CN105733953B - 一种产漆酶真菌菌株的分离优化方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产漆酶真菌菌株的分离优化方法及应用，利用愈创木酚能够与漆酶发生变色反应筛选产漆酶真菌，根据形态观察和rDNA‑ITS序列分析鉴定出疣孢漆斑菌。专利保藏菌株疣孢漆斑菌是高产漆酶菌株，优化后所产漆酶酶活达到316U/mL，高于曾报道疣孢漆斑菌NF‑05酶活45.08U/mL，其酶活和对九种活性染料的脱色率远高于产漆酶的踝节菌属、曲霉菌属和小丛壳菌。通过单因素实验、均匀设计确定了疣孢漆斑菌产漆酶的最优条件。利用HPLC、TLC和红外光谱证实了疣孢漆斑菌对活性绿19的降解。从红豆杉根际分离的真菌在工业污水治理，绿色交通，环境保护和可持续发展方面都有很好的应用前景与潜力。

Description

一种产漆酶真菌菌株的分离优化方法及应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种产漆酶真菌菌株的分离优化方法及应用。

背景技术

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，能够催化降解多种有机化合物，例如对部分蒽醌类和偶氮类染料具有较高的转化效率。随着科技发展以及各学科交叉综合程度的逐渐加深，漆酶的研究日益完善，在各领域中的应用技术也逐渐成熟。漆酶资源种类丰富，自然界中蕴含量大，人们对一些动植物漆酶进行了研究，对某些微生物漆酶也有所了解，但对绝大多数微生物漆酶所知甚少，相关资源有待进一步开发。目前红豆杉根际微生物报道甚少，郝大程等从曼迪亚红豆杉根际筛选出紫杉烷木糖苷去糖微生物，并发现中国不同地区红豆杉根际细菌群落组成具有区域多样性的特点；任嘉红从南方红豆杉根际土壤中分离出具有溶磷能力的细菌，并对其进行了温室盆栽试验。红豆杉根际是否有高产漆酶微生物值得研究。研究者通过一系列优化方法提高漆酶活性，使其更好的应用到工程领域。漆酶在印染废水处理、造纸废水处理、生物传感器研发和医学等方面具有高效、经济、清洁环保等优点。红豆杉根际资源的功能潜力有待深入挖掘，从红豆杉根际土壤中分离产漆酶菌株具有潜在应用价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种产漆酶真菌菌株的分离优化方法。该方法通过研究从药用植物根际土壤筛选的产漆酶且性能优良的菌株，拓宽了漆酶筛选的来源，为漆酶工业化生产及应用提供一些理论和技术支持，为药用植物根际微生物在环境保护和可持续发展中的应用提供理论基础。

其具体技术方案为：

一种产漆酶真菌菌株的分离优化方法，包括以下步骤：

取1mL富集培养液，加入装有9mL无菌水的试管中混匀，制成10^-1稀释度的菌悬液；然后从此试管中吸取1mL加入另一盛有9mL无菌水的试管中混匀，制成10^-2稀释度的菌悬液，以此类推制成10^-3-10^-7不同稀释度的菌悬液并编号；取10^-3-10^-7稀释度的菌悬液各100μL涂布在含有愈创木酚培养基的平板上，室温条件下静置5～10min，倒放置于28℃恒温培养箱中培养7d；每个梯度做3个平行样；

通过颜色变化，选取平板上棕红色的单菌落并作出标记，对标记的菌落进行分离纯化，将纯化好的菌株接种PDA斜面培养基，4℃保存；

平板初筛：纯化好的菌株接种到含有愈创木酚的PDA培养基，观察其是否产生红棕色变色圈，经过形态观察及rDNA-ITS序列分析鉴定出筛选的菌株为疣孢漆斑菌；

摇瓶复筛：将初筛菌株转接到PDA培养基，28℃恒温培养7d，用无菌刀切割成直径为1cm的菌饼，接入100ml产酶培养基，30℃、130r/min恒温振荡7d。发酵液在12000r/min下离心5min，上清液为粗酶液，测定粗酶液的酶活。对疣孢漆斑菌进行优化培养，培养基为蔗糖30g/L，蛋白胨8g/L，CuSO₄1mmol/L，MgSO₄2g/L，KH₂PO₃1.5g/L。

进一步，所述疣孢漆斑菌于2014年11月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC No：M 2014543。

本发明所述疣孢漆斑菌在处理颜料废水污染中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明菌株的脱色效率最好，对于活性翠蓝最高的脱色效率可达95％以上。本研究初步揭示出从植物根际分离的真菌在工业污水治理，绿色交通，环境保护和可持续发展方面都有很好的应用前景与潜力。

