CN102747016A - 一种结冷胶高效生产菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明从福建省三明市沙县的水稻根系土壤中分离并筛选得到能高产结冷胶的菌株，该菌株为少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627（Sphingomonas paucimobilis），并揭露了利用该少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627制备结冷胶的方法。本发明的优点在于：提供一种新的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627（Sphingomonas paucimobilis），并利用该少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627制备结冷胶，且制备获得结冷胶的产量符合工业化生产需求，从而增加了符合工业化生产需求的结冷胶生产菌株的来源。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种微生物及其应用，尤其涉及一种结冷胶高效生产菌株及应用其制备结冷胶的方法。
【背景技术】
结冷胶（Gellan Gum）是美国Kelco公司20世纪80年代开发的一种微生物食用胶，它是由伊乐假单胞杆菌（Pseudomonas elodea）在中性条件下，以葡萄糖为碳源，硝酸铵为氮源及一些无机盐所组成的培养基中，经有氧发酵而产生的细胞胞外多糖胶质，是一种新型的全透明的凝胶剂，并以其安全、无毒、胶体增稠、耐酸、耐盐、耐高温等优良特性，作为多功能胶凝剂、悬浮剂、增稠剂等被广泛应用于食品、医药、化妆、肥料等行业，具有广阔的应用领域和较好的市场前景。
结冷胶于1988年被日本政府批准作为食品添加剂，1992年获得美国FDA的认证许可并开始应用于食品饮料中，1994年被欧共体正式列入是食品安全代码（E-418），我国也在1996年批准其作为食品增稠剂、稳定剂使用（GB2760-1996）。目前在结冷胶生产上，除美国Kelco公司有年产5000吨能力外，我国河北、浙江也有两家企业生产结冷胶；但国内企业的结冷胶产量较少，难以满足我国结冷胶需求量日益增长的需要，因此，必需加大对结冷胶生产等方面的研究。
少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis）是主要的生产结冷胶的细菌。美国Kelco公司结冷胶的生产菌株ATCC 31461，分离自植物体，最初被命名为伊乐假单胞菌，后经过系统分类鉴定为少动鞘氨醇单胞菌（也称少动鞘脂单胞菌）。从资料报道上来看，少动鞘氨醇单胞菌可以从土壤、水样、空气、植物体或动物体组织样品中分离获得。
筛选获得高产结冷胶的少动鞘氨醇单胞菌菌株，同时辅以高效、优良的发酵培养方法，是提高结冷胶产量与质量的前提保证。以往的研究表明，少动鞘脂单胞菌发酵产生结冷胶至少必须达到20g/L以上才有工业化生产的意义。
目前国际上，主要的生产结冷胶菌株是ATCC 31461，该菌株的最高结冷胶产量可达28g/L；而国内公开报道的结冷胶生产菌株数量很少，主要有：
（1）中国专利申请号为ZL 200610068788.5、名称为一株高产结冷胶的少动鞘氨醇单胞菌及其应用中所公开的少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonaspaucimobilis）XLJ菌株；
（2）少动鞘脂单胞菌S 1菌株（彭志英等，少动鞘脂单胞菌S 1胞外多糖发酵工艺研究，微生物学通报，2000，27（2）：97-100）；
（3）少动鞘脂单胞菌G11菌株（李海军等，结冷胶发酵生产工艺的优化，食品与药品，2007，9（11）：7-12）；
（4）少动鞘脂单胞菌G3.1菌株（杨冬月等，结冷胶发酵生产工艺优化研究，现代农业科技，2011（11）：25-25、34）；
（5）少动鞘脂单胞菌ZJU311菌株（徐晓琴等，微生物多糖结冷胶的分批发酵动力学模型，化学工程，2011，39（11）：1-5）；
上述5个菌株的粗结冷胶产量依次分别为16-18g/L、9g/L、11.65g/L、17.3g/L和17.6g/L，均较低，未达到有工业化生产意义的20g/L的要求，是结冷胶大规模产业化的主要限制因素，因此从业者需要进一步研究，以期获得产量能够符合工业化生产需求的新的结冷胶生产菌株。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种结冷胶高效生产菌株，该菌株为少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627（Sphingomonas paucimobilis），该少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627于2012年05月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCC NO.6111，并利用该菌株制备结冷胶。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本申请人从福建省三明市沙县的水稻根系土壤中分离并筛选得到能够高产结冷胶的菌株，通过对该菌株进行生理生化特性测定和磷脂脂肪酸Sherlock-MIDI系统分析，最终鉴定其为少动鞘氨醇单胞菌的一个菌株。
