CN103146596A

CN103146596A - 一种生产靛蓝色素的专用菌株

Info

Publication number: CN103146596A
Application number: CN2012105446880A
Authority: CN
Inventors: 高兆建; 纪伟; 陈宏伟; 候进慧; 孙会刚; 陈尚龙; 巫永华
Original assignee: Xuzhou University of Technology
Current assignee: Xuzhou University of Technology
Priority date: 2012-12-14
Filing date: 2012-12-14
Publication date: 2013-06-12

Abstract

本发明公开了一种生产靛蓝色素的枯草芽孢杆菌，本发明涉及提供一种生产靛蓝色素的枯草芽孢杆菌菌株。包括如下步骤：(1)菌株发酵培养：将枯草芽孢杆菌CGMCC NO.5698的菌种在LB固体培养基上于30-37℃恒温培养后，将单菌落接入已灭菌的种子液培养基中，于26-34℃恒温培养46-60h，摇床转速200r/min；将种子液接入已灭菌的液体发酵培养基中，恒温培养48-60h，摇床转速200r/min；(2)提取枯草芽孢杆菌靛蓝色素。优点：本发明使用的枯草芽孢杆菌菌株，可在液态发酵培养基中高效合成靛蓝，生产效率较高。菌株对碳源和氮源要求较低，遗传稳定性好，操作简单。

Description

一种生产靛蓝色素的专用菌株

技术领域

本发明涉及一种生产靛蓝色素的枯草芽孢杆菌。

背景技术：

靛蓝(indigo)是一种颜色鲜艳而又稳定的蓝色色素。在结构上，靛蓝是一种芳香族化合物，主要用于布料的染色，如牛仔裤是通过靛蓝将纺织物染色处理后得到的。除了作为染料，靛蓝利靛玉红(一种靛蓝类的色素)在医药行业也有重要应用，能够对一些疾病包括癌症相关疾病、老年痴呆症、迟发过敏症等，有重要的治疗效果。在食品工业中，靛蓝可以作为食品着色的一类添加剂添加到食品中。传统的靛蓝生产主要从植物中提取，一些植物如菘蓝、蓼蓝、马蓝、野青树等叶片中含有丰富的靛蓝色素。通过植物提取的靛蓝安全性高，污染少，但其产量和纯度较低，限制了靛蓝的生产。化学合成法产量高，纯度高，生产工艺相对简单。目前，靛蓝主要通过化学合成法生产。然而，化学合成靛蓝，中于合成中合成原料、催化剂、中间产物等均具有一定的毒性，不但对人体健康有严重影响，而且产生了大量的副产物，如苯胺、硝基苯和金属盐等。这类物质的排放，导致严重的环境污染。微生物催化合成大然靛蓝主要是应用微生物细胞内的酶，在体内或体外催化特定反应，实现生物转化。因其催化反应条件温和、对作用底物有高选择性、降低生产成本、减少能耗、对环境无污染以及绿色安全等特点引起了科学工作者的关注。目前，所报道的微生物催化在靛蓝色素的生产应用中也存在诸多问题：如菌株的培养周期较长，色素分泌能力低，酶在反应介质中不稳定等，故进一步开发微生物资源，筛选靛蓝高产菌株具有重要意义。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种生产靛蓝色素的枯草芽孢杆菌菌株。

本发明所述的一种产靛蓝的菌株JWDL，其特征在于所述的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2012年1月9日，保藏号为：CGMCC5698。

本发明所述菌株在LB固体培养基上37℃培养24h，菌落呈蓝黑色，圆形，不透明，表面褶皱不光滑，边缘不规则扩展。利用透射电镜观察，周生鞭毛，无荚膜，有芽孢，菌体大小为(0.7～0.9)μm×(3～3)μm。生理生化特征见表1。

表1菌株JWDL的生理生化特征

注“+”表示生化反应为阳性，“-”表示生化反应为阴性

对该菌株16sRNA基因进行测序。将所得到的序列用Blast软件和Genbank中已有的16SrDNA序列进行同源性比较，利用软件MEGA4.0构建进化树，结果显示本发明菌株与Bacillus Subtilis(EU543578)聚为一支，序列相似性均为99％，结果见图1。综合JWDL菌株的形态学特征、生理生化特征及16S rDNA核苷酸序列同源性分析结果，将菌株JWDL鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)。