保藏信息

疣孢漆斑菌DJTU-sh7(Myrothecium verrucaria strain DJTU-sh7)，已经保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2014543，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2014年11月2日。

附图说明

图1是研究方案和技术路线；

图2是用TLC(薄层色谱)分析菌株H(疣孢漆斑菌)对活性绿19的降解，图2A为甲醇∶正丁醇∶水＝8∶1∶1(5％乙酸)；图2B为甲醇∶正丁醇∶丙酮∶水＝8∶1∶1∶1(5％乙酸)；图2C为甲醇∶丙酮：水＝4∶1∶1(5％乙酸)；图2D为甲醇∶丙酮∶水＝4∶1∶1(5％乙酸)，其中，a：100mg/L活性绿19原溶液；b：脱色培养基液体氯仿相，可见产物蓝色亮斑；c：脱色培养基液体水相；

图3是液相色谱实验结果，其中图3(a)为活性绿19；图3(b)降解产物有机相；

图4为红外光谱实验结果，其中，图4(a)活性绿19，图4(b)疣孢漆斑菌降解活性绿19的代谢产物；

图5为初筛培养基产漆酶菌的菌落；

图6为四株分离菌株变色圈反应，其中图6(a)：DX，图6(b)：H，图6(c)：N，图6(d)：DC；

图7为四株分离菌株的菌落形态，其中，图7(a)：DC，图7(b)：H，图7(c)：DX，图7(d)：N；

图8为PCR扩增ITS的琼脂糖凝胶电泳图；

图9为菌株的产酶进程；

图10为菌丝的干重；

图11为不同碳源对四种菌株漆酶活力的影响；

图12为不同氮源对四种菌株漆酶活力的影响；

图13活性翠蓝的脱色效果；

图14活性深蓝的脱色效果；

图15活性藏青的脱色效果；

图16活性艳红的脱色效果；

图17活性艳蓝xbr的脱色效果；

图18活性绿19的脱色效果；

图19活性黑5的脱色效果；

图20活性艳蓝k3r的脱色效果；

图21活性艳橙的脱色效果；

图22四种菌对活性绿19脱色效果的照片；

图23 H菌株对活性染料的脱色效果；

图24 DX菌株对活性染料的脱色效果；

图25 DC菌株对活性染料的脱色效果；

图26 N菌株对活性染料的脱色效果；

图27 pH对脱色率的影响；

图28温度对脱色率的影响；

图29染料浓度对脱色率的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。

实施例1活性绿19降解

1.1实验试剂

活性绿19(97％)，CAS号：61931-49-5(Sigma R9378)

1.2培养基

蔗糖30g/L，蛋白胨8g/L，CuSO₄1mmol/L，MgSO₄2g/L，KH₂PO₄1.5g/L，pH 6.0，FeSO₄0.05g/L，定容至1L.

1.3活性绿19的降解实验

本实验通过均匀设计优化，提高了微生物对高浓度底物的降解率，测定了H菌株疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)在7天内对30mg/L的活性绿19的降解效果。

菌悬液的制备：在紫外灭菌的超净实验台上，纯化的疣孢漆斑菌株接种量5％加入100mL培养基内，28℃，130r/min培养4d。

活性绿19的降解实验：用紫外可见分光光度计对染料水溶液进行全波长扫描(200nm-800nm)，确定染料溶液在可见光区的最大吸收波长。取1mL菌株H悬浮液和1mL200mg/L活性绿19溶液加入超纯水中，使体系体积为10mL，活性绿19浓度为20mg/L，每组实验重复三次，28℃，130r/min培养4d，测定脱色率。

1.4TLC检测降解产物

具体过程：取H菌株降解活性绿19培养液，7500r/min离心4min，取上清液并将pH调至5，按照1∶1的比例加入氯仿和上清液，用分液漏斗进行萃取，收集有机相和水相溶液，用旋转蒸发仪对有机相和水相进行浓缩，用氮吹仪吹干后分别溶解在1ml氯仿和1ml甲醇，用TLC分析，结果用紫外灯(365nm)观察。

1.5HPLC(高效液相色谱)检测降解产物

将TLC得到的有机相和水相用有机滤膜过滤，活性绿19溶解到甲醇中目标浓度为20mg/L。色谱条件：色谱柱为C18柱，250×4.6×5μm，柱温30℃，进样量5μL，流速1mL/min，流动相水/乙腈，紫外检测波长632nm，洗脱梯度表1：

