菌株F，菌落颜色为粉红色，表面粘稠，生长形状为圆形，菌落边缘带丝状。

图10为菌株T，菌落颜色呈现出黄色，表面粗糙，凹凸不平，菌落形状为绳索型，边缘整齐。

图11为菌株R，菌落为白色，表面褶皱，整个菌落形态为絮状，菌丝蔓延生长，最终覆盖整个培养基。

2.4.2真菌鉴定结果

(1)粉红色菌株为菌株F，菌株ITS基因序列如SEQ ID NO：1。

(2)黄色菌株为菌株T，菌株ITS基因序列如SEQ ID NO：2。

(3)白色菌株为菌株R，菌株ITS基因序列如SEQ ID NO：3。

实施例3驯化菌对芘、菲、萘、苊的降解

3.1实验材料与方法

3.1.1实验仪器与设备

表4仪器与设备

3.1.2主要试剂与材料

表5实验试剂

3.1.3培养基及溶液的配制

(1)PAHs丙酮溶液：取0.25gPAHs溶于50mL丙酮溶液中，配成5g/L储备液备用。

(2)种子培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水1000mL。

(3)磷酸缓冲溶液：K₂HPO₄·3H₂O 26.12g、KH₂PO₄·H₂O 6.8g、NH₄Cl 5g、Na₂HPO₄·12H₂O35.8g，蒸馏水1000mL。

(4)无机盐培养基：取上述磷酸缓冲液6ml、MgSO₄·H₂O(24.5_g/L)3ml、CaCl₂(1g/L)1ml、FeCl₃(1g/L)2ml、ZnSO₄·H₂O(1g/L)2ml、MnSO₄·H₂O(0.5g/L)1ml，定容至1000mL。

3.2芘、菲、萘、苊的单因素降解实验

本实验研究pH、碳源浓度、非离子表面活性剂浓度对芘、菲、萘、苊降解的影响。改变非离子表面活性剂浓度，测定真菌对低浓度和高浓度PAHs的降解率。

环境pH对微生物的代谢活动有很大影响，最适pH能使其分泌的酶保持较高的活性。PAHs作为本研究中微生物生长的唯一碳源，浓度过高时，PAHs对微生物会产生毒副作用，进而影响微生物的代谢活动。表面活性剂(Surfactant)是一类能显著降低溶剂表面张力或液-液界面张力的物质，能适当增大PAHs在水中的溶解度，进而提高微生物对PAHs的生物利用率。陈曦等研究非离子表面活性剂吐温80对PAHs的增容效应，发现当Tween80浓度高于有效临界胶束浓度(effective critical micelle concentration，CMC)33mg/L时，随着其浓度升高，体系中芘和菲的溶解度显著提高后趋于稳定。研究发现，表面活性剂在强化微生物修复技术方面存在一定风险，使用不当会对环境造成一定污染，对微生物产生一定毒副作用，进而导致处理效果低下。本实验测定了7天内T、R和T+R在初始pH为7，表面活性剂浓度分别为0、300mg/L条件下对芘(50mg/L、100mg/L)、菲(50mg/L、150mg/L)、萘(50mg/L、200mg/L)、苊(50mg/L、200mg/L)的降解率。

3.2.1驯化菌T和R对单一底物芘、菲、萘、苊的降解

(1)制备菌悬液：挑取纯化后的菌株T和菌株R分别放入100mL种子培养基中摇瓶培养，30℃，150r/min振荡培养48h。对20mL培养液，6000r/min离心20min，去掉上清液保留菌体。将分离出的菌体用磷酸缓冲液清洗并离心，去掉可能残留的培养基和菌体表面成分，再用该缓冲液将清洗后的菌体配成5mL菌悬液。取0.5mL浓缩菌悬液并用缓冲液将其稀释10倍，磷酸缓冲液为空白对照，测得菌株T的OD₆₀₀为0.98，R的OD₆₀₀为0.86。