Bacillus Subtilis(EU543578)经发酵试验不能产生靛蓝色素。

一种用枯草芽孢杆菌菌株生产靛蓝色素的方法，步骤如下：

(1)平板培养：将枯草芽孢杆菌CGMCC5698的菌种在LB固体培养基上于30-37℃恒温培养；

(2)种子液的制备：将步骤(1)的单菌落接入种子液培养基30-34℃下恒温培养18小时，转速为180r/min；

(3)发酵培养：将步骤(2)培养好的种子液接入已灭菌的液体发酵培养基中，恒温培养48-60h，摇床转速200r/min；

(4)提取枯草芽孢杆菌靛蓝色素：发酵结束后，将发酵液于室温下12000r/min，离心15min，收集深蓝色的菌体沉淀物；上清液加入等体积的丙酮，反复震荡萃取后，12000r/min离心10min，收集含有靛蓝色素的丙酮层；收集的菌体沉淀物用60ml20mmol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液震荡吹打悬浮，再12000r/min，离心10min；如上反复洗涤3次，将非菌体杂质洗掉，离心后的菌体用40ml的丙酮充分悬浮菌体，再在冰浴状态下采用超声法破碎菌体细胞；超声功率600-800W，工作时间18s，间歇20s，工作次数25-35次；第一次超声破碎后的悬浮液10000r/min离心10min，得到深蓝色的上清液利深色细胞碎片沉淀；再次向细胞碎片沉淀中加入丙酮10ml，重复以上超声破碎细胞步骤1-2次；最后将每次超声破碎后获得的蓝色上清液以及丙酮萃取的发酵上清液合并；采用旋转蒸发仪浓缩，然后真空冷冻干燥除掉残余丙酮，得到靛蓝色素。

发酵培养温度优选32℃。

发酵时间优选46h时；选择蛋白胨和硫酸铵作为氮源。在复合碳源中优选0.5％葡萄糖+0.018％吲哚为复合碳源，时靛蓝产量最高；

步骤(1)所述LB固体培养基的组成，以重量体积百分比计，单位是g/100ml，其中蛋白胨1、酵母粉0.5、NaCl1，pH值为7.2。

步骤(2)所述种子液培养基的组成，以重量体积百分比计，单位g/100ml，其中蛋白胨1，葡萄糖0.5，酵母粉0.5，NaCl0.2，(NH₄)₂SO₄0.2，NH₄NO₃0.1，K₂HPO₄0.01，MgSO₄·7H₂O 0.01，pH7.5。

步骤(3)所述发酵培养基的组成，以重量体积百分比计，单位g/100ml，其中蛋白胨0.5，葡萄糖0.5，酵母粉0.5，(NH₄)₂SO₄0.25，MgSO₄·7H₂O0.01，FeSO₄·7H₂O 0.04，NH₄NO₃0.1，pH为7.0-9.0；菌体发酵培养18h后加入吲哚乙醇溶液，使发酵液中吲哚终浓度达到180mg/L。

有益效果：

本发明所提供的枯草芽孢杆菌在用于靛蓝色素生产时，具有以下优点：

1)本发明使用的枯草芽孢杆菌菌株，可在液态发酵培养基中高效合成靛蓝，生产效率较高。本发明的菌株在1000ml的摇瓶中，发酵周期48-720h，靛蓝色素产量可达271mg/L。

2)本发明的菌株对碳源和氮源要求较低，碳源是混合碳源，氮源也是是混合氮源。

3)本菌株遗传稳定性好。该菌株操作简单，连续传代10代以上，靛蓝色素的合成能力基本不变。

附图说明：

图1靛蓝色素产生菌JWDL的系统进化发育树

图2蓝色素样品的薄层层析分析

图3蓝色素样品的广谱分析

具体实施方式：

实施例1产靛蓝色素菌株的筛选鉴定

1、样品采集

从江苏徐州市污水处理厂附近的污泥中采集土样。

2、菌株的分离筛选于2011年9月12日从江苏省徐州市奎河污泥中采集土样，土样采集大高兆建。

配制固体初筛培养基(单位g/100ml)：酵母膏0.2，NaCl0.2，(NH₄)₂SO₄ 0.2，NH₄NO₃0.1，K₂HPO₄ 0.01，MgSO₄·7H₂O 0.01，FeSO₄·7H₂O0.004，琼脂粉1.5，pH7.5。配好的培养基于121℃，灭菌15min，倒平板。吲哚用乙醇配成终浓度为0.5g/100ml的吲哚溶液，灭好菌的培养基冷却到50℃左右，按照每100ml培养基加入吲哚溶液3ml，混匀后再倒平板。

配制富集培养基(单位g/100ml)：NaCl0.2，(NH₄)₂SO₄0.2，NH₄NO₃0.1，MgSO₄·7H₂O0.01，FeSO₄·7H₂O0.004，NaH₂PO₄0.02，KH₂PO₄0.02，吲哚，pH7.5。注意吲哚加入量同固体初筛培养基，培养基灭菌并冷却后，无菌条件下将吲哚溶液加入。

采集到的土样取2g，加到装有60ml富集培养基的250ml三角瓶中，32℃、160r/min的条件下摇瓶震荡富集培养3d。接着从中取1ml富集培养的悬浊液加到装有9m1无菌水的试管中，然后依次稀释到10^-3、 10^-4、10^-5、10^-6，从适当稀释的试管中，取200μl稀释液涂布于固体初筛培养基中，充分晾干后，于30℃培养箱中培养48-72h。观察菌落大小和菌落色泽，挑选产蓝色素的菌体划线纯化，纯化后的菌株保藏。