表1

1.6红外光谱

实验试剂和仪器：可见光分光光度计722N(上海精密科技仪器有限公司)；上海山岳科学仪器有限公司YP-2压片机；天津光复精细化工研究所KBr(光谱纯)。

实验方法：底物和光谱纯KBr以5∶95比例混合，疣孢漆斑菌降解活性绿19代谢产物用C18柱进行固相萃取得到的液体滴加到KBr压片上，样品固定在架上，在400-4000cm^-1中红外区扫描，分别得到活性绿19的原样品和疣孢漆斑菌降解活性绿19产物的红外光谱图。

1.7TLC结果

用TLC分析菌株H对活性绿19的降解(图2)。a：100mg/L活性绿19原溶液；b：脱色培养基液体氯仿相，可见产物蓝色亮斑；c：脱色培养基液体水相。

上述实验是将染料原溶液和其菌液处理后的液体在不同展开剂中得到的TLC结果。展开剂的极性与被分离的染料极性之间有着非常密切的关系。活性绿19是含有六个钠的磺酸盐，是极性分子，极易溶于水，图中可见当甲醇：丙酮：水＝8∶1∶1(5％乙酸)时结果最佳。

可以看出经过菌液处理后染料由绿色变成无色，在UV光下观察TLC可以看到明显的产物蓝色亮斑。芳香胺在偶氮染料脱色后有机相萃取物中常见。与对照比较，脱色后底物明显减少。

1.8HPLC结果

液相色谱仪型号：安捷伦1200。

如图3所示，可见三个明显的产物峰，其中底物活性绿19(20mg/L)出峰时间1.673min；产物a出峰时间为1.338min，产物b出峰时间1.955min，产物c出峰时间2.134min。从图中可见产物峰分的并不是很开，出峰时间比较靠近，大概是因为产物和底物极性都很大，C18柱不能很好的分开，需要特定柱子才能分开。

1.9红外光谱结果

如图4所示，比较底物和降解产物的红外谱图，发现在722cm^-1(烯烃类OH弯)、1193cm^-1和1014cm^-1(磺酸基团)、1622cm^-1(C-NH₂)等位置峰消失，C-NH₂消失说明偶氮键断裂，活性绿19是含有六个钠的磺酸盐染料，磺酸基团和偶氮键消失，说明染料被降解。

实施例2产漆酶菌株的分离与筛选

2.1实验材料

2.1.1实验试剂与材料

筛选菌种来源：选取大连曼地亚红豆杉、东北红豆杉变种矮紫杉、南京南方红豆杉和青海海东冬虫夏草的根际5-10cm深处土壤。

2.1.2培养基及溶液配制

(1)富集培养基：蔗糖30g，CuSO₄·5H₂O 0.5g，NaNO₃2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，K₂HPO₄1.0g，FeSO₄0.01g，KCl 0.5g，蒸馏水1000mL，pH自然，115℃灭菌15min；

(2)菌种纯化及保藏培养基(PDA培养基)：马铃薯20％，葡萄糖2％，KH₂PO₄3g，琼脂2％，MgSO₄-7H₂O 2g，VB₁微量，定容至1L，自然pH，121℃灭菌20min，等培养基温度降至70℃加入青霉素50μg/mL，链霉素100μg/mL；

(3)初筛培养基：PDA培养基，琼脂15g，121℃灭菌20min。加入愈创木酚溶液(过滤除菌法处理)，终浓度为0.04％；

(4)复筛培养基：液体PDA培养基，CuSO₄·5H₂O 0.1mmol/L，PH自然，121℃灭菌20min；

(5)液体产酶培养基：葡萄糖20g，酒石酸铵10g，KH₂PO₄2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，无水CaCl₂0.075g，CuS04·5H₂O 0.01g，PH自然，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。

2.2实验方法

2.2.1产酶菌株的富集

取10g土壤，40℃烘干箱内烘干6h后加入装有100mL无菌水的250mL锥形瓶中，瓶中含灭菌后的玻璃珠若干，30℃、130r/min振荡24h。取10mL土壤悬浮液，加入装有100ml富集培养基的250ml锥形瓶内，30℃、130r/min振荡5d。

2.2.2产漆酶菌株分离纯化

本实验以愈创木酚为底物，根据变色反应判断菌株是否产生漆酶，并对产漆酶菌株进行分离纯化。

取1mL富集培养液，加入装有9mL无菌水的试管中混匀，制成10^-1稀释度的菌悬液；然后从此试管中吸取1mL加入另一盛有9mL无菌水的试管中混匀，制成10^-2稀释度的菌悬液，以此类推制成10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7不同稀释度的菌悬液并编号；取10^-3-10^-7稀释度的菌悬液各100μl涂布在含有愈创木酚培养基的平板上，室温静置5～10min，倒放置28℃恒温培养箱中培养7d。每个梯度做3个平行样。

