CN102605017A - 一种结冷胶的发酵制备方法 - Google Patents

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许怀远
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Abstract

本发明涉及一种结冷胶的发酵制备方法，包括如下工艺步骤：将斜面菌种接入摇瓶培养基中培养制成摇瓶种子液；将摇瓶种子液接入种子罐培养基中进行一级扩大培养得到一级种子液；将一级种子液接入发酵罐中进行二级扩大培养得到含有结冷胶的发酵液，其中发酵罐培养基包括如下组分：葡萄糖浆、大豆粉、铵盐、酵母膏、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、消泡剂、蒸馏水。本发明方法发酵罐中，碳源以葡萄糖浆替换白糖，而氮源采用部分速效无机氮源，如硫酸铵，适量补充迟效有机氮源。这种培养基组成优化了培养基中碳源和氮源的类型，有利于菌体迅速生长，减少了发酵步骤，缩短了发酵时间并提高了发酵液出胶率，同时降低了原料成本。

Description

一种结冷胶的发酵制备方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种结冷胶的发酵制备方法。
背景技术
结冷胶是美国凯可（KELCO）公司开发的一种亲水性胶体，它是以少动鞘脂单胞菌（Sphingomonas paucimobilis）为发酵菌，经数级发酵培养后，发酵液再通过一系列后期提取工艺生产而来。结冷胶是结冷胶族( Gellan Family )多糖中的一种，其分子的基本结构是一条主链，由重复的四糖单元构成，参与形成的单糖有葡萄糖、鼠李糖及葡萄糖醛酸，摩尔比为2:1:1。每单位有1个O－甘油酰取代基，甘油酰基位于3－连接成键的葡萄糖残基的2位；另外每隔一个单位还有1个 O－乙酰取代基，乙酰基在6位上。
在结冷胶发酵液过程中，原始形态的高酰基结冷胶黏度极高，导致发酵液的含氧量受到限制，需要在发酵过程中使用大功率搅拌和强通风，不仅能耗大，而且发酵产率较低。目前国内现有的结冷胶发酵制备方法普遍存在发酵时间长、原料和能源费用高，产品收得率低等问题。传统的结冷胶发酵为三级发酵，包括一级和二级种子罐及三级大发酵，通过改变培养基组成以及调整搅拌发酵参数；碳源主要为白糖，不但价格高，而且白糖是双糖，必须水解为单糖后才能更为有效地被发酵菌利用；氮源只用到大豆蛋白粉，其为迟效氮源，菌体利用比较慢。传统的结冷胶发酵搅拌器类型为轴向推进式和径向圆盘弯叶式搅拌叶，这种搅拌器类型能耗比较高。
    CN101586135公开了一种高产量的结冷胶发酵制备方法，该方法存在一些不足之处。首先该工艺为三级发酵，包括一级和二级种子罐扩大培养和三级发酵罐培养，总体发酵时间长，流程多；其次，该发酵工艺中大发酵中使用白糖和大豆蛋白作为碳源和氮源，原料成本较高，而且不利于菌体对碳源和氮源的快速利用；最后，该工艺中使用的通风量过大，主要是由于搅拌桨叶不合理造成的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够缩短发酵时间、降低能耗、适合工业化规模生产的结冷胶的发酵制备方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种结冷胶的发酵制备方法，包括如下工艺步骤：
（1）将斜面菌种接入摇瓶培养基中培养制成摇瓶种子液，其中所述菌种选用少动鞘脂单胞菌；
（2）将上述摇瓶种子液接入种子罐的种子罐培养基中进行一级扩大培养，得到一级种子液；
（3）将上述一级种子液接入发酵罐的发酵罐培养基中进行二级扩大培养，得到含有结冷胶的发酵液，其中发酵罐培养基包括如下质量比组分：
葡萄糖浆5.0～6.0%、大豆粉0.3～0.4%、铵盐0.1～0.15%、酵母膏0.5～0.7%、磷酸二氢钾 0.08～0.11%、磷酸氢二钾0.13～0.16%、硫酸镁0.05～0.07%、消泡剂0.04～0.06%、其余为蒸馏水。
所述步骤（1）中所用的摇瓶培养基的pH为7.10～7.25，包括如下质量比组分：
蔗糖1.5～2.5%、牛肉膏0.2～0.4%、酵母膏0.1～0.3%、氯化钠0.05～0.15%、其余为蒸馏水。
所述步骤（1）中摇瓶培养条件为：摇床转速130～170rpm，温度26～31℃，培养周期14～17h。
所述步骤（2）中所用的种子罐培养基的pH为6.8～7.3，包括如下质量比组分：
蔗糖1.5～2.5%、酵母膏0.5～0.7%、磷酸二氢钾 0.03～0.05%、磷酸氢二钾0.03～0.07%、硫酸镁0.05～0.08%、消泡剂0.02～0.03%、其余为蒸馏水。