配制液体复筛培养基(单位g/100ml)：蛋白胨0.5，酵母膏0.2，NaCl0.2，(NH₄)₂SO₄0.2，NH₄NO₃0.1，K₂HPO₄0.01，MgSO₄·7H₂O 0.01，FeSO₄·7H₂O 0.004，pH7.5。配好的培养基于121℃，灭菌15min。冷却后，每100ml培养基加入吲哚溶液3ml。纯化后的初筛菌株接种单菌落到LB液体培养基中，32℃震荡培养18h，按照6％的接种量接到以上液体复筛培养基中，250ml三角瓶装液量50ml，30℃、180r/min震荡培养48-60h。选择三角瓶发酵液蓝色素颜色较深的对应菌株JWDL保藏。

3、菌株的鉴定

菌株生理生化鉴定：按照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)方法进行碳源利用试验、过氧化氢酶试验、硫化氢试验、吲哚试验、硝酸盐和亚硝酸盐还原试验等试验；形态学鉴定：将待鉴定的菌株分别点种于牛肉膏蛋白胨培养基固体平板上，37℃培养2d，描述并记录菌落培养特征以及菌体形态特征；分子生物学鉴定：细菌基因组DNA的提取参照《分子克隆实验指南》(第3版)的方法。依据细菌16S rDNA中最保守的序列设计引物。引物F：5′-AGA GTT TGATCM TGGCTC AG-3′；引物R：5′-AAG GAG GTG WTCCARCC-3′由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应条件：94℃5min，94℃30s，55℃40s，72℃2min，30个循环，72℃终延伸10min。PCR扩增产物送到北京三博远志生物技术有限公司测序。测序结果进行双向拼接后，将得到的16S rDNA序列提交到NCBI核酸数据库中进行BLAST在线分析。之后从NCBI的GenBank核酸数据库中随机选取报道中的部分芽孢杆菌16S rDNA序列，应用Clustal X1.81和Phylodraw082软件构建系统进化树并分析，系统发育树如图1所示。

实施例2菌株的发酵培养和靛蓝色素粗品的提取

1、菌株的培养

配制种子液培养基(单位g/100ml)：蛋白胨1，葡萄糖0.5，酵母粉0.5，NaCl0.2，(NH₄)₂SO₄ 0.2，NH₄NO₃ 0.1，K₂HPO₄ 0.01，MgSO₄·7H₂O 0.01，pH7.5。配好的培养基于121℃，灭菌15min。接种菌株JWDL单菌落到以上培养基中，250ml三角瓶装液量40ml，32℃、180r/min震荡培养20h。

配制发酵液培养基(g/L)：蛋白胨0.5，葡萄糖0.5，酵母粉0.5，(NH₄)₂5O₄0.25，MgSO₄·7H₂O0.01，FeSO₄·7H₂O0.04，NH₄NO₃0.1，pH7.5。配好的培养基于121℃，灭菌15min。将培养的种子液按照4％的接种量接种于已灭菌好的发酵养基中，1000ml三角瓶装液量150ml，32℃、180r/min震荡培养。发酵18h时加入吲哚溶液3.6ml(吲哚用乙醇配成终浓度为0.5g/100ml的吲哚溶液)。培养24h时，三家瓶颜色变深，菌体开始产生色素，发酵到48h左右，色素量达到最大，继续培养，色素产量变化不大，48h时终止发酵。

2、靛蓝色素提取

发酵结束后，将150ml的发酵液室温下12000r/min，离心15min，收集深蓝色的菌体沉淀物上清。上清液加入等体积的丙酮，反复震荡萃取后，12000r/min离心10min，收集含有靛蓝色素的丙酮层。离心后的菌体用60ml20mmol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液震荡吹打悬浮，再12000r/min，离心10min；如上反复洗涤3次，将非菌体杂质洗掉。离心后的菌体用40ml的丙酮充分悬浮菌体，再在冰浴状态下采用超声法破碎菌体细胞。超声功率：600-800W，工作时间18s，间歇20s，工作次数25-35次。第一次超声破碎后的悬浮液10000r/min离心10min，得到深蓝色的上清液利深色细胞碎片沉淀。再次上细胞碎片沉淀中加入丙酮10ml，重复以上超声破碎细胞步骤1-2次。最后将每次获得的蓝色上清液以及丙酮萃取的发酵上清液合并。采用旋转蒸发仪浓缩，然后真空冷冻干燥除掉残余丙酮，得到靛蓝色素。

实施例3色素的结构鉴定

1、薄层层析(TLC)分析：制备好的靛蓝粗品样品溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中。将该样品同同标准样品一起分别点样于TLC薄极。展开剂采用甲醇-丙酮/1∶1(v/v)溶剂系统。充分展开后，吹风机吹干。结果如图2所示，在层析板上相同的位置显示蓝色斑点。

2、紫外可见广谱扫描分析：溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)靛蓝样品同标准靛蓝样品，进行紫外-可见(250nm-700nm)广谱扫描。结果如图3所示，所制得样品同标准样品扫描广谱吸收曲线基本一致，均在在285nm、600nm处显示吸收峰。由此证明，菌株JWDL发酵获得的蓝色色素为靛蓝。

Claims

1.一种产靛蓝色素的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)CGMCC 5698。

2.将权利要求1所述的产靛蓝色素的枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)CGMCC5698应用于生产靛蓝色素。