CN107805649A - 一种生产结冷胶的新型发酵工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生产结冷胶的新型发酵工艺。本发明提供了一种生产结冷胶的发酵工艺，本工艺通过在发酵罐中保留一定比例的发酵液作为下一批发酵的种子，或将一定量发酵液用作种子转入其他发酵罐启动下一批发酵，降低了结冷胶的发酵成本，同时减少了种子培养过程中的染菌风险。

Description

一种生产结冷胶的新型发酵工艺

发明领域

本发明涉及生物发酵领域。具体地，本发明涉及一种生产结冷胶的发酵工艺。

背景技术

结冷胶是由少动鞘脂单胞菌产生的一种新型微生物多糖，具有用量低、耐酸、耐高温、耐酶、兼容性好等优良特性，在食品、制药、化工等行业具有广泛的用途。

结冷胶主要是通过微生物批式发酵生产，即发酵接种前一次性投入发酵所需的碳源、氮源及无机盐等营养物质,经高温灭菌后接入新培养的种子启动发酵。这种传统的批式发酵需要单独种子罐培养制备种子,并在严格无菌条件下将培养好的种子转接到主发酵罐，工艺环节复杂且成本较高，并增加染菌风险。

而且在批式发酵中，微生物的发酵会消耗一部分营养物并生成生物量，这会增加发酵成本，但不会产生经济效益，而且所产生的生物质废弃物的处理也会增加生产成本。

因此，如果能够在结冷胶的高粘度发酵工艺中去掉或简化种子培养环节，对生物质进行循环使用，可以显著提高生产效率,节约相应的生产设备，降低结冷胶的发酵成本和种子培养过程中的染菌风险。

发明内容

本发明提供了一种生产结冷胶的发酵工艺。具体地，本发明所述的生产结冷胶的发酵工艺包括将一定量的发酵液用作下一批发酵的种子。

在本发明中，所述发酵液是指接种了能生产结冷胶产品的菌种并经过一定时间培养的含有结冷胶和菌种的培养基。所述菌种包括但不限于少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)、Sphingomonasazotofigens、Sphingomonas elodea。在本发明中，所述培养基是指任何含有碳源、氮源、磷酸盐以及无机盐等适于培养微生物以发酵生产胶的培养基。

在本发明中，将所述发酵液用作下一批发酵的种子可以是在发酵结束后,在发酵罐中保留一定量的发酵液作为下一批发酵的种子，并在该发酵罐中直接补入已灭菌的培养基启动下批发酵，其余发酵液进入结冷胶的分离提纯工序。

因此，本发明所述的生产结冷胶的发酵工艺可以包括如下步骤：

1)菌种活化；

2)在发酵罐的培养基中接入步骤1)得到的活化后的菌种，启动发酵；

3)发酵结束后，在发酵罐中保留一定量的发酵液用作下一批发酵的种子，其余发酵液进入结冷胶分离提纯工序；

4)向步骤3)中保留的种子中加入培养基启动下一批发酵；和

5)任选地，重复步骤3)和4)。

可选择地，本发明中将所述发酵液用作下一批发酵的种子也可以是在发酵过程中在发酵罐中移取一定量的发酵液，将其转接入装有已灭菌培养基的发酵罐中启动下一批发酵，其余发酵液继续发酵。优选地，所述发酵过程中为发酵5小时到发酵结束期间，更优选地为发酵20-48小时，最优选地为发酵36-48小时。

因此，本发明所述的生产结冷胶的发酵工艺也可以包括如下步骤：

1)菌种活化；

2)在发酵罐的培养基中接入步骤1)得到的活化后的菌种，启动发酵；

3)在发酵过程中，优选地在发酵5小时到发酵结束期间，更优选地在发酵20-48小时，最优选地在发酵36-48小时，移取一定量发酵液用作种子，其余发酵液继续发酵；

4)将步骤3)中移取的种子接入下一批培养基，启动发酵；和

5)任选地，重复步骤3)和4)。

所述菌种活化是本领域公知的，通常地，是指将保存的甘油管或斜面培养基菌种接入种子培养基并在一定条件下进行培养以提高菌种生物量的过程。活化好的菌种可以转入发酵罐进行发酵生产结冷胶。

