CN1970738A - 一株高产结冷胶的少动鞘氨醇单孢菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株高产结冷胶的少动鞘氨醇单孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ，该菌株于2006年6月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国武汉)，保藏编号为：No.M206058。本发明还公开了所述的少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的工艺，该工艺包括(1)菌种选择，(2)斜面培养，(3)一级种子培养，(4)扩大培养，(5)发酵罐培养，(6)收集发酵产物等步骤；具有工艺简便，生产成本低，发酵周期短，产品得率高等特点，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及一株少动鞘氨醇单孢菌及其应用，尤其涉及一株高产结冷胶的少动鞘氨醇单孢菌及其利用少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法。
背景技术
结冷胶是由少动鞘氨醇单胞菌产生的一种新型微生物多糖，具有用量低、透明度高、香气释放能力强、耐酸、耐高温、耐酶、兼容性好等优良特性，可应用于食品、饮料、化妆品、洗涤剂、陶瓷、石油开采、化工涂料等多个领域，是具有较高利润和很大发展潜力的生物材料。
结冷胶在1978年被首次发现，1992年获得美国FDA权威性认证。欧共体也于1994年将其正式列入食用安全代码(E-418)表中。我国在1996年批准其可作为食品增稠剂、稳定剂使用(GB20.000；INS418)。
近几年研究发现，结冷胶多糖在制药、环境修复等领域具有良好的应用前景，这使得结冷胶发酵生产研究具有了更加重要的价值。但是高昂的市场价格和低产率限制了结冷胶在国内各个领域的广泛应用。
目前国际上，结冷胶的发酵生产主要有以下两种工艺：
1)以葡萄糖为碳源发酵生产结冷胶(Kang et al.Agar-like polysaccharideproduced by a Pseudomonas species：production and basic properties.Appl.Environ.Microbiol.1982，43：1086-1091；Fialho et al.Structures and propertiesof gellan polymers produced by Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461 from lactosecompared with those produced from glucose and from cheese whey.Appl.Environ.Microbiol.1999，65：2485-2491；Kanari et al.Effect of environmental factorsand carbohydrate on gellan gum production.Appl.Biochem.Biotechnol.2002，102-103：129-139.)
2)以淀粉为碳源发酵生产结冷胶(张士楚等，新的微生物多糖结冷胶生产工艺，中国专利公开号：CN1351172A；张禹等，微生物多糖结冷胶的制备方法，中国专利公开号：CN1635132A)
上述发酵生产工艺中尚存在急需解决的关键问题是：
(1)上述工艺1中以葡萄糖为碳源发酵生产结冷胶的发酵培养基均含有复杂的盐溶液，培养基复杂、生产成本高、产品质量不稳定，产量低。
(2)上述工艺2中以淀粉为碳源，菌株对氮源的要求比较高，发酵的转化率低，后处理过程中淀粉去除困难。
(3)在上述工艺中的发酵周期长(50～72小时)，产胶量低(1.0-1.6％)，转化率低(45～50％)，发酵液的粘度在4,000～8,000cP，低酰基结冷胶的提取率低于50％。这与黄原胶相比，培养基复杂、发酵周期长、低产率和低转化率是限制结冷胶大规模产业化的主要障碍。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一株高产结冷胶的少动鞘氨醇单孢菌株及其利用少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法。
本发明提供的高产结冷胶的少动鞘氨醇单孢菌命名为少动鞘氨醇单孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ，是少动鞘氨醇单孢菌的突变株，已于2006年6月22日保藏于中国典型微生物菌种保藏中心(武汉大学，中国武汉)，其保藏编号为CCTCCNo.M206058。
上述的高产结冷胶的少动鞘氨醇单孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ CCTCCNo.M206058，特征是，该菌为革兰氏阴性杆菌，单极鞭毛有动力，可被染成黄色，无芽孢的直杆状；在营养琼脂平板上菌落呈黄色；氧化酶试验阳性；专性需氧；分解葡萄糖、果糖、木糖，蔗糖，葡萄糖O/F为氧化型；动力试验、精氨酸双水解酶试验阳性，鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶阴性，不能液化明胶，42℃环境中不生长。