选取平板上颜色变为棕红色的单菌落并作出标记，将标记的菌落进行纯化，28℃培养7d，挑取单菌落平板划线三次，保证得到的菌株为纯菌株，4℃保存。

2.2.3产漆酶菌株的筛选

(1)平板初筛：纯化好的菌株接种到含愈创木酚的PDA培养基中，验证其是否产生棕红色变色圈。

(2)摇瓶复筛：将初筛菌株转接种到PDA培养基中，28℃培养7d，用无菌刀切割成直径为1cm的菌饼，接入装有100ml产酶培养基的锥形瓶内，30℃、130r/min振荡培养7d，发酵液在12000r/min下离心10min，上清液为其粗酶液，测定其酶活，选取酶活相对高的菌株进行后续研究。

2.2.4酶活测定方法

用琥珀酸钠(50mmol/L，pH 4.5)作为缓冲液。10mL反应体系包括1mL溶有0.04mmol愈创木酚的95％乙醇，1mL粗酶液和8mL琥珀酸钠缓冲液)，30℃水浴锅内反应30min后，于465nm处测定吸光度。以含灭活酶液(沸水浴5分钟)的反应混合液为对照。

粗酶液酶活单位定义：1min内催化氧化1nmol愈创木酚的酶量为1个酶活单位(U)。计算公式：酶活(U/mL)＝10⁶×V_总×ΔA/(V_酶×ε×Δt)，其中V_总、V_酶分别代表反应体系总体积及酶液体积，ε为吸光系数，愈创木酚的ε₄₆₅＝1.21×10⁴mol^-1/L/cm^-1)

2.3实验结果

2.3.1漆酶高产真菌的分离与筛选

初次分离的情况如图5所示。

最终分离纯化出四种菌株(图6)：曲霉菌属(Aspergillus，简称DX，来自虫草根部土壤)、小丛壳菌(Glomerella，简称DC，来自矮紫杉根际)、疣孢漆斑菌(H，来自曼地亚红豆杉根际，保藏号为CCTCC No.M 201453)、踝节菌属(Talaromyces stollii，简称N，来自南方红豆杉根际)。

2.3.2实验结果和讨论

本研究选择红豆杉等药用植物根际土壤作为菌源，利用含愈创木酚的选择性培养基对漆酶高产菌株进行分离与筛选。在纯化筛选的过程中注意以下几点：一，将土壤放在40℃烘干箱烘干6小时可以去除一些细菌；二，配制的土壤悬液稀释浓度控制在一定范围，避免浓度过高时细菌对真菌产生抑制作用，过低时有些非优势真菌被去除掉；三，一定浓度抗生素能抑制细菌生长但真菌对其不敏感，涂布菌悬液前事先在平板上涂布一定浓度的青霉素和链霉素，这样可提高筛选真菌的成功率而且能避免细菌抑制真菌的生长。

小结

红豆杉等药用植物根际土壤采用加入愈创木酚的PDA培养基作为筛选培养基，通过其产生的变色圈来分离产漆酶真菌，并对其进行酶活测定，最后筛选出四株具有漆酶活性的真菌，分别命名为DC、H、N、DX。后续利用分子生物学与形态学相结合的鉴定方法来确定菌株的种属。

实施例3红豆杉根际土壤产漆酶菌株的系统分类学鉴定

3.1培养基、溶液及缓冲液

(1)10×TBE Buffer(pH8.3)：Tris108g，硼酸55g，Na₂EDTA·2H₂O 7.44g，去离子水定容至1L，常温下保存。

(2)溴乙锭EB(10mg/mL)：溴乙锭1g，去离子水100mL，棕色瓶中室温避光保存。工作浓度为0.5μg/mL。

(3)琼脂糖(1％)：1×TBE缓冲液100mL，琼脂糖1g，10mg/mL EB5μL。

(4)蛋白酶K：母液浓度为20mg/L，在-20℃下保存。

3.2菌株分子鉴定

用宝生物试剂盒Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 5.0提取四种菌株的基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检查提取的DNA。采用通用引物ITS1-1737F：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG和ITS2-2043R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC对四种真菌的ITS进行扩增。PCR程序：95℃5min；94℃30s，56℃1min，72℃3min，35个循环；72℃5min，4℃保存。对扩增产物进行电泳检测，送大连宝生物公司测序。用NCBI BLAST工具比对分析测序结果。