进一步地，利用该菌株制备结冷胶，其制备方法的具体步骤为：
（1）所述的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627的活化：用接种环将所述的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627划线接种于菌株培养基上，并于恒温培养箱中培养48h，培养温度设定为30±1℃；
（2）制备种子液：将步骤（1）所培养获得的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627的单菌落接种于350ml的种子液体培养基中，并将其置于恒温摇床中振荡培养18h，温度30±1℃，转速180r/min；
（3）发酵液的制备：以体积百分比为5%的接种量将步骤（2）所获得的种子液转入已消毒灭菌的液体发酵培养基中发酵培养48-56h，温度30±1℃，通气量1.0-1.2vvm，转速180r/min，并在培养过程中每隔一段时间取适量的发酵液检测其粘度，当粘度值达到28000-32000mPa·S时则获得所需的发酵液，收集备用；且其中液体发酵培养基的组分为：可溶性淀粉4.0%，豆饼粉0.5%，KH2PO40.07%，蒸馏水配制，pH7.2；
（4）结冷胶的提取：将步骤（3）中收集到的发酵液置于转速为8000fmin的条件下离心20min，收集上清液，向该上清液内加入3倍体积的95%乙醇（即该上清液与95%乙醇的体积比为1:3），静置6h使结冷胶充分沉淀；接着将静置好后的溶液置于转速为8000r/min的条件下离心20min，收集沉淀物；之后将收集到的沉淀物用适量95%乙醇冲洗脱色2-3次，然后把沉淀物放置在60℃下恒温烘干24h，即得所述结冷胶粗品。
进一步地，所述步骤（1）中菌株培养基的组分：牛肉浸膏0.3％，蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0%，酵母膏0.1%，琼脂粉1.8%，蒸馏水配制，pH7.2；
所述步骤（2）中种子液体培养基的组分：蔗糖1.0％，可溶性淀粉1.0％，蛋白胨0.3％，酵母粉0.1％，蒸馏水配制，pH7.2。
另外，上述各培养基组分中的百分比均为质量比。
本发明的有益效果在于：提供一种新的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627（Sphingomonas paucimobilis），并利用该少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627制备结冷胶，且制备获得结冷胶的产量符合工业化生产需求，即该少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627能够高产结冷胶，从而增加了符合工业化生产需求的结冷胶生产菌株的来源。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1是本发明中菌株FJAT-5627的磷脂脂肪酸图谱。
【具体实施方式】
本发明一种结冷胶高效生产菌株即少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627（Sphingomonas paucimobilis）是从福建省三明市沙县的水稻根系土壤中分离并筛选得到能够高产结冷胶的菌株，并揭露了利用该少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627制备结冷胶的方法。
一．该菌株FJAT-5627的分离：
（1）从福建省三明市沙县的水稻田中连根挖起处于孕穗期的水稻植株，并用保鲜袋套住，迅速带回实验室后，抖掉与根系松散结合的土体，然后将与根系紧密结合的土壤用刷子刷下来作为根系土壤；将根系土壤晾干后过40目筛得土样，称取10g所得的土样并悬浮于90ml无菌水中，充分振荡充分振荡后吸取适量进行梯度稀释，选用稀释度为10-5、10-6、10-7的悬浮液；
（2）将步骤（1）获得的土壤稀释液均匀涂布于第一NA培养基平板上，然后将第一NA培养基平板倒置于30±1℃培养箱培养，培养48h后观察NA培养基平板长出的菌落的形态，挑取表面致密、颜色为金黄色的单菌落（有多个）并划线接种于第二NA培养基内，之后将该第二NA培养基置于恒温摇床中振荡培养，温度30±1℃，转速180r/min，48h后停止振荡培养并收集培养液；其中，第一NA培养基的组分：牛肉浸膏0.3%，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，酵母膏0.1％，琼脂粉1.8%，蒸馏水配制，pH7.2；第二NA培养基的组分：牛肉浸膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，酵母膏0.1％，蒸馏水配制，pH7.2；