应用上述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法，该方法之步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用少动鞘氨醇单孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ CCTCC No.M206058；
(2)斜面培养：将上述菌株接种于固体斜面培养基上，在25-33℃条件下，培养18-24小时；
(3)一级种子培养：将步骤(2)培养的菌体，在无菌条件下用接种环接1～4环于50mL～100mL种子液体培养基中，在25-33℃条件下，振荡培养8-12小时，制得一级种子液；
(4)扩大培养：以体积比为4-10％的接种量，接一级种子液于500mL～1000mL种子液体培养基中，25-33℃条件下，振荡培养4-20小时，制得二级种子液；
(5)发酵罐培养：以体积比为4-10％的接种量，接二级种子液于液体发酵培养基中，25-33℃、pH6.8-7.2条件下，通风1.0～1.5vvm，培养40-56小时；
(6)收集发酵产物：待步骤(5)之发酵液粘度达12000-15000cP时，收集发酵液，即为结冷胶粗多糖粗品，结冷胶粗多糖浓度为16-18g/L。
上述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法中：步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述培养温度优选为27-30℃。
上述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法中：步骤(2)中所述培养时间优选为20-22小时。
上述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法中：步骤(3)中所述培养时间优选为10-12小时。
上述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法中：步骤(4)中所述培养时间优选为5-10小时。
上述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法中：步骤(5)中所述培养时间优选为45-52小时。
上述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法中：步骤(3)、(4)中所述种子液体培养基配方(1L蒸馏水计)为：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉1g/L，pH6.8-7.2；步骤(2)所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基成分添加质量体积百分比浓度为1.5-2.0％的琼脂粉。
上述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法中：步骤(5)中所述液体发酵培养基配方(1L蒸馏水计)为：葡萄糖30g/L，尿素7.5g/L，Na2HPO4 10g/L，KH2PO4 30g/L，K2SO4 10g/L，MgSO4 7HO2 7g/L，pH6.8-7.2。
上述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法中：步骤(5)中所述通风量优选为1.2～1.4vvm。
上述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法中：步骤(5)中所述pH优选7.0。
本发明所取得的实质性特点和显著技术进步在于：
1、本发明提供了一株高产结冷胶的菌株少动鞘氨醇单孢菌(Shingomonaspaucimobilis)XLJ CCTCC No.M206058；
2、本发明提供发酵工艺中，发酵周期(40-56小时)和种子培养时间(8-12小时)显著缩短；
3、本发明提供发酵工艺中，发酵培养基简单，利用无机氮源尿素代替了蛋白胨等价格高的有机氮源，显著降低了发酵原料成本；
本发明提供发酵工艺中，发酵液的粘度达12000-15000cP，产胶量为16-18g/L，转化率为50-57％，低酰基结冷胶的提取率为55-58％，发酵产率显著提高。
具体实施方式
实施例1：少动鞘氨醇单孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ CCTCC No.M206058的筛选、培养、鉴定
从炼油厂污水排放口等地取得土样、水样，用基本无机盐培养基(MAMD)浸泡过夜，于30℃，180转/分振荡培养48小时。培养液去除土样后离心得到菌体，所得菌体用生理盐水洗涤两次，悬浮于浓度为100mM的pH7.0的磷酸钾缓冲液中，调整菌体浓度在2克干细胞/升。以体积百分比为10％的接种量将此菌液加入到含有2％的葡萄糖的上述基本无机盐培养基试管中，30℃培养24小时，再以体积百分比为10％的接种量转入新鲜的含有2％的葡萄糖的基本无机盐培养基中继续培养2天以上。用基本无机盐培养基作对照，有明显生长的，将此管的培养液稀释涂布在固体基本无机盐培养基上，培养挑出单菌落，扩大培养，得到能产结冷胶的菌株。