(2)芘降解实验：各取0.5mL 5g/L的芘丙酮溶液分别加入浓度为0mg/L吐温80和300mg/L吐温80的无机盐培养液中，使体系体积为50mL，芘浓度为50mg/L。用纱布封住瓶口，35℃，150r/min振荡培养50min，促使培养液中的丙酮挥发，以减少丙酮对菌体的毒副作用。取2mL浓缩菌悬液加入含50mg/L芘的无机盐培养液中，30℃，150r/min振荡培养，每组设定3个平行实验。测定降解1天、3天、5天、7天的降解率。具体过程：对降解液6000r/min离心25min。去掉菌体收集上清液，用0.22μm滤膜过滤处理，然后用固相萃取仪将溶液中的芘洗脱出来。萃取采用C-18固相萃取柱，二氯甲烷作洗脱溶剂，洗脱速度为2mL/min。洗脱后用恒温水浴锅在60℃下将其浓缩至1mL，然后用二氯甲烷将其稀释到适宜倍数后用紫外可见分光光度计测其吸光度，二氯甲烷为空白对照。绘制芘/二氯甲烷的标准曲线，得出标准方程，计算其降解率。100mg/L芘的降解实验同上。

(3)菲、萘、苊的降解实验同上述芘的降解实验。

3.2.2混合驯化菌T+R对单一底物芘、菲、萘、苊的降解

(1)各取0.5mL 5g/L的芘丙酮溶液分别加入浓度为0mg/L吐温80和300mg/L吐温80的无机盐培养液中，使溶液总体积为50mL，芘的浓度为50mg/L。用纱布封住瓶口，35℃，150r/min振荡培养50min，促使培养液中的丙酮挥发，以减少丙酮对菌体的毒副作用。取上述1mL菌株T的浓缩菌悬液和1mL菌株R的浓缩菌悬液加入到芘浓度为50mg/L无机盐培养液中。30℃，150r/min振荡培养，每组设定3个平行实验。测定降解1天、3天、5天、7天的降解率。用固相萃取仪萃取芘，60℃恒温水浴锅将其浓缩至1mL，再用二氯甲烷将其稀释到一定倍数后测其吸光度，二氯甲烷为空白对照。100mg/L芘的降解实验同上。

(2)混合菌对菲、萘、苊的降解实验同上述芘的降解实验。

3.3均匀设计

通过均匀设计优化降解条件来提高菌株对较高浓度PAHs的降解率。均匀设计(Uniform Design)与正交设计相比，所需实验次数更少。对于实验结果的处理采用回归分析。均匀设计的优点：(1)每个因素每个水平只做一次试验，而且试验次数与水平数相同；(2)当水平数增加时，试验次数按水平数增加的量而增加；(3)可用计算机给出定量方程式，便于分析实验条件对结果的影响，减小误差；(4)大大减少实验次数，提高工作效率，降低成本；(5)便于对有交互作用的因素进行实验研究。均匀设计在军事科学、航空航天方面应用很多，在生化、微生物工程领域也有较多应用。

3.3.1优化设计试验

用菌株R、T和混合菌T+R降解PAHs。微生物生长受到环境pH和碳源的影响，表面活性剂能提高微生物对PAHs的利用度，本研究采用均匀设计对pH、碳源浓度、表面活性剂浓度3个因素进行优化，设计5个水平实验，每组3个平行实验。设计方案如表6，其中pH值的范围是6～10，梯度为1，芘的浓度范围是50～110mg/L，梯度为15，菲、萘、苊的浓度范围是50～250mg/L，梯度为50，吐温80的浓度范围是300～1100mg/l，梯度为200。