（3）将步骤（2）收集到的培养液置于转速为8000r/min的条件下离心20min，收集上清液，向该上清液内加入3倍体积的95%乙醇（即该上清液与95%乙醇的体积比为1:3）让结冷胶沉淀出来，静置6h使结冷胶充分沉淀；静置好后的溶液置于转速为8000r/min的条件下离心20min，收集沉淀物；之后将收集到的沉淀物用适量95%乙醇冲洗脱色2-3次，然后把沉淀物放置于60℃条件下恒温烘干24h，即得结冷胶粗品，称干重；比较不同菌株的结冷胶粗品产量，筛选出结冷胶产量最高的菌株，并将该菌株命名为菌株FJAT-5627。
二．该菌株FJAT-5627的鉴定:
（1）生理生化特性鉴定：将筛选获得的菌株FJAT-5627按《伯杰氏细菌鉴定手册（第八版）》中规定的方法进行生理生化特性的测定，得到该菌株的主要形态及生物学特征如下：菌落圆整、有光泽、不透明、金黄色，表面致密，革兰氏染色呈阴性，形态杆状，大小约0.7×1.5μm，不产芽胞。其具体生理生化鉴定见表1：
表1、菌株FJAT-5627的生理生化特性
注：+表示有作用或有反应；-表示无作用或无反应
将上述各指标进行分析比对后发现各指标与少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis）的完全一致。
（2）Sherlock-MIDI系统鉴定：应用美国的Sherlock-MIDI细菌磷脂脂肪酸分析系统对菌株FJAT-5627的磷脂脂肪酸进行分析，分析结果表明，该菌株FJAT-5627的磷脂脂肪酸与Sherlock-MIDI系统中标准少动鞘氨醇单胞菌菌株的磷脂脂肪酸的匹配度高达0.959；该菌株FJAT-5627的磷脂脂肪酸图如图1所示，且其与Sherlock-MIDI系统中标准少动鞘氨醇单胞菌菌株的磷脂脂肪酸的匹配结果见表：
表2、与Sherlock-MIDI系统的匹配结果
综合上述2种方法的鉴定结果，则判定菌株FJAT-5627为少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis）。
三．正交法筛选少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627的发酵培养基
（1）菌株的活化：用接种环将菌株FJAT-5627划线接种于菌株培养基上，并于恒温培养箱中培养48h，且培养温度为30±1℃；
（2）制备种子液：将步骤（1）所培养获得的菌株FJAT-5627的单菌落接种于350ml的种子液体培养基中，并将其置于恒温摇床中振荡培养18h，温度30±1℃，转速180r/min；
其中，步骤（1）中菌株培养基的组分：牛肉浸膏0.3%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0%，酵母膏0.1%，琼脂粉1.8%，蒸馏水配制，pH7.2；步骤（1）中种子液体培养基的组分：蔗糖1.0％，可溶性淀粉1.0%，蛋白胨0.3％，酵母粉0.1％，蒸馏水配制，pH7.2；
（3）不同发酵培养基的配制：采用正交试验法，设计三因素、三水平，按表3的组合配制9种不同的发酵培养基；
表3、进行正交设计的因素和水平
按照正交设计，配制的9种发酵培养基分别为：1-A1B1C1，2-A1B2C2，3-A1B3C3，4-A2B1C2，5-A2B2C3，6-A2B3C1，7-A3B1C3，8-A3B2C1，9-A3B3C2；将各发酵培养基的pH值调至7.2并高压灭菌后，接着按5%的接种量将步骤
（2）获得的种子液接种到各发酵培养基内并进行振荡培养，培养温度30±1℃、转速180r/min；
（4）菌株FJAT-5627在不同的发酵培养基中培养50h后，停止培养，检测各发酵培养基中发酵液的粘度；在各发酵培养基中分别取100ml发酵液，并将所取的发酵液均置于8000r/min条件下离心20min，收集上清液，向各上清液内加入3倍体积的95%乙醇（即该上清液与95%乙醇的体积比为1:3）让结冷胶沉淀出来，静置6h使结冷胶充分沉淀；接着将静置好的各溶液分别置于转速为8000r/min的条件下离心20min，收集沉淀物；之后将收集到的沉淀物用适量95%乙醇冲洗脱色2-3次，然后把沉淀物放置在60℃恒温下烘24h，称干重，即为结冷胶的重量；比较不同发酵培养液的结冷胶产量，并通过DPS数据分析系统进行试验结果统计分析，从而确定结冷胶产量最高的发酵培养基配方为：可溶性淀粉4.0％，豆饼粉0.5%，KH2PO40.07%，pH7.2。
四、利用所述少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627制备结冷胶
为了能够清楚的阐述本发明中利用所述少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627制备结冷胶的过程，本申请人例举了如下几个具体实施例。
