CN104480086B - 一种中温α‑淀粉酶的制备方法 - Google Patents

一种中温α‑淀粉酶的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种中温α‑淀粉酶的制备方法，属于酶制剂制备技术领域。以通过‑氯化锂‑硫酸二乙酯复合诱变获得的枯草芽孢杆菌304Bacillus subtilis304，经菌种活化、液体种子培养、发酵罐培养等步骤制备而成，制备的中温α‑淀粉酶酶活力高达7000‑9600U/ml；最适作用温度为65℃，该酶在65℃条件下保存24h仍具有80‑83％酶活，70℃条件下保存12h仍具有50‑60％以上酶活；该酶最适反应pH值为5.0，在pH4‑6下保存18h后仍有80％以上的酶活，比现有的中温α‑淀粉酶酶活力更高，酶作用最适pH值范围更宽泛，耐温度更高，特别适合反应温度高、液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求。

Description

一种中温α-淀粉酶的制备方法
技术领域
本发明属于酶制剂制备技术领域，特别涉及一种中温α-淀粉酶的制备方法。
背景技术
α-淀粉酶全称为α-1,4-葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.1)，作用于淀粉时，可从分子内部切开α-1，4-糖苷键而生成糊精和还原糖，由于产物的末端葡萄糖残基C1碳原子为α-构型，故得名为α-淀粉酶。α-淀粉酶是最重要的一类酶，也是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种，占酶制剂市场月25％的份额。
其中，中温α-淀粉酶是一类最适反应温度处于50-70摄氏度之间的α-淀粉酶。这类酶的最适反应温度较高，所以其适用范围非常广。目前，中温α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵等行业，也用于饲料、轻化工业、食品、造纸、医药、石油开采等各个领域。
中温淀粉酶在医药行业的应用：
助消化：用于消化药物，一是在胃中促进淀粉消化、减轻胃部胀感；二是将淀粉水解成糖分，使之易于被机体吸收，使用中温α-淀粉酶，降解淀粉，降低粘度，帮助消化。
抗炎净创类药品的应用：中温α-淀粉酶是目前在治疗上发展最快，用途最广的一种。中温α-淀粉酶和其他酶联合运用能够分解发炎部位纤维蛋白的凝结物，消除伤口周围的坏疽，腐肉和碎屑。还能够分解脓液中的核蛋白，使之成为简单的嘌呤和嘧啶，降低脓液的粘性，达到洁净创口、消炎抗肿的目的。
中温淀粉酶对淀粉原料的处理：
在发酵行业中一般使用的原料中都含有淀粉，例如生产酒精、酿酒、食醋等，这些淀粉一般都是粗原料，使用α-淀粉酶和糖化酶对原料预处理，方便微生物发酵。尤其是中文α-淀粉酶的应用更简化了生产的能耗，下面列举一些应用中温α-淀粉酶处理淀粉原料的例子：
葡萄糖生产：葡萄糖是淀粉糖工业中产量最大的一个部门，生产出来的葡萄糖进一步精制可应用到制药行业，生产葡萄糖传统工艺是使用酸水解淀粉，但是必须使用精制淀粉作原料。40年代发展的酶法生产，专一性高，不需要精制淀粉，污染小。目前广泛使用的是双酶法制糖工艺，先用耐高温α-淀粉酶进行连续喷射液化，加入糖化酶进行间歇式糖化，这样不但增加能耗，而且成本高，采用中温淀粉酶就解决了这个问题，具有很好的发展前景。
有机酸生产：柠檬酸、乳酸、衣康酸和苹果酸等有机酸的生产主要通过微生物发酵方法获得，在微生物发酵时都需要使用淀粉作为原料，包括红薯或玉米等，都不适宜在高温下进行，所以使用前都需要使用中温α-淀粉酶进行水解处理。
中温淀粉酶在添加剂中的应用：
在许多时候还需要报中温α-淀粉酶作为食品添加剂、饲料添加剂或者辅助添加剂添加到食品、饲料、药品和日化产品中去。在饲料中添加中温α-淀粉酶其主要作用是补充动物内源酶的不足，提高饲料中淀粉的利用率，尤其是幼龄动物对淀粉的利用率。目前在饲料生产中α-淀粉酶主要和纤维素酶、蛋白酶、植酸酶等酶类混合使用添加到饲料当中，在畜禽的肠道内发挥作用，分解饲料中的淀粉类物质，促进消化，提高利用率。洗涤剂用酶主要添加蛋白酶，其次是α-淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶。其与蛋白酶配合使用，用于洗衣粉，液体洗涤剂。特别在以淀粉为主要食物的地区，在洗涤剂中添加淀粉酶很普遍。对α-淀粉酶的要求是低温活性高，与洗涤剂的其他组分，特别是表面活性剂有很好的相容性，有出色的稳定性。目前应用的中温α-淀粉酶一般在60度上下表现出良好的活性，适合在洗涤剂中使用。
由此可见，近年来中温淀粉酶已经引起研究人员的广泛关注，具有广阔的应用前景，但是现有的中温α-淀粉酶在发酵时的最大酶活都难以令人满意，特别是在需要进行液化糖化的工艺当中存在需要反复调节pH值的缺陷，因此急需研发出发酵时最大酶活较高且使用pH较宽泛的中温α-淀粉酶的生产方法，以满足日益增长的工业化生产需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种中温α-淀粉酶的制备方法。