该菌株不能运动，不产芽孢，形态为棒杆状，长2μm，直径1μm，在MAMD培养基上以葡萄糖为唯一碳源培养36小时后，菌落颜色为金黄色。
由中国典型微生物菌种保藏中心(武汉大学，中国武汉)所作的鉴定表明，该菌株含有2-OH酰氨脂肪酸。
该菌株可以在基本无机盐培养基(MAMD)上以无机硫，如D-葡萄糖，D-果糖，D-甘露糖，D-半乳糖，麦芽糖，L-阿拉伯糖，糖原，糊精和纤维二糖作为唯一碳源生长，也可以在LB培养基上生长。
该菌命名为少动鞘氨醇单孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ，已于2006年6月22日保藏于中国典型微生物菌种保藏中心(武汉大学，中国武汉)，其保藏号为CCTCCNo.M206058。
上述MAMD培养基组成：1升蒸馏水中含：10克葡萄糖，0.5克KH2PO4，4克K2HPO4，1克NH4Cl，2mL质量百分比为1％的CaCl2，2mL质量百分比为10％的MgCl2·6H2O，200μL质量百分比为1％的FeCl3，200μL质量百分比为5％的NaCl，5mL质量百分比为1％的酵母粉，200μL的维生素混合液，5mL的金属离子混合液，加蒸馏水到1升。115℃条件下灭菌20分钟。固体基本无机盐培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6％的琼脂粉，115℃条件下灭菌20分钟。其中微量元素混合液组成为：1升蒸馏水中含：ZnCl2 0.5g；FeCl2 0.5g；MnCl2·4H2O 0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。维生素混合物的配方为，每升蒸馏水含有：400mg泛酸钙(Calcium pantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
上述LB培养基配方如下，1升蒸馏水中含：10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6％的琼脂粉，121℃条件下灭菌20分钟。
实施例2：应用少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶
(1)菌种选择：选用少动鞘氨醇单孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ CCTCC No.M206058；
(2)斜面培养：将上述菌株接种于固体斜面培养基上，在30℃条件下，培养20小时；
(3)一级种子培养：将步骤(2)培养的菌体，在无菌条件下用接种环接3环于100mL种子液体培养基中，在30℃条件下，振荡培养10小时，制得一级种子液；
(4)扩大培养：以体积比为5％的接种量，接一级种子液于500mL种子液体培养基中，30℃条件下，振荡培养8小时，制得二级种子液；
(5)发酵罐培养：以体积比为6％的接种量，接二级种子液于50L液体发酵培养基中，30℃、pH7.0条件下，通风1.3vvm，培养50小时；
(6)收集发酵产物：待步骤(5)之发酵液粘度达15000cP时，收集发酵液，即为结冷胶粗多糖粗品，结冷胶粗多糖浓度为18g/L。
上述步骤(3)、(4)中所述种子液体培养基配方(1L蒸馏水计)为：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉1g/L，pH7.0；步骤(2)所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基成分添加质量体积百分比浓度为1.6％的琼脂粉。
上述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法中：步骤(5)中所述液体发酵培养基配方(1L蒸馏水计)为：葡萄糖30g/L，尿素7.5g/L，Na2HPO4 10g/L，KH2PO4 30g/L，K2SO4 10g/L，MgSO4 7HO2 7g/L，pH 7.0。
(7)发酵液的预处理：将步骤(6)所述发酵液升温至90℃，维持20分钟后再降至80℃。
(8)脱酰基处理：将预处理后的发酵液用1M的氢氧化钠调pH值至10，维持20分钟，然后用1M的盐酸调pH值至中性。
(9)酶法脱蛋白处理：向脱酰基处理后的发酵液中加入0.5AU g-1的碱性蛋白酶，然后在pH9，55℃条件下，反应4小时，用凯氏定氮法测定处理后的结冷胶的含氮量确定质量标准，测得结冷胶的含氮量为0.1％(质量百分比)，达到美国食品与农业管理局(FDA)标准。
实施例3：应用少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶
(1)菌种选择：选用少动鞘氨醇单孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ CCTCC No.M206058；
(2)斜面培养：将上述菌株接种于固体斜面培养基上，在25℃条件下，培养24小时；
(3)一级种子培养：将步骤(2)培养的菌体，在无菌条件下用接种环接2环于50mL种子液体培养基中，在25℃条件下，振荡培养12小时，制得一级种子液；
(4)扩大培养：以体积比为8％的接种量，接一级种子液于500mL种子液体培养基中，25℃条件下，振荡培养10小时，制得二级种子液；