表6均匀设计原理

3.3.2单一菌降解芘、菲、萘、苊的优化实验

分析均匀设计结果，找出优化条件，在该条件下测定菌株T和R对高浓度芘、菲、萘、苊的降解。具体实验过程同3.2.1。

3.3.3混合菌降解芘、菲、萘、苊的优化实验

找出混合菌的优化降解条件，在优化条件下测菌株对芘、菲、萘、苊的降解率。具体实验过程同3.2.2。

3.4结果与讨论

3.4.1单因素降解实验

(1)用紫外可见分光光度计测得芘在252nm下的标准曲线方程为y(底物浓度mg/mL)＝0.1271x(吸光度)+0.4285，R²＝0.9991；菲在289nm下测得的标准曲线方程为y＝0.0733x-0.0234，R²＝0.999；萘(283nm)的标准曲线为y＝0.079x+0.0004，R²＝0.999；苊(309nm)的标准曲线为y＝0.0733x-0.0234，R²＝0.9995。

(2)菌株T、R和混合菌T+R在7天内对低浓度芘(50mg/L)、菲(50mg/L)、萘(50mg/L)、苊(50mg/L)的降解率，均达到98％以上，其中添加吐温80后菌株在5天内对低浓度芘、菲、萘、苊的降解率达到98％以上。不添加吐温80的菌株T、R和T+R在7天内对95mg/L芘、150mg/L菲、200mg/L萘和200mg/L苊的降解率低于添加吐温80的降解率，其中混合菌的降解效果优于单一菌的降解效果。添加吐温80的菌株T+R在7天内对95mg/L芘、150mg/L菲、200mg/L萘和200mg/L苊的降解率分别为83.76％，89.65％，96.58％，90.18％。

3.4.2均匀设计结果

(1)均匀设计

以下4个表中的降解率均为降解7天的平均值。

表7芘降解的均匀设计

表8菲降解的均匀设计

表9萘降解的均匀设计

表10苊降解的均匀设计

(2)回归分析及方程建立

分析表7数据，得到菌株T的线性回归方程：y(降解率)＝-131+-10.5X₁+0.464X₂+0.0668X₃，F₁＝1267.0，F_.05(3，1)＝215.71，回归方程显著，复相关系数R＝0.9999。菌株R：y＝-200-4.74X₁-0.728X₂-0.0489X₃，F_t＝47.82，F_.05(3，1)＝215.71，回归方程不显著，复相关系数R＝0.9965。可能这三个因素变动对菌株R降解芘的影响在统计学上不显著＝＝。菌株T+R：y＝-130+12.3X₁+0.338X₂+0.0662X₃，F_t＝38828.7，F_.05(3，1)＝215.71，回归方程显著，复相关系数R＝1.000＝＝。

上述回归方程中，X₁为pH，X₂为碳源浓度，X₃为吐温80浓度。

(3)均匀设计优化结果分析

综合单因素实验结果，并考虑生产成本，确定降解条件。pH为7，吐温80为700mg/L时菌株T对95mg/L芘、150mg/L菲、200mg/L萘和200mg/L苊的降解在7天内达到理想效果，如图12。

菌株R适于中性或偏碱性环境，其中最适pH为8，吐温80为700mg/L时对95mg/L芘、150mg/L菲、200mg/L萘和200mg/L苊的降解在7天内达到理想效果，如图13。

混合菌T+R在pH为8，吐温80为700mg/L时对95mg/L芘、150mg/L菲、200mg/L萘和200mg/L苊的降解在7天内达到理想效果，如图14。

3.5小结

(1)本实验通过均匀设计优化，得出菌T和R对高浓度芘、菲、萘、苊的最适降解条件。

(2)菌T对芘(四环PAH，比菲、萘、苊难降解)的降解率高于R，这两株菌对菲、萘、苊的降解效果相当。

(3)微生物降解PAHs是一个极其复杂的过程，环境中PAHs降解是多种微生物共同作用的结果。菌株T和R以1∶1比例加入到含PAHs的无机盐培养液中，两株菌混合后加强了对PAHs降解作用，尤其对芘的降解率有很大提高。从上述降解图可见这两株菌在降解芘、菲、萘、苊时是协同作用，提高了降解效率。