3.3形态观察

子实体形态观察是最传统的分类学方法。将分离出的四种纯菌株在无菌条件下接种到PDA平板培养基上，在28℃培养，等到菌株开始长出菌丝，肉眼观察菌落外部特征：颜色、大小和形状等；并在电子显微镜下观察菌株的微观特征。

3.4实验结果与讨论

3.4.1产漆酶菌株形态观察

将筛选出的四种菌株接种到PDA培养基上，观察四种菌株生长的形态(图7)。(1)H菌株：生长密集，淡黄色褶皱状，表面粘稠。(2)DC菌株：菌落为乳白色绒毛状，稀松生长在培养基表面，不规则圆形。(3(N菌株：菌落表面为淡绿色，生长旺盛，铺满平板。(4)DX菌株：菌落为深棕色，表面粗糙，凹凸不平成绒毛状，按照z字形生长。

3.4.2产漆酶菌株的ITS测序结果与系统发育树构建

(1)待测菌株ITS的PCR扩增产物处于250bp和1000bp之间(图8)，切胶回收用于测序。

(2)四株菌的ITS序列，如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6所示。

＞H：

ACTGCGGAGGATCATTATCTATTCCATGAGGTGCGGTCGCGGCCCTCGGC

GGGAGCAACAGCTGCCGTCGGGCGGTAGAGGTAACACTTTCACGCGCCGC

ATGTCTGAATCCTTTTTTTACRAGCACCTTTCGTTCTCCTTCGGCGGGGC

AACCTGCCGTTGGAACCTATCAAAACCTTTTTTTTGCATCTAGCATTACC

TGTTCTGATACAAACAATCGTTACAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGCT

CTGGCATCRATRAAGAAC GCAGCAA

＞DC：

AGTGACTGCGGAGGGACATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGAACCTCT

CGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCT

TGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGT

AATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCAACAACG

GATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGC

＞DX：

ACTGCGGAGGATCATTACTGAGTGCGGGCTGCCTCCGGGCGCCCAACCTC

CCACCCGTGAATACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAACCCCCTCGGGG

GCGAGCCGCCGGGGACTACTGAACTTCATGCCTGAGAGTGATGCAGTCTG

AGTCTGAATATAAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTC

CGGCATCGATRAAGAACGCAGCA

＞N：

GTGACTGCGGAGGATCATTACCGAGTGCGGGCCCCTCGTGGCCCAACCTC

CCACCCTTGTCTCTATACACCTGTTGCTTTGGCGGGCCCACCGGGGCCAC

CTGGTCGCCGGGGGACGTTCGTCCCCGGGCCCGCGCCCGCCRAAGCGCTC

TGTGAACCCTGATRAAGATGGGCTGTCTGAGTACTATRAAAATTGTCAAA

ACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCRATRAAGAACGCAGC

小结

对筛选出的四株产漆酶菌株进行分子生物学及形态学鉴定，结果：菌株DC为小丛壳菌属；菌株DX为曲霉菌属；菌株H为疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria，保藏号CCTCCNo.M 2014543)；菌株N为踝节菌属。

目前对小丛壳菌、曲霉菌属和踝节菌属的产漆酶菌株尚无报道。本实验发现这几属能够产生漆酶，有望用于处理印染废水。疣孢漆斑菌的研究主要有两个方面，一是植物病原菌，二是能产生胆红素氧化酶，关于其产漆酶的报道很少。上述真菌在处理染料废水污染方面具有很好的应用潜力。

实施例4产漆酶培养条件的优化

4.1材料和方法

4.1.1菌种

踝节菌属菌株N分离自南方红豆杉根际土壤，曲霉菌属菌株DX分离自青海海东冬虫夏草根际土壤，小丛壳菌属菌株DC来源于矮紫杉根际，保存于大连交通大学微生物实验室；疣孢漆斑菌菌株H分离自大连曼地亚红豆杉根际，保存在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为疣孢漆斑菌CCTCC M2014543。

4.1.2培养基

(1)平板活化培养基(PDA)：葡萄糖20g，KH₂PO₄3g，马铃薯200g煮汁，CuSO₄0.05g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，琼脂15g，VB₁微量，定容至1L，自然pH；

(2)液体初始实验基础培养基：葡萄糖20g，蛋白胨4g，KH₂PO₄3g，uSO₄0.05g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，定容至1L，自然pH。