(5)发酵罐培养：以体积比为6％的接种量，接二级种子液于10L液体发酵培养基中，25℃、pH6.8条件下，通风1.0vvm，培养56小时；
(6)收集发酵产物：待步骤(5)之发酵液粘度达12000cP时，收集发酵液，即为结冷胶粗多糖粗品，结冷胶粗多糖浓度为16g/L；
上述步骤(3)、(4)中所述种子液体培养基配方(1L蒸馏水计)为：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉1g/L，pH6.8；步骤(2)所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基成分添加质量体积百分比浓度为1.5％的琼脂粉。
上述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法中：步骤(5)中所述液体发酵培养基配方(1L蒸馏水计)为：葡萄糖30g/L，尿素7.5g/L，Na2HPO4 10g/L，KH2PO4 30g/L，K2SO4 10g/L，MgSO4 7HO2 7g/L，pH6.8；
(7)发酵液的预处理：将步骤(6)所述发酵液升温至85℃，维持30分钟后降至80℃：
(8)脱酰基处理：将步骤(7)预处理后的发酵液调pH值9，维持30分钟，然后调pH值至中性；
(9)酶法脱蛋白处理：向步骤(8)中的发酵液中加入碱性蛋白酶，比例为每升发酵液加入0.48AU的碱性蛋白酶，在pH6、40℃下，反应6小时；采用凯氏定氮法测定处理后的结冷胶的含氮量为0.25％(质量百分比)，达到美国食品与农业管理局(FDA)标准。
实施例4：应用少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶
(1)菌种选择：选用少动鞘氨醇单孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ CCTCC No.M206058；
(2)斜面培养：将上述菌株接种于固体斜面培养基上，在33℃条件下，培养18小时；
(3)一级种子培养：将步骤(2)培养的菌体，在无菌条件下用接种环接4环于100mL种子液体培养基中，在33℃条件下，振荡培养9小时，制得一级种子液；
(4)扩大培养：以体积比为10％的接种量，接一级种子液于1000mL种子液体培养基中，33℃条件下，振荡培养4小时，制得二级种子液；
(5)发酵罐培养：以体积比为10％的接种量，接二级种子液于液体发酵培养基中，33℃、pH7.2条件下，通风1.5vvm，培养40小时；
(6)收集发酵产物：待步骤(5)之发酵液粘度达13000cP时，收集发酵液，即为结冷胶粗多糖粗品，结冷胶粗多糖浓度为17g/L；
上述步骤(3)、(4)中所述种子液体培养基配方(1L蒸馏水计)为：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉1g/L，pH7.2；步骤(2)所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基成分添加质量体积百分比浓度为2.0％的琼脂粉；
上述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法中：步骤(5)中所述液体发酵培养基配方(1L蒸馏水计)为：葡萄糖30g/L，尿素7.5g/L，Na2HPO4 10g/L，KH2PO4 30g/L，K2SO4 10g/L，MgSO4 7HO2 7g/L，pH7.2；
(7)发酵液的预处：将步骤(6)所述发酵液升温至90℃，维持15分钟后降至80℃；
(8)脱酰基处理：将步骤(7)预处理后的发酵液调pH值10，维持20分钟，然后调pH值至中性；
(9)酶法脱蛋白处理：向步骤(8)中的发酵液中加入碱性蛋白酶，比例为每升发酵液加入0.80AU的碱性蛋白酶，在pH7.5、55℃下，反应4小时；采用凯氏定氮法测定处理后结冷胶的含氮量为0.13％，达到美国食品与农业管理局(FDA)标准。
实施例5：应用少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶
1)菌种的选择：选用少动鞘氨醇单孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ CCTCC No.M206058；
(2)斜面培养：将上述步骤(1)的菌株接种于固体培养基上，在30℃下，培养20小时；
(3)一级种子培养：将步骤(2)培养的菌体，在无菌条件下用接种环接4环100mL种子液体培养基中，30℃条件下，在摇床上振荡培养10小时，制得一级种子；
(4)扩大培养：以体积比为5％的接种量，接一级种子于种子液体培养基中，30℃条件下，在摇床上振荡培养8小时，制得二级种子；
(5)发酵罐培养：以体积比为5％的接种量，接二级种子于液体发酵培养基培养基中，30℃、pH7.0条件下，通风1.2vvm，培养48小时；
(6)收集发酵产物：待步骤(5)之发酵液粘度达12500cP时，收集发酵液，即为结冷胶粗多糖粗品，结冷胶粗多糖浓度为16.4g/L；
上述步骤(3)、(4)中所述种子液体培养基配方(1L蒸馏水计)为：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉1g/L，pH7.2；步骤(2)所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基成分添加质量体积百分比浓度为1.8％的琼脂粉；