实施例4微生物絮凝剂性能

4.1材料与方法

4.1.1主要试剂

表11试剂与材料

4.1.2分离筛选及絮凝率测定

将两菌株进行发酵培养。培养基：葡萄糖10g、酵母膏0.5g、KH₂PO₄1.8g、K₂HPO₄6.0g、MgSO₄·7H₂O 0.3g、NaCl 0.1g、尿素0.5g、蒸馏水1000ml，pH为7，121℃灭菌15min。在30℃、150r/min的摇床中培养2d。从100mL菌液取1mL，放入99mL新鲜培养基，培养2d。取发酵液测絮凝率，两株菌的絮凝率均达到80％。絮凝率测定方法：在100ml高型烧杯中加入4g/L高岭土悬浊液95mL及5mL 1％(W/V)CaCl₂溶液和2mL发酵液，用磁力搅拌器搅拌(200r/min快速搅拌5min，80r/min慢速搅拌2min)，静置5min。对照组用2ml蒸馏水替代。取中间液层测定600nm吸光度，确定发酵液或絮凝剂的絮凝活性(用絮凝率表征)：

絮凝率(％)＝(A-B)/A×100％

其中：A--对照组的OD₆₀₀，B--待测样品的OD₆₀₀。

4.1.3影响絮凝率的单因素研究

本实验中发酵培养的初始pH为7，培养时间为2d，培养温度为30℃，碳源为葡萄糖。

(1)pH对絮凝率的影响：测定菌株T和R初始pH为5、6、7、8、9、10条件下的絮凝率。

(2)时间对絮凝率的影响：测定菌株T和R不同发酵时间的絮凝率，选取培养6h，12h，24h，36h，48h，72h的发酵液测定其OD₆₀₀和絮凝率。

(3)温度对絮凝率的影响：培养48h，测定20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃这六个培养温度的絮凝率。

(4)碳源的影响：改变初始培养基中的碳源。研究葡萄糖、蔗糖、果糖、鼠李糖对菌株T和R絮凝活性的影响。

4.2结果与讨论

4.2.1 pH对絮凝率的影响

图15可见菌株T和R在pH5～8之间，絮凝率逐渐增大，之后絮凝率开始下降，这两株菌在pH为8时达到最佳絮凝状态。菌株T在偏碱性环境中的絮凝率比R高。

4.2.2时间对絮凝率的影响

图16可见这两株菌在12～48h内处于对数生长期，48～72h之间处于稳定状态。菌株R在发酵36h后达到最佳絮凝活性，菌株T在发酵48h后絮凝活性最大。之后随着发酵时间延长，絮凝率呈现下降趋势。

4.2.3温度对絮凝率的影响

图17可见菌株T和R的最佳絮凝温度为30℃，温度范围为20～30℃之间时絮凝活性逐渐增大，30℃后絮凝率逐渐降低。

4.2.4碳源对絮凝率的影响

图18可见培养基中碳源变化时，菌株T和R的絮凝活性有所改变。当碳源为蔗糖时，菌株T有最大絮凝活性，碳源为葡萄糖时，菌株R絮凝活性最佳。菌株T对碳源的利用顺序为蔗糖、葡萄糖、果糖、鼠李糖。菌株R对碳源的利用顺序为葡萄糖、蔗糖、果糖、鼠李糖。

4.3菌株T和R的絮凝照片

图19为菌株T在pH为8，发酵温度30℃，碳源为蔗糖，发酵培养2d后对高岭土的絮凝状态；菌株R在pH8，温度30℃，碳源为葡萄糖，发酵培养36h后对高岭土的絮凝状态，可见发酵后的菌株使高岭土浑浊液变澄清，这两株菌有较好的絮凝活性。