本发明提供的产中温α-淀粉酶的菌株具体为枯草芽孢杆菌304Bacillussubtilis304。该菌株已于2013年11月24日保藏于中中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国.武汉.武汉大学)，保藏号为CCTCC NO:M 2013600。
所述枯草芽孢杆菌304由一株分离自酸性土壤的产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌出发菌株经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，菌株特点如下：所述菌株在固体平板上菌落颜色为乳白色，表面干燥褶皱，色暗不透明，边缘整齐，镜检为长杆状，革兰氏染色呈阳性，周生鞭毛，芽孢呈椭圆形。
一种中温α-淀粉酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化
将保存完好的枯草芽孢杆菌304的斜面菌种接种于斜面培养基，30-37℃培养24-36h进行菌种活化，如此活化2-3次；
所述斜面培养基组成为：牛肉膏3-10g，氯化钠5-12g，蛋白胨10-20g，葡萄糖2-5g,琼脂15-20g，蒸馏水l000mL，pH值5.5-6.5，121℃灭菌20min；
(2)液体种子扩大培养
①一级种子培养：将步骤(1)活化后的斜面菌种1-2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床250转/分，培养温度30-37℃，培养时间10-15h；
②二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床250转/分，培养温度30-37℃，培养时间10-15h；
④一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度30-37℃，搅拌速度200-400rpm，通风量(V/V)1:1-2,罐压0.05Mpa,培养时间10-20h；
所一级、二级、三级种子培养基重量组成为：
酵母粉0.3-0.5％，葡萄糖1-1.5％，蛋白胨0.3-0.5％，牛肉膏0.5-0.8％，磷酸氢二钾0.8-1.5％，中草药剂粉1.5-2％，海藻糖1-3％，硫酸钙1g,氯化镁2g,柠檬酸钠1-3g，不足部分纯净水补足，pH值5.5-6.5，121-123℃灭菌30-40min。
所述种子罐培养基重量组成为：
麦芽糊精5-15％，酵母粉0.4-0.8％，中草药剂粉1.5-2％，海藻糖1-3％，蛋白胨0.1-0.5％，玉米浆0.1-0.5％，磷酸氢二钾0.8-1.5％，硫酸镁0.05-0.1％，柠檬酸钠0.1-0.5％，不足部分纯净水补足，pH值5.5-6.5，121-123℃灭菌30-40min。
所述种子罐发酵液菌体浓度为7.0x 108-8.0x 108个/ml；
(3)发酵罐发酵
方法①
将步骤(2)中一级种子罐发酵液6-10％接种量接入发酵罐，培养温度30-37℃，搅拌速度200-250r/min，通风量(V/V)1:1-3,培养时间60-85h；溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15-30％；pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在5.5-6.5；
方法②
将步骤(2)中一级种子罐发酵液4-6％接种量接入发酵罐，培养温度30-37℃，搅拌速度200-250r/min，通风量(V/V)1:1-3,培养时间10-15h，然后以1.5-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，恒温培养10-15h；继续以1.5-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，将一级种子 罐发酵液以2-4％接种量追加接入发酵罐，恒温培养10-15h；最后以1.5-2℃/h升温速率缓慢升至30-37℃，恒温培养20-40h；
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15-30％；pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在5.5-6.5；
方法①和②中所述发酵培养基组成为：麦芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆饼粉15-25g，中草药剂粉30-50g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米浆1-5g，硫酸铵1-3g，磷酸氢二钾1-2g，磷酸二氢钾1-2g，柠檬酸钠1-5g，消泡剂0.1-1g,纯净水l000mL，pH值5.5-6.5，121℃灭菌20min；