实施例1
（1）所述的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627的活化：用接种环将权利要求1中所述的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627划线接种于菌株培养基上，并于恒温培养箱中培养48h，培养温度设定为30±1℃；其中，菌株培养基的组分：牛肉浸膏0.3%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0％，酵母膏0.1%，琼脂粉1.8%，蒸馏水配制，pH7.2；
（2）制备种子液：将步骤（1）所培养获得的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627的单菌落接种于350ml的种子液体培养基中，并将其置于恒温摇床中振荡培养18h，温度30±1℃，转速180r/min；其中，种子液体培养基的组分：蔗糖1.0%，可溶性淀粉1.0%，蛋白胨0.3%，酵母粉0.1％，蒸馏水配制，pH7.2；
（3）发酵液的制备：以体积百分比为5%的接种量将步骤（2）所获得的种子液转入已消毒灭菌的液体发酵培养基中发酵培养48h，温度30±1℃，通气量1.2vvm，转速180r/min，并在培养过程中每隔一段时间取适量的发酵液检测其粘度，当粘度值达到28000mPa·S时则获得所需的发酵液，收集备用；且其中液体发酵培养基的组分为：可溶性淀粉4.0%，豆饼粉0.5％，KH2PO40.07%，蒸馏水配制，pH7.2；
（4）结冷胶的提取：将步骤（3）中收集到的发酵液置于转速为8000r/min的条件下离心20min，收集上清液，向该上清液内加入3倍体积的95%乙醇（即该上清液与95%乙醇的体积比为1:3）让结冷胶沉淀出来，，静置6h使结冷胶充分沉淀；接着将静置好后的溶液置于转速为8000r/min的条件下离心20min，收集沉淀物；之后将收集到的沉淀物用适量95%乙醇冲洗脱色2次，然后把沉淀物放置在60℃下恒温烘干24h，即得所述结冷胶粗品，称干重并计算的结冷胶生产量为25.2g/L。
实施例2
（1）所述的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627的活化：用接种环将权利要求1中所述的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627划线接种于菌株培养基上，并于恒温培养箱中培养48h，培养温度设定为30±1℃；其中，菌株培养基的组分：牛肉浸膏0.3%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0％，酵母膏0.1%，琼脂粉1.8%，蒸馏水配制，pH7.2；
（2）制备种子液：将步骤（1）所培养获得的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627的单菌落接种于350ml的种子液体培养基中，并将其置于恒温摇床中振荡培养18h，温度30±1℃，转速180r/min；其中，种子液体培养基的组分：蔗糖1.0%，可溶性淀粉1.0%，蛋白胨0.3%，酵母粉0.1％，蒸馏水配制，pH7.2；
（3）发酵液的制备：以体积百分比为5%的接种量将步骤（2）所获得的种子液转入已消毒灭菌的液体发酵培养基中发酵培养56h，温度30±1℃，通气量1.1vvm，转速180r/min，并在培养过程中每隔一段时间取适量的发酵液检测其粘度，当粘度值达到32000mPa·S时则获得所需的发酵液，收集备用；且其中液体发酵培养基的组分为：可溶性淀粉4.0%，豆饼粉0.5％，KH2PO40.07%，蒸馏水配制，pH7.2；
（4）结冷胶的提取：将步骤（3）中收集到的发酵液置于转速为8000r/min的条件下离心20min，收集上清液，向该上清液内加入3倍体积的95%乙醇（即该上清液与95%乙醇的体积比为1:3）让结冷胶沉淀出来，静置6h使结冷胶充分沉淀；接着将静置好后的溶液置于转速为8000r/min的条件下离心20min，收集沉淀物；之后将收集到的沉淀物用适量95%乙醇冲洗脱色3次，然后把沉淀物放置在60℃下恒温烘干24h，即得所述结冷胶粗品，称干重并计算的结冷胶生产量为25.9g/L。
实施例3
（1）所述的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627的活化：用接种环将权利要求1中所述的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627划线接种于菌株培养基上，并于恒温培养箱中培养48h，培养温度设定为30±1℃；其中，菌株培养基的组分：牛肉浸膏0.3%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1.0％，酵母膏0.1%，琼脂粉1.8%，蒸馏水配制，pH7.2；