在本发明中，所述步骤3)和4)可以重复任意次，也可以根据发酵的实际状况，择机启动菌种活化步骤。优选地，将步骤3)和4)重复1-25次，更优选地，重复2-10次。

在本发明中，所述“一定量”可以是基于总发酵液体积的任何比例。所述量只会影响后批发酵的周期，并不会影响营养的消耗，也不会影响发酵最终的结冷胶含量和胶糖转化率。可以基于生产率及批产量选择最佳量，优选地，所述“一定量”为总发酵体积的3％-50％，更优选地，为4％-25％，最优选地，为5％-10％。

在本发明中，所述一定量的发酵液可以无需任何处理，直接用作下一批发酵的种子。

本领域的普通技术人员可以理解，在将所述一定量的发酵液用作下一批发酵的种子前，也可以对所述发酵液进行简单处理，如调节pH值，或添加碳源等营养物质，或加水稀释。

本发明中，所述发酵可以是培养基一次性补入的批式发酵，也可以是关键营养源限制性控制的补料式发酵，例如补氮发酵(参见中国专利申请201710518726.8)。

本发明所述的生产结冷胶的发酵工艺还可以包括结冷胶的分离提纯步骤。结冷胶的分离提纯方法是本领域公知的，因此在本申请中不再对其做进一步描述，详情可以参见：IoannisGiavasis etc.,Critical Reviews in Biotechnology,20(3):177-211(2000)。

本发明所述的发酵工艺首次在高粘度结冷胶发酵中，将一定量的发酵液用作下一批发酵的种子，即简化了种子培养环节，节约了相应的种罐培养设备和原料，降低种子培养过程中的染菌风险，又缩短了生产周期，提高了生产效率，降低了发酵成本，例如种子的消毒、培养及相应废弃物处理的成本，取得了意想不到的效果。本发明通过以下实施例进行进一步说明。这些实施例只是为了说明的目的，而不是用来限制本发明的范围。

具体实施方案

在结冷胶生产领域，通常使用两个指标来评价发酵水平：一是发酵液胶含量(g/kg发酵液)，二是发酵液黏度(Cp)。通常来说，发酵液的结冷胶含量越高且粘度越高，表明发酵水平越高。在本发明中，也采用以上指标评价所述发酵工艺的发酵水平。所述胶含量按本领域常规的乙醇沉淀法测定，所述发酵液黏度用Brookfield粘度计测试。

实施例1

1)培养基配制

种子培养基：按如下组合制备种子培养基：7g/Kg酵母提取物、25g/Kg蔗糖、0.5g/Kg KH₂PO₄、0.75g/Kg K2HPO4和0.6g/Kg MgSO₄·7H₂O。将培养基pH值调节到7.0±0.1并灭菌。

发酵培养基：按如下组合在12L发酵罐中配制7.5L发酵培养基：

15g/kg葡萄糖、2.5g/kg大豆分离蛋白、0.5g/kg KH₂PO₄、0.5g/kg K₂HPO₄、0.375g/kg MgSO₄·7H₂O、0.15g/kg消泡剂。

将培养基pH调节到7.0±0.1并灭菌。

2)菌种活化

将鞘氨醇单胞菌(Sphingomonasazotofigens)(浙江帝斯曼中肯生物科技有限公司)接入已灭菌盛有种子培养基50ml的500mL三角摇瓶中，30℃，200RPM摇床培养16小时后，取10ml培养物转入盛有450mL已灭菌种子培养基的2L三角摇瓶中，培养16小时后作为活化种子开始第一轮发酵。