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪20-30份；党参10-18份；柴胡10-15份；黄芩10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度到30-35℃，pH值6-7，按质量比添加0.2-0.35％纤维素酶酶解1-2小时，控制温度70℃～90℃保持5-10分钟，然后降温至45-60℃，pH为5.0-7.0，按重量比分别加入0.12-0.25％的木瓜蛋白酶和果胶酶酶解40-60分钟，冷却到5-10℃保持1.5-2小时，升高温度到85-95℃保持10-25分钟，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60℃～78℃保持3～4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1-1.5。
所述发酵培养基的调配方法为：
按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节pH值5.5-6.5，加入中温淀粉酶(3u/g玉米粉)与高温淀粉酶(30u/g玉米粉)，同时边搅拌边升温至70℃保温15-30min，然后缓慢升温至90℃保温15-30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始pH5.5-6.5，121-123℃灭菌30-40min备用。
(4)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得中温α-淀粉酶。
有益效果：
1、由本发明所述的方法制备的中温α-淀粉酶具有以下特性：
(1)该酶温度适应范围较宽，温度在55-75℃之间活性较高，最适作用温度为65℃；
热稳定性：该酶在65℃条件下保存24h仍具有80-83％酶活，70℃条件下保存12h仍具有50-60％以上酶活。
(2)该酶最适反应pH值为5.0。在pH值4.0-6.0之间均有较高酶活力；
酸稳定性：在pH4-6下保存18h后仍有80％以上的酶活。
(3)酶活性：菌株304通过发酵制备的酸性中温α-淀粉酶酶活力为7000-9600U/ml。特 别适合液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求。
2、本发明对枯草芽孢杆菌304培养基组成实施全程优化，添加了具有抗热应激原作用的黄芩、柴胡，添加了具有调整和修复机体功能、增强机体的免疫功能、具有微生态调节功能的黄芪、党参等，进而增强枯草芽孢杆菌304的代谢功能，使得本发明所产中温α-淀粉酶酶活力高、作用条件宽泛、稳定性强、适于工业化生产。
3、本发明中温α-淀粉酶的制备方法中培养基的重要组成部分中草药粉剂采用酶解工艺和水提醇沉工艺相结合，不仅显著提高了各种中草药的有效成分，增强了中草药的作用效力，而且还为微生物发酵提供了难得的营养物质(如中药多糖等)，使得所得的中温α-淀粉酶具有更好的耐热性和稳定性。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
一种中温α-淀粉酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化
将保存完好的枯草芽孢杆菌304的斜面菌种接种于斜面培养基，31℃培养24h进行菌种活化，如此活化2次；
所述斜面培养基组成为：牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白胨10g，葡萄糖2g,琼脂15g，蒸馏水l000mL，pH值6，121℃灭菌20min；
(2)液体种子扩大培养
①一级种子培养：将步骤(1)活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床250rpm，培养温度31℃，培养时间10h；
②二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床250rpm，培养温度38℃，培养时间10h；
④一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度31℃，搅拌速度200rpm，通风量(V/V)1:1,罐压0.05Mpa,培养时间10h；
所一级、二级、三级种子培养基重量组成为：
酵母粉0.3％，葡萄糖1％，蛋白胨0.3％，牛肉膏0.5％，磷酸氢二钾0.8％，中草药剂粉1.5％，海藻糖1％，硫酸钙1g,氯化镁2g,柠檬酸钠1g，不足部分纯净水补足，pH值6，121℃灭菌30min。
所述种子罐培养基重量组成为：
麦芽糊精5％，酵母粉0.4％，中草药剂粉1.5％，海藻糖1％，蛋白胨0.1％，玉米浆0.1％，磷酸氢二钾0.8％，硫酸镁0.05％，柠檬酸钠0.1％，不足部分纯净水补足，pH值6，121℃灭菌30min。
所述种子罐发酵液菌体浓度为7.0x 108个/ml；
(3)发酵罐发酵
将步骤(2)中一级种子罐发酵液以8％接种量接入发酵罐，培养温度31℃，搅拌速度200r/min，通风量(V/V)1:1,培养时间78h；溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15％；
pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在6；