4.1.3实验方法

(1)菌株活化：在超净实验台上，无菌条件下用接种环挑取菌丝体，接种至平板活化培养基上，28℃培养7d活化菌株以备用。

(2)悬浮液制备：在紫外灭菌的超净实验台上，取100mL种子培养基装入250mL三角瓶，菌株接种量5％，28℃，130r/min振荡培养4d。

(3)菌株产漆酶发酵条件的优化

1)碳源

将产酶培养基中的蔗糖分别替换为葡萄糖，麦芽糖，乳糖，果糖和可溶性淀粉。250mL三角瓶中装入100mL的产酶培养基，121℃灭菌20min后接种四种真菌，28℃，130r/min振荡培养8d，测量酶活，每组实验重复三次。

2)氮源

在最适碳源条件下将产酶培养基中的蛋白胨分别替换为酵母膏，牛肉膏，氯化铵，硝酸铵，硫酸铵，尿素。250mL三角瓶中装入100mL的产酶培养基，121℃灭菌20min后接种四种真菌，28℃，130r/min振荡培养6d，测量酶活，每组实验重复三次。

3)培养时间

在250mL三角瓶中装入100mL的含最适碳源、氮源的产酶培养基，121℃灭菌20min后分别接入四种真菌，28℃，130r/min振荡培养10d，按时间点测酶活，每组实验重复三次。

(4)均匀设计

根据单因素实验结果，选取六因素十水平共10个实验点的方案，实验因素及水平如表2所示。实验序号来自均匀设计表U(10)及其使用表。

4.2实验结果与分析

4.2.1单因素实验

(1)时间影响及菌丝重量以20g/L葡萄糖为碳源，分别加入5g/蛋白胨，装液量70mL，真菌接种量5％，28℃、120r/min摇床发酵培养，每天取样测漆酶活力。在发酵初期，菌丝生长较慢，摇瓶内菌丝球较小，发酵液中漆酶活性很低。随着发酵时间增加，菌丝进入快速生长期，菌丝球致密，直径变大，发酵液变澄清粘稠，H/DX菌株在第六天时漆酶活性最高，DC在第五天时酶活性最高，N在第七天时酶活性最高。四种菌株的漆酶活性都随时间变化先增加后减小。如图9和图10所示。

(2)碳源在液体培养基中分别以20g/I蔗糖、葡萄糖，麦芽糖，乳糖，果糖，可溶性淀粉作为碳源，其它成分保持不变，装液量100mL/250mL，菌体接种量5％，于28℃、130r/min条件下培养。按照各菌株最佳产漆酶时间测定酶活。不同的碳源影响真菌漆酶的产量，果糖作为碳源时，四种真菌的漆酶活力都很低，蔗糖作为碳源时，四种真菌漆酶产量均高，无论碳源选择哪种，H菌始终是四种菌株里产酶活力最高的(图11)。

(3)氮源以20g/L蔗糖为碳源，分别加5g/L NH₄NO₃、(NH₄)₂SO₄、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、尿素作为氮源，装液量100mL/250mL，菌体接种量5％，于28℃、130r/min培养，按照各菌株最佳产漆酶时间测定酶活。以蛋白胨作为氮源时漆酶活性最佳，其次是酵母膏作为氮源，四种菌株中H菌株的漆酶活力始终最高(图12)。

4.2.2均匀设计

均匀设计是一种科学有效的统计学实验，优化多因素多水平问题时，布点均匀且实验次数大大减少，能全面优化实验结果。通过单因素实验筛选出最佳碳源、氮源和测定时间。以蔗糖作为碳源，氮源选用蛋白胨，根据前人研究和实际情况，培养基中

MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、CuSO₄·5H₂O及pH是主要影响因素。对蔗糖(X₁)，蛋白胨(X₂)，pH(X₃)，MgSO₄·7H₂O(X₄)、KH₂PO₄(X₅)、CuSO₄·5H₂O(X₆)采用均匀设计软件Uniform DesignVersion 3.0设计出6因素10水平的实验方案，共计10组试验，步长为0.5，均匀性偏差D0.2294，考察各因素之间相互影响。锥形瓶内装液量为100mL/250mL，H菌株接种量5％，30℃，130r/min培养，第五天时测酶活，对实验结果进行统计回归分析，得到最优培养基。

表2均匀设计实验分布与结果

利用均匀设计软件得到如下结果：回归方程：y＝b₀+b₁×X₁+b₂×X₂+b₃×X₃+b₄×X₄+b₅×X₅+b₆×X₆

表3均匀设计回归系数

表4均匀设计方差分析

回归显著性检验：F检验临界值F.₀₅(6，3)＝2.4218，F检验值F_t＝3.6908大于临界值，表现为显著，复相关系数R＝0.9385。则Y＝-41.97+3.479X₁+3.371X₂+24.764X₃+11.09X₄+4.97X₅+8.79X₆