3)发酵过程控制

第一轮发酵，将步骤2)培养的活化种子375g接入盛有7.5L已灭菌发酵培养基的12L发酵罐，按照下述工艺条件开始发酵：

第一轮发酵到36小时，从第一轮发酵罐中取750g发酵液接入盛有7.5L已灭菌发酵培养基的12L发酵罐，开始第二轮发酵，工艺条件同上；

第二轮发酵到36小时，从第二轮发酵罐取750g发酵液接入盛有7.5L已灭菌发酵培养基的12L发酵罐，开始第三轮发酵，工艺条件同上；

第三轮发酵到36小时，从第三轮发酵罐取750g发酵液接入盛有7.5L已灭菌发酵培养基的12L发酵罐，开始第四轮发酵，工艺条件同上；

所有4轮发酵都在48小时结束。

4)发酵结果

发酵48小时结束后，测定胶含量和粘度(用Brookfield粘度计测试)，结果如下：

	第一轮	第二轮	第三轮	第四轮
					结冷胶含量(g/kg)	5.04	5.45	5.97	5.46
黏度(Cp)	4720	5934	5670	4920

实施例2

1)培养基配制

种子培养基配制与实施例1相同。

发酵培养基：按如下组合在12L发酵罐中配制7.5L发酵培养基：

15g/kg葡萄糖、0.4g/kg谷氨酸单钠，0.4g/kg酵母抽提物，0.5g/kg KH₂PO₄、0.5g/kg K₂HPO₄、0.375g/kg MgSO₄·7H₂O、0.5g/Kg微量元素溶液(5g/kg Citric acid·1H₂O,0.20g/kg H₃BO₃,0.20g/kg CuCl₂·2H₂O,0.20vg/kg NiCl₂·6H₂O,0.60g/kg MnSO₄·1H₂O,0.025g/kg Na₂MoO₄·2H₂O,1.0g/kg ZnSO₄·7H₂O,8g/kg FeSO₄·7H₂O)和0.15g/kg消泡剂。将培养基pH调节到7.0±0.1并灭菌。

2)氮源

配制含有1.5g/Kg谷氨酸单钠和1.5g/Kg液体酵母提取物的500mL溶液，灭菌后作为补加氮源。

3)菌种活化与实施例1的步骤2)相同。

4)发酵过程控制

第一轮发酵，将步骤3)培养的活化种子375g接入盛有7.5L已灭菌发酵培养基的12L发酵罐，按照下述工艺条件进行发酵并按如下速度恒速补加氮源：

第一轮发酵结束后，从第一轮发酵罐中取375g发酵液接入装有7.5L已灭菌发酵培养基的12L发酵罐，开始第二轮发酵；发酵过程及氮源流加控制与第一轮发酵相同。

5)发酵结果

发酵48小时结束后，测定胶含量和粘度(用Brookfield粘度计测试)，结果如下：

	第一轮	第二轮
			结冷胶含量(g/kg)	5.22	5.1
黏度(Cp)	4620	4350

Claims (9)

1.一种生产结冷胶的发酵工艺，其包括在发酵罐中保留一定量发酵液用作下一批发酵的种子。

2.如权利要求1所述的工艺，在发酵结束后保留一定量发酵液作为下一批发酵液的种子。

3.如权利要求1所述的工艺，在发酵过程中移取一定量发酵液作为下一批发酵液的种子。

4.如权利要求3所述的工艺，其中所述发酵过程中为发酵5小时到发酵结束，优选为发酵20-48小时，更优选为发酵36-48小时。

5.如权利要求1-4任一项所述的工艺，其中所述保留一定量发酵液为总发酵体积的3％-50％，优选为4％-25％，更优选为5％-10％。

6.如权利要求1-5任一项所述的工艺，还包括发酵结束后，分离提纯发酵所产生的结冷胶的步骤。

7.如权利要求1-6任一项所述的工艺，其中所述发酵为批式发酵和/或补料式发酵。

8.一种生产结冷胶的发酵工艺，其包括如下步骤：

1)菌种活化；

2)在发酵罐的培养基中接入活化后的菌种，启动发酵；

3)发酵结束后，在发酵罐中保留一定量发酵液作为下一批发酵的种子，其余发酵液进入结冷胶分离提纯工序；

4)向步骤3)中保留的种子中接入培养基启动下一批发酵。

9.一种生产结冷胶的发酵工艺，其包括如下步骤：

1)菌种活化；

2)在发酵罐的培养基中接入活化后的菌种，启动发酵；

3)在发酵过程中，优选地在发酵5小时到发酵结束期间，更优选地在发酵20-48小时，最优选地在发酵36-48小时，移取一定量发酵液作为种子，其余发酵液继续发酵；

4)将步骤3)中移取的种子接入下一批培养基，启动发酵。