所述发酵培养基组成为：麦芽糊精50g，玉米粉50g，豆饼粉15g，中草药剂粉30g，海藻糖30g，酵母粉4g，玉米浆1g，硫酸铵1g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾1g，柠檬酸钠1g，消泡剂0.1g,纯净水l000mL，pH值6，121℃灭菌20min；
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪20份；党参10份；柴胡10份；黄芩10份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3倍重量的水，控制温度到30℃，pH值6，按质量比添加0.2％纤维素酶酶解1小时，控制温度70℃保持5分钟，然后降温至45℃，pH为5.0，按重量比分别加入0.12％的木瓜蛋白酶和果胶酶酶解40分钟，冷却到5℃保持1.5小时，升高温度到85-95℃保持10分钟，最后添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60℃保持3h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1。
所述发酵培养基的调配方法为：
按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值4.5，加入中温淀粉酶(3u/g玉米粉)与高温淀粉酶(30u/g玉米粉)，同时边搅拌边升温至70 ℃保温15min，然后缓慢升温至90℃保温15min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始pH6，121℃灭菌30min备用。
(4)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得中温α-淀粉酶。
经上述制备方法得到发酵液经离心取上清所得的中温α-淀粉粗酶液酶活力为7200U/ml。
实施例2
一种中温α-淀粉酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化
将保存完好的枯草芽孢杆菌304的斜面菌种接种于斜面培养基，35℃培养30h进行菌种活化，如此活化3次；
所述斜面培养基组成为：牛肉膏6g，氯化钠8g，蛋白胨15g，葡萄糖5g,琼脂20g，蒸馏水l000mL，pH值6.5，121℃灭菌20min；
(2)液体种子扩大培养
①一级种子培养：将步骤(1)活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床250rpm，培养温度35℃，培养时间10h；
②二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床250rpm，培养温度35℃，培养时间10h；
④一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度35℃，搅拌速度300rpm，通风量(V/V)1:1.5,罐压0.05Mpa,培养时间15h；
所一级、二级、三级种子培养基重量组成为：
酵母粉0.4％，葡萄糖1.2％，蛋白胨0.4％，牛肉膏0.6％，磷酸氢二钾1.1％，中草药剂粉1.8％，海藻糖2％，硫酸钙1g,氯化镁2g,柠檬酸钠2g，不足部分纯净水补足，pH值6.5，123℃灭菌40min。
所述种子罐培养基重量组成为：
麦芽糊精10％，酵母粉0.6％，中草药剂粉1.8％，海藻糖2％，蛋白胨0.3％，玉米浆0.3％，磷酸氢二钾1.1％，硫酸镁0.08％，柠檬酸钠0.3％，不足部分纯净水补足，pH值6.5，123℃灭菌40min。
所述种子罐发酵液菌体浓度为8.0x 108个/ml；
(3)发酵罐发酵
将步骤(2)中一级种子罐发酵液以6％接种量接入发酵罐，培养温度35℃，搅拌速度250r/min，通风量(V/V)1:2,培养时间13h；然后以1.5℃/h降温速率缓慢降温至15℃，恒温培养13h；继续以1.5℃/h降温速率缓慢降温至3℃，此时，将一级种子罐发酵液以2％接种量追加接入发酵罐，恒温培养13h；最后以1.5℃/h升温速率缓慢升至35℃，恒温培养30h。
pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在6.5；
所述发酵培养基组成为：麦芽糊精100g，玉米粉55g，豆饼粉20g，中草药剂粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水l000mL，pH值6.5，121℃灭菌20min；
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪25份；党参15份；柴胡15份；黄芩10份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度到33℃，pH值6.5，按质量比添加0.3％纤维素酶酶解1.5小时，控制温度80℃保持8分钟，然后降温至50℃，pH为6.0，按重量比分别加入0.20％的木瓜蛋白酶和果胶酶酶解50分钟，冷却到8℃保持2小时，升高温度到90℃保持15分钟，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至70℃保持3.4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1.2。