根据线性回归方程，理论最大漆酶酶活为512.82U/mL，但实际测得值仅为12.58±0.53U/mL，可能是pH取最大值9时显著抑制酶活。综合单因素实验结果，并考虑生产成本，确定蔗糖30g/L(X₁)，蛋白胨8g/L(X₂)，pH6(X₃)，CuSO₄1mmol/L(X₄)，MgSO₄2g/L(X₅)，KH₂PO₄1.5g/L(X₆)，为H菌株产漆酶最优培养基。

4.2.3均匀设计验证实验

优化后的培养基组成为蔗糖30g/L，蛋白胨8g/L，CuSO₄1mmol/L，MgSO₄2g/L，KH₂PO₄1.5g/L，优化后的最适条件：接种量为5％，培养基初始pH6.0，培养温度28℃，装液量100mL/250mL，摇床转速130r/min，做10组平行发酵实验，5d后测定酶活。结果表明，在优化条件下，H菌株的产酶水平重复性较好，测定结果稳定在300U/mL以上，表明优化实验结果具有较高的可信度。

用最优培养基进行验证，预测的酶活为316.047U/mL，实际值(299.87U/mL)与预测值的误差为5.06％。初始培养基条件下漆酶酶活为216.2U/mL，优化值是初始值的1.46倍。说明预测模型可靠性较高，可用于H菌株漆酶发酵条件的优化。

4.2.4讨论

本研究目的是确定四个产漆酶菌株最佳产酶条件，只采用单因素的方法不能全面考查，传统优化方法如正交设计等实验周期长工作量大、实验重复次数过多，优化的条件参数偏少。均匀设计的数学基础完善，可以同时考查的影响因素较多，实验次数较少。本研究通过均匀设计，以漆酶活性为优化目标，通过软件分析得到显著因子和回归方程。均匀设计与正交实验相比，一方面实验次数大大减少，可精确研究试验指标各因子水平及其交互作用，另一方面能快速有效的确定含有多因素水平系统的最佳条件。实验结果表明，蔗糖、MgSO₄和蛋白胨对产酶水平均影响显著，其诱导效果更好。KH₂PO₄对疣孢漆斑菌H产酶影响十分显著，可能是较理想的诱导剂。目前已知的产漆酶真菌主要是白腐真菌，关于疣孢漆斑菌的报道很少，己发现的疣孢漆斑菌NF-05酶活45.08U/mL，本研究发现的疣孢漆斑菌株H优化后酶活达300U/mL以上，明显高于以往报道。因此，疣孢漆斑菌H可作为漆酶理论研究及工业化生产的菌株。

小结

本实验在单因素基础上采用均匀设计对MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、CuSO₄·5H₂O及pH、蔗糖、蛋白胨6个因素进行优化，用均匀设计软件对实验结果进行回归分析和显著性检验确定回归分析方程，得到最优培养基，蔗糖30g/L，蛋白胨8g/L，CuSO₄1mmol/L，MgSO₄2g/L，KH₂PO₄1.5g/L，pH6为疣孢漆斑菌H最佳产酶培养基。

实施例5产漆酶菌株的实际应用

表5活性染料的结构和性质

5.1实验方法

本实验选用3大类9种活性染料(表5)作为脱色底物：偶氮类：活性黑5、活性深蓝M-2GE、活性绿19、活性艳橙K-GN、活性艳红KE-7B和活性藏青B-GD；蒽醌类：活性艳蓝K3R、活性艳蓝XBR；酞菁类：活性翠蓝。紫外可见分光光度计对染料水溶液进行全波长扫描(200nm-800nm)，确定染料的最大吸收波长。取1mL 200mg/L染料水溶液加入锥形瓶，加1mL H菌悬液(OD₆₀₀0.98)和8mL超纯水，染料最终浓度20mg/L，每组实验做三次平行样。用紫外分光光度计测定处理后样品吸光度值，对照组的实验为超纯水配置20mg/L染料。DC菌株(OD₆₀₀0.92)、N菌株(OD₆₀₀0.87)、DX菌株(OD₆₀₀1.08)处理过程同菌株H。