4.4小结

(1)T和R都有较好的絮凝效果，絮凝活性均达80％以上。

(2)T和R的最佳絮凝pH为8，在偏酸性条件下絮凝效果较差，在偏碱性环境中仍有较高的絮凝活性。

(3)菌株T培养48h，菌株R培养36h，各自达到最高絮凝率。

(4)25℃～30℃范围内T和R有较高的絮凝活性，20℃和35℃的絮凝活性相当，35℃后絮凝活性下降较快，45℃时絮凝率约为30％。

(5)菌株T对蔗糖有较高的利用率，葡萄糖为碳源时菌株R能达到最大絮凝活性。

实施例5真菌絮凝剂对芘、菲、萘、苊的降解性能

5.1材料与方法

5.1.1主要试剂与材料

表12试剂与材料

5.1.2单一絮凝菌对芘、菲、萘、苊的降解

(1)制备菌悬液：挑取纯化后的菌T和R分别放入100mL初始pH为7和8的培养基中进行摇瓶培养。其中菌株T以蔗糖为碳源，30℃，150r/min振荡培养48h，菌株R以葡萄糖为碳源，30℃，150r/min振荡培养36h。取中间层发酵液10mL(含菌体)，6000r/min离心15min，去掉上清液，菌体用去离子水稀释10倍，测其吸光度，去离子水作为空白对照。测得菌株T的OD₆₀₀为1.2，菌株R的OD₆₀₀为0.96。

(2)微生物絮凝剂制备：发酵液4000r/min离心20min，取上清液加入4倍体积的预冷无水乙醇，4℃放置4h后有淡黄色沉淀析出，12000r/min离心5min，去掉上清液，收集沉淀物，80℃烘干24h，所得固体为絮凝剂。

芘降解实验：按均匀设计得出的优化降解条件，用粗提取的微生物絮凝剂降解95mg/L芘。取1mg/mL絮凝剂水溶液2mL加入到芘的无机盐培养液中，溶液总体积为50mL。用纱布封住瓶口，35℃，150r/min振荡培养50min，促使培养液中的丙酮挥发，以减少丙酮对菌体的毒副作用。30℃，150r/min振荡培养，每组设定3个平行实验。测定降解1天、3天、5天、7天的降解率。具体过程：降解液6000r/min离心25min。去掉菌体收集上清液，用0.22μm滤膜过滤处理，然后用固相萃取仪将溶液中的芘洗脱出来。萃取采用C-18固相萃取柱，二氯甲烷作洗脱溶剂，洗脱速度为2mL/min。洗脱后用60℃恒温水浴锅将其浓缩至1mL，然后用二氯甲烷将其稀释到适宜倍数后用紫外可见分光光度计测其吸光度，二氯甲烷为空白对照。绘制芘/二氯甲烷的标准曲线，得出标准方程，计算其降解率。

(3)菲、萘、苊的降解实验同上述芘的降解实验。

来源于菌株T的絮凝剂水溶液(1mg/mL)来源于菌株絮凝剂水溶液(1mg/mL)5.2结果与讨论

本实验采用制备的真菌絮凝剂，按上述3.3中均匀设计得出的最优降解条件测定了T和R絮凝剂对95mg/L芘、150mg/L菲、200mg/L萘、200mg/L苊的降解率(图20)。纯化絮凝剂对这4种底物有一定的去除率，反应7天的去除率均在35％以上。对两环的萘降解效果最好，

其次是菲，苊，芘。从T提取的絮凝剂比R提取的絮凝剂效果更好，尤其是对苊。PAH的降解需要真菌细胞内的降解酶系催化，推测这两株菌的降解酶可能分泌到胞外，故提取的絮凝剂可能含有降解酶。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种红豆杉根际多环芳烃降解菌踝节菌，其特征在于，所述踝节菌于2014年11月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC No.M 2014542。

2.根据权利要求1所述踝节菌在去除环境中PAHs污染物过程中的应用。