上述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法中：步骤(5)中所述液体发酵培养基配方(1L蒸馏水计)为：葡萄糖30g/L，尿素7.5g/L，Na2HPO4 10g/L，KH2PO4 30g/L，K2SO4 10g/L，MgSO4 7HO2 7g/L，pH7.2；
(7)发酵液的预处理：将步骤(6)所述发酵液升温至95℃，维持10分钟后降至80℃：
(8)脱酰基处理：将步骤(7)预处理后的发酵液调pH值12，维持10分钟，然后调pH值至中性；
(9)酶法脱蛋白处理：向步骤(8)中的发酵液中加入碱性蛋白酶，比例为每升发酵液加入0.96AU的碱性蛋白酶，在pH10、65℃下，反应1小时；采用凯氏定氮法测定处理后结冷胶的含氮量为0.20％，达到美国食品与农业管理局(FDA)标准。
Claims (10)
1、一株高产结冷胶的少动鞘氨醇单孢菌，其特征在于：该菌命名为少动鞘氨醇单孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ，已于2006年6月22日保藏于中国典型微生物菌种保藏中心，其保藏编号为CCTCC No.M206058。
2、如权利要求1所述的高产结冷胶的少动鞘氨醇单孢菌，其特征是，该菌为革兰氏阴性杆菌，单极鞭毛有动力，可被染成黄色，无芽孢的直杆状；在营养琼脂平板上菌落呈黄色；氧化酶试验阳性；专性需氧；分解葡萄糖、果糖、木糖，蔗糖，葡萄糖O/F为氧化型；动力试验、精氨酸双水解酶试验阳性，鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶阴性，不能液化明胶，42℃环境中不生长。
3、应用权利要求1或2所述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法，该方法之步骤顺序如下：
(1)菌种选择：选用少动鞘氨醇单孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ CCTCC No.M206058；
(2)斜面培养：将上述菌株接种于固体斜面培养基上，在25-33℃条件下，培养18-24小时；
(3)一级种子培养：将步骤(2)培养的菌体，在无菌条件下用接种环接1～4环于50mL～100mL种子液体培养基中，在25-33℃条件下，振荡培养8-12小时，制得一级种子液；
(4)扩大培养：以体积比为4-10％的接种量，接一级种子液于500mL～1000mL种子液体培养基中，25-33℃条件下，振荡培养4-20小时，制得二级种子液；
(5)发酵罐培养：以体积比为4-10％的接种量，接二级种子液于液体发酵培养基中，25-33℃、pH6.8-7.2条件下，通风1.0～1.5vvm，培养40-56小时；
(6)收集发酵产物：待步骤(5)之发酵液粘度达12000-15000cP时，收集发酵液，即为结冷胶粗多糖粗品，结冷胶粗多糖浓度为16-18g/L。
4、如权利要求3所述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法，其特征是：步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述培养温度为27-30℃。
5、如权利要求3所述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法，其特征是：步骤(2)中所述培养时间为20-22小时。
6、如权利要求3所述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法，其特征是：步骤(3)中所述培养时间为10-12小时。
7、如权利要求3所述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法，其特征是：步骤(4)中所述培养时间为5-10小时。
8、如权利要求3所述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法，其特征是：步骤(5)中所述培养时间为45-52小时。
9、如权利要求3所述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法，其特征是：步骤(3)、(4)中所述种子液体培养基配方为：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉1g/L，pH6.8-7.2；步骤(2)所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基成分添加质量体积百分比浓度为1.5-2.0％的琼脂粉。
10、如权利要求3所述少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的方法，其特征是：步骤(5)中所述液体发酵培养基配方为：葡萄糖30g/L，尿素7.5g/L，Na2HPO4 10g/L，KH2PO4 30g/L，K2SO4 10g/L，MgSO4 7HO2 7g/L，pH6.8-7.2。
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