脱色率(％)＝(A₀-A)/A₀×100％

式中：A₀为染料的初始吸光度值；A为反应完成后的吸光度值。

5.2结果与讨论

四种真菌分别处理9种活性染料，紫外分光光度计测定其脱色率。如图13-图21所示。

随着时间延长，四种菌悬液和H菌株粗酶液处理20mg/L活性染料的脱色效果，表明四种菌株处理三类染料脱色率都呈现递增趋势。四种菌株对活性翠蓝处理效果最好，脱色率都高达80％以上。对活性深蓝，H菌株最佳脱色效果达95％以上，DC最差也达75％。对活性藏青，DC菌株脱色率最高为90％，而DX开始脱色效果最好，最后和H粗酶液一样。对活性艳红，H菌株对其脱色效果最好，其它三株菌悬液的处理效果较差，分别仅为10％、14％、24％。处理活性艳橙时，H菌株处理效果最好，DX次之，而N对其基本无效。对活性绿19，四种菌悬液作用有差异(图22)，N菌株处理效果最好91％，H次之，DC最差为76％。对活性黑5，H菌株脱色效果最好，DC效果最差，脱色率不到10％。对活性艳蓝K3R，H菌株对其效果最好为89％，DX的脱色率仅为26％。对活性艳蓝XBR，N对其脱色效果最差为57％，H菌株处理后脱色率最高为84％，H粗酶液和H菌悬液脱色效果相差不大。综上四种菌株对染料的脱色效果为酞菁类(活性翠蓝)＞蒽醌类(活性艳蓝XBR、活性艳蓝K3R)＞偶氮类，粗酶液对染料的实际处理效果与菌悬液相差不超过20％，提示菌体对染料的吸附是次要的，染料降解脱色的关键是漆酶。

菌株对20mg/L染料的脱色效果(图23-图26)。H菌株对9种染料都具有较好的脱色效果，对活性深蓝的效果最好，而对活性艳红的效果较差，但均在60％以上。DX菌株，随着时间的增加，脱色效果呈现递增趋势，对活性翠兰的脱色最好，而对活性艳红的脱色最差。DC菌株对9种染料的脱色率也随时间递增，对活性藏青的脱色效果最好，对活性黑5的效果最差(9.43％)。N菌株对9种染料的整体脱色效果不如其它菌株，但仍呈现出递增趋势，对活性翠蓝和活性绿19效果最好，而对活性艳红和活性艳橙的效果最差。综上得出四种菌株的脱色效果为H＞DX＞DC＞N。

在H菌悬浮液中加入20mg/L活性绿19，脱色液pH为3.5-7，30℃反应4d(图27)。活性绿19的脱色率随pH的升高先增大后减小，最佳pH为4.5。在pH 3.5时，染料的脱色率为47.3％，可能是酸性条件引起酶的部分失活。pH值在碱性范围内，漆酶分子会因为OH^-而改变活性中心的状态使得整个空间结构改变而引起酶的变性失活。该漆酶属于适酸酶，在pH3-6范围内酶活比较稳定。

在H菌株悬浮液中加入20mg/L活性绿19，pH为4.5，30-70℃反应1d，测定脱色率(图28)。活性绿19在35℃时脱色率最高，温度继续升高，脱色率下降，可能是温度升高引起酶的部分失活，确定活性绿19的最佳反应温度为35℃。

在H菌株悬浮液中加入2mg/L-50mg/L活性绿19，脱色液pH为4.5，35℃反应4d，测定脱色率(图29)。随着底物浓度的增加，H菌悬液对活性绿19脱色效果逐渐下降。底物浓度越低脱色效果越好，因为相同浓度的菌悬液所产生的漆酶量一定，能够代谢的底物量是一定的，但菌悬液对2mg/L-20mg/L底物脱色率相差不大，所以在其它实验中选用底物浓度20mg/L。当底物浓度过高时，酶的降解能力会达到饱和，并且过高底物浓度可能抑制酶活。

分离出的四种菌株对选定的九种染料都能脱色降解，H菌株对染料的脱色效果最好，而其酶活也是四种菌株里最高的。用高速离心方法得到的粗酶液对菌株具有脱色效果，通过H菌悬液和其粗酶液比较发现，活性染料脱色仅少部分因为菌株的吸附，主要是漆酶对染料降解。四种菌株中，N的脱色效果最差，对活性艳橙和活性艳红基本无效；9种染料中，活性艳红和活性艳橙的脱色效果最差，其脱色条件需进一步优化。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种产漆酶真菌菌株疣孢漆斑菌，其特征在于，所述疣孢漆斑菌于2014年11月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC No.M 201453。

2.根据权利要求1所述疣孢漆斑菌在处理染料废水污染过程中的应用，其特征在于，所述染料为活性黑5，活性绿19，活性深蓝M-2gE，活性艳橙K-GN，活性艳红KE-7B，活性藏青B-GD，活性艳蓝XBR，活性艳蓝K3R和活性翠蓝KN-G。