所述步骤（2）中的一级扩大培养条件为：温度28.0～33.0℃，通风比1：3.0～3.5，运行压力0.05～0.08Mpa，培养周期12-15h。
所述步骤（2）中的一级扩大培养的终点为OD值0.25±0.05，OD值测定采用721型分光光度计、660nm波长条件下检测。
所述步骤（3）中的发酵罐培养基的pH为7.0～7.3，所述铵盐为硫酸铵。 
所述步骤（3）中的二级扩大培养条件为：温度30～33℃，通风比1:1.25～2.0，运行压力0.03～0.05Mpa，培养周期45-48h。
所述步骤（3）中二级扩大培养的终点为发酵液黏度为8000～12000cP,残糖比例为0.1～0.3%，OD值0.4±0.05，OD值测定采用721型分光光度计、660nm波长条件下检测。
所述种子罐和发酵罐的罐径比为1.9～2.6: 1，所用的搅拌桨为5～6组，其中上层4组搅拌桨采用斜叶式搅拌形式，底层剩余搅拌桨采用箭叶式与抛物式混合的搅拌形式。
本发明的积极效果为：
本发明方法发酵罐中，碳源以葡萄糖浆替换白糖，而氮源采用部分速效无机氮源，如硫酸铵，适量补充迟效有机氮源。这种培养基组成优化了培养基中碳源和氮源的类型，有利于菌体迅速生长，减少了发酵步骤，缩短了发酵时间并提高了发酵液出胶率，同时降低了原料成本。本发明采用两级发酵，大大缩短了总体发酵时间，发酵周期由原来的75到80小时缩短为60到65小时。
本发明方法改变了搅拌桨叶的类型和搅拌模式，上层四组搅拌桨叶采用斜叶式搅拌器，其为径流型搅拌器，底层搅拌桨叶采用箭叶式与抛物式混合的搅拌模式。桨叶前端带有后掠角的大宽叶桨叶，排出性能优于直叶和弯叶开启涡轮，功耗低，剪切力小，在不影响发酵产率的前提下，可以降低搅拌机能耗30%同时也提升了体系溶氧条件。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
本实施例中所使用的摇瓶体积为5L，种子罐体积为5T，发酵罐体积为50T。实际使用体积为种子罐3.5T，发酵罐35T。 
本实施例包括如下工艺步骤：
（1）将斜面菌种接入摇瓶培养基，培养并制成摇瓶种子液；
菌种选用少动鞘脂单胞菌（Sphingomonas paucimobilis），摇瓶培养基的pH为7.15，包括如下质量比组分：
蔗糖1.5%、牛肉膏0.4%、酵母膏0.2%、氯化钠0.10%、蒸馏水97.8%；
摇瓶扩大培养条件为：摇床转速150rpm，温度26℃，培养周期14h。
（2）将上述摇瓶种子液按种子罐培养基体积的9%接入到种子罐中进行一级扩大培养，得到一级种子液；
所用种子罐的罐径比为2.0: 1，转速为110rpm，种子罐培养基的pH为7.0，包括如下质量比组分：
蔗糖2.5%、酵母膏0.6%、磷酸二氢钾0.05%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸镁0.08%、消泡剂0.02%、蒸馏水96.7%。
培养条件为：温度33.0℃，通风比1：3.0，运行压力0.06Mpa，培养周期14h。
培养的终点为OD值0.30，OD值测定，使用721型分光光度计，660nm波长条件下进行OD值测定。
（3）将上述制备的一级种子液按发酵培养基体积的8%接入发酵罐中进行二级扩大培养，得到含有结冷胶的发酵液，其中发酵罐培养基包括如下质量比组分：
葡萄糖浆5.0%、大豆粉0.4%、硫酸铵0.1%、酵母膏0.6%、磷酸二氢钾 0.08%、磷酸氢二钾0.15%、硫酸镁0.07%、消泡剂0.05%、蒸馏水93.55%；
发酵罐培养基的pH为7.3； 
培养温度在接种后至20h之间为32℃，20h至放罐前为30.5℃；
运行压力0.04Mpa，培养周期47h，通风比为变化数值，具体为：接种后到15h通风比为 1:2.0，15～30h通风比为 1:1.4，30～47h通风比为1:1.25。
在发酵过程中，当发酵液粘度高于400cp，pH低于6.7时开始补碱(氢氧化钠溶液)，碱液质量浓度为8-15%，频率为每两小时一次，补碱时段pH控制在6.7-7.1之间。
培养的终点为OD值0.4±0.05，OD值测定采用721型分光光度计、660nm波长条件下检测。发酵液黏度为10000cP,残糖比例为0.2%，出胶率为1.8%。
所用发酵罐的罐径比为2.3:1，转速为150rpm，所用的搅拌桨为6组，其中上层4组搅拌桨采用斜叶式搅拌形式，底层2组搅拌桨采用箭叶式与抛物式混合的搅拌形式。
以上所述，为本发明的较佳实施案例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (10)