(4)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得中温α-淀粉酶。
经上述制备方法得到发酵液经离心取上清所得的中温α-淀粉粗酶液酶活力为9500U/ml。
实施例3
一种中温α-淀粉酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化
将保存完好的枯草芽孢杆菌304的斜面菌种接种于斜面培养基，37℃培养36h进行菌种活化，如此活化3次；
所述斜面培养基组成为：牛肉膏10g，氯化钠12g，蛋白胨20g，葡萄糖5g,琼脂20g，蒸馏水l000mL，pH值6.3，121℃灭菌20min；
(2)液体种子扩大培养
①一级种子培养：将步骤(1)活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床250rpm，培养温度37℃，培养时间15h；
②二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床250rpm，培养温度37℃，培养时间15h；
④一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度37℃，搅拌速度400rpm，通风量(V/V)1:2,罐压0.05Mpa,培养时间20h；
所一级、二级、三级种子培养基重量组成为：
酵母粉0.5％，葡萄糖1.5％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.8％，磷酸氢二钾1.5％，中草药剂粉2％，海藻糖3％，硫酸钙1g,氯化镁2g,柠檬酸钠3g，不足部分纯净水补足，pH值6.3，123℃灭菌40min。
所述种子罐培养基重量组成为：
麦芽糊精15％，酵母粉0.8％，中草药剂粉2％，海藻糖3％，蛋白胨0.5％，玉米浆0.5％，磷酸氢二钾1.5％，硫酸镁0.1％，柠檬酸钠0.5％，不足部分纯净水补足，pH值6.3，123℃灭菌40min。
所述种子罐发酵液菌体浓度为8.0x 108个/ml；
(3)发酵罐发酵
将步骤(2)中一级种子罐发酵液以5％接种量接入发酵罐，培养温度37℃，搅拌速度250r/min，通风量(V/V)1:3,培养时间15h；然后以1.5℃/h降温速率缓慢降温至15℃，恒温培养15h；继续以1.5℃/h降温速率缓慢降温至5℃，此时，将一级种子罐发酵液以3％接种量追加接入发酵罐，恒温培养15h；最后以1.5℃/h升温速率缓慢升至37℃，恒温培养20h。
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧30％；
pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在6.3；
所述发酵培养基组成为：麦芽糊精150g，玉米粉60g，豆饼粉25g，中草药剂粉50g，海藻糖40g，酵母粉8g，玉米浆5g，硫酸铵3g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠5g，消泡剂1g,纯净水l000mL，pH值6.3，121℃灭菌20min；
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪30份；党参18份；柴胡15份；黄芩15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加6倍重量的水，控制温度到35℃，pH值7，按质量比添加0.35％纤维素酶酶解2小时，控制温度90℃保持10分钟，然后降温至60℃，pH为7.0，按重量比分别加入0.25％的木瓜蛋白酶和果胶酶酶解60分钟，冷却到10℃保持2小 时，升高温度到95℃保持25分钟，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至78℃保持4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1.5。
(4)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得中温α-淀粉酶。
经上述制备方法得到发酵液经离心取上清所得的中温α-淀粉粗酶液酶活力为9600U/ml。
实施例4：变温发酵效果对比
将本发明实施例2所得中温α-淀粉粗酶液为样品1，将本发明实施例2中发酵罐阶段改为35℃恒温发酵，其他条件不变所得中温α-淀粉粗酶液为样品2，pH 5.0条件下，将样品于40-90℃下保存不同的时间后测定酶活，结果显示，样品1在65℃条件下保存24h仍具有83％酶活，70℃条件下保存12h仍具有60％以上酶活；样品2在65℃条件下保存24h仍具有80％酶活，70℃条件下保存12h仍具有50％以上酶活。