（2）制备种子液：将步骤（1）所培养获得的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627的单菌落接种于350ml的种子液体培养基中，并将其置于恒温摇床中振荡培养18h，温度30±1℃，转速180r/min；其中，种子液体培养基的组分：蔗糖1.0%，可溶性淀粉1.0%，蛋白胨0.3%，酵母粉0.1％，蒸馏水配制，pH7.2；
（3）发酵液的制备：以体积百分比为5%的接种量将步骤（2）所获得的种子液转入已消毒灭菌的液体发酵培养基中发酵培养52h，温度30±1℃，通气量1.0vvm，转速180r/min，并在培养过程中每隔一段时间取适量的发酵液检测其粘度，当粘度值达到30000mPa·S时则获得所需的发酵液，收集备用；且其中液体发酵培养基的组分为：可溶性淀粉4.0%，豆饼粉0.5％，KH2PO40.07%，蒸馏水配制，pH7.2；
（4）结冷胶的提取：将步骤（3）中收集到的发酵液置于转速为8000r/min的条件下离心20min，收集上清液，向该上清液内加入3倍体积的95%乙醇（即该上清液与95%乙醇的体积比为1:3）让结冷胶沉淀出来，静置6h使结冷胶充分沉淀；接着将静置好后的溶液置于转速为8000r/min的条件下离心20min，收集沉淀物；之后将收集到的沉淀物用适量95%乙醇冲洗脱色3次，然后把沉淀物放置在60℃下恒温烘干24h，即得所述结冷胶粗品，称干重并计算的结冷胶生产量为25.5g/L。
由上述各实施例可知，利用本发明中的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627制备结冷胶时，不仅操作起来简便，而且制备获得的结冷胶生产量均高于25g/L，即均满足结冷胶工业化生产的要求。
综上，本发明利用分离筛选获得的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627制备结冷胶，且制备获得结冷胶的产量符合工业化生产需求，即该少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627能够高产结冷胶，从而增加了符合工业化生产需求的结冷胶生产菌株的来源。另外，需要说明的是，本发明中各培养基组分中的百分比均为质量比。
Claims (3)
1.一种结冷胶高效生产菌株，其特征在于：所述菌株为少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627（Sphingomonas paucimobilis），于2012年05月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO．6111。
2.一种结冷胶的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
（1）权利要求1中所述的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627的活化：用接种环将权利要求1中所述的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627划线接种于菌株培养基上，并于恒温培养箱中培养48h，培养温度设定为30±1℃；
（2）制备种子液：将步骤（1）培养所获得的少动鞘氨醇单胞菌菌株FJAT-5627的单菌落接种于350ml的种子液体培养基中，并将其置于恒温摇床中振荡培养18h，温度30±1℃，转速180r/min；
（3）发酵液的制备：以体积百分比为5%的接种量将步骤（2）所获得的种子液转入已消毒灭菌的液体发酵培养基中发酵培养48-56h，温度30±1℃，通气量1.0-1.2vvm，转速180r/min，并在培养过程中每隔一段时间取适量的发酵液检测其粘度，当粘度值达到28000-32000mPa·S时则获得所需的发酵液，收集备用；且其中液体发酵培养基的组分为：可溶性淀粉4.0%，豆饼粉0.5%，KH2PO40.07%，蒸馏水配制，pH7.2；
（4）结冷胶的提取：将步骤（3）中收集到的发酵液置于转速为8000r/min的条件下离心20min，收集上清液，向该上清液内加入3倍体积的95%乙醇，静置6h使结冷胶充分沉淀；接着将静置后的溶液置于转速为8000r/min的条件下离心20min，收集沉淀物；之后将收集到的沉淀物用乙醇冲洗脱色2-3次，然后把沉淀物放置在60℃下恒温烘干24h，即得所述结冷胶粗品。
3.根据权利要求2所述的一种结冷胶的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中菌株培养基的组分：牛肉浸膏0.3%，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，酵母膏0.1%，琼脂粉1.8%，蒸馏水配制，pH7.2；
所述步骤（2）中种子液体培养基的组分：蔗糖1.0％，可溶性淀粉1.0％，蛋白胨0.3%，酵母粉0.1％，蒸馏水配制，pH7.2。
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