1.一种结冷胶的发酵制备方法，其特征在于，包括如下工艺步骤：
（1）将斜面菌种接入摇瓶培养基中培养制成摇瓶种子液，其中所述菌种选用少动鞘脂单胞菌；
（2）将上述摇瓶种子液接入种子罐的种子罐培养基中进行一级扩大培养，得到一级种子液；
（3）将上述一级种子液接入发酵罐的发酵罐培养基中进行二级扩大培养，得到含有结冷胶的发酵液，其中发酵罐培养基包括如下质量比组分：
葡萄糖浆5.0～6.0%、大豆粉0.3～0.4%、铵盐0.1～0.15%、酵母膏0.5～0.7%、磷酸二氢钾 0.08～0.11%、磷酸氢二钾0.13～0.16%、硫酸镁0.05～0.07%、消泡剂0.04～0.06%、其余为蒸馏水。
2. 根据权利要求1所述的结冷胶的发酵制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中所用的摇瓶培养基的pH为7.10～7.25，包括如下质量比组分：
蔗糖1.5～2.5%、牛肉膏0.2～0.4%、酵母膏0.1～0.3%、氯化钠0.05～0.15%、其余为蒸馏水。
3. 根据权利要求1所述的结冷胶的发酵制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中摇瓶培养条件为：摇床转速130～170rpm，温度26～31℃，培养周期14～17h。
4.根据权利要求1所述的结冷胶的发酵制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中所用的种子罐培养基的pH为6.8～7.3，包括如下质量比组分：
蔗糖1.5～2.5%、酵母膏0.5～0.7%、磷酸二氢钾 0.03～0.05%、磷酸氢二钾0.03～0.07%、硫酸镁0.05～0.08%、消泡剂0.02～0.03%、其余为蒸馏水。
5. 根据权利要求1所述的结冷胶的发酵制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的一级扩大培养条件为：温度28.0～33.0℃，通风比1：3.0～3.5，运行压力0.05～0.08Mpa，培养周期12-15h。
6. 根据权利要求1所述的结冷胶的发酵制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的一级扩大培养的终点为OD值0.25±0.05，OD值测定采用721型分光光度计、660nm波长条件下检测。
7. 根据权利要求1所述的结冷胶的发酵制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中的发酵罐培养基的pH为7.0～7.3，所述铵盐为硫酸铵。
8.根据权利要求1所述的结冷胶的发酵制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中的二级扩大培养条件为：温度30～33℃，通风比1:1.25～2.0，运行压力0.03～0.05Mpa，培养周期45-48h。
9. 根据权利要求1所述的结冷胶的发酵制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中二级扩大培养的终点为发酵液黏度为8000～12000cP,残糖比例为0.1～0.3%，OD值0.4±0.05，OD值测定采用721型分光光度计、660nm波长条件下检测。
10. 根据权利要求1所述的结冷胶的发酵制备方法，其特征在于，所述种子罐和发酵罐的罐径比为1.9～2.6: 1，所用的搅拌桨为5～6组，其中上层4组搅拌桨采用斜叶式搅拌形式，底层剩余搅拌桨采用箭叶式与抛物式混合的搅拌形式。
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