Claims (6)

1.一种中温α-淀粉酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：枯草芽孢杆菌经斜面菌种活化和三级摇瓶种子培养及一级种子罐培养获得液体种子；将液体种子以4-6％接种量接入发酵罐，培养温度30-37℃，搅拌速度200-250r/min，通风量(V/V)1:1-3,培养时间10-15h；然后以1.5-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，恒温培养10-15h；继续以1.5-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，将一级种子罐发酵液以2-4％接种量追加接入发酵罐，恒温培养10-15h；最后以1.5-2℃/h升温速率缓慢升至30-37℃，恒温培养20-40h；溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15-30％；pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在5.5-6.5；发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得中温α-淀粉酶；
所述枯草芽孢杆菌具体为枯草芽孢杆菌304Bacillus subtilis304，保藏号为CCTCCNO:M2013600。
2.一种中温α-淀粉酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：枯草芽孢杆菌经斜面菌种活化和三级摇瓶种子培养及一级种子罐培养获得液体种子；将液体种子以6-10％接种量接入发酵罐，培养温度30-37℃，搅拌速度200-250r/min，通风量(V/V)1:1-3,培养时间60-85h；溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15-30％；pH控制通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在5.5-6.5；发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得中温α-淀粉酶；
所述枯草芽孢杆菌具体为枯草芽孢杆菌304Bacillus subtilis304，保藏号为CCTCCNO:M2013600。
3.根据权利要求1或2任意一项所述的一种中温α-淀粉酶的制备方法，其特征在于，所述三级种子培养，其培养基重量组成为：酵母粉0.3-0.5％，葡萄糖1-1.5％，蛋白胨0.3-0.5％，牛肉膏0.5-0.8％，磷酸氢二钾0.8-1.5％，中草药剂粉1.5-2％，海藻糖1-3％，硫酸钙1g,氯化镁2g,柠檬酸钠1-3g，不足部分纯净水补足，pH值5.5-6.5，121-123℃灭菌30-40min。
4.根据权利要求1或2任意一项所述的一种中温α-淀粉酶的制备方法，其特征在于，所述种子罐培养，其培养基重量组成为：麦芽糊精5-15％，酵母粉0.4-0.8％，中草药剂粉1.5-2％，海藻糖1-3％，蛋白胨0.1-0.5％，玉米浆0.1-0.5％，磷酸氢二钾0.8-1.5％，硫酸镁0.05-0.1％，柠檬酸钠0.1-0.5％，不足部分纯净水补足，pH值5.5-6.5，121-123℃灭菌30-40min。
5.根据权利要求1或2任意一项所述的一种中温α-淀粉酶的制备方法，其特征在于，所述发酵培养，其培养基组成为：麦芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆饼粉15-25g，中草药剂粉30-50g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米浆1-5g，硫酸铵1-3g，磷酸氢二钾1-2g，磷酸二氢钾1-2g，柠檬酸钠1-5g，消泡剂0.1-1g,纯净水l000mL，pH值5.5-6.5，121℃灭菌20min。
6.如权利要求5所述的一种中温α-淀粉酶的制备方法，其特征在于，所述中草药粉剂的制备方法如下：称取黄芪20-30份；党参10-18份；柴胡10-15份；黄芩10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度到30-35℃，pH值6-7，按质量比添加0.2-0.35％纤维素酶酶解1-2小时，控制温度70℃～90℃保持5-10分钟，然后降温至45-60℃，pH为5.0-7.0，按重量比分别加入0.12-0.25％的木瓜蛋白酶和果胶酶酶解40-60分钟，冷却到5-10℃保持1.5-2小时，升高温度到85-95℃保持10-25分钟，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60℃～78℃保持3～4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1-1.5。
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