CN103865908B - 一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，属于酶制剂制备技术领域。以产强热稳定性中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌1398-2-12为出发菌株，并进行培养基优化和发酵工艺改进，经特定发酵条件下的液体深层混合发酵而制备的中性蛋白酶酶活力为5500-7000U/mL；适用温度范围为30-75℃，最适反应温度70℃，在75℃酶活完全稳定；适用反应pH值范围为4.5-8.5，最适反应pH值为7.2。比现有的中性蛋白酶热稳定性强，酶活力较高，更适应工业化需求。

Description

一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法
技术领域
本发明属于酶制剂制备技术领域，具体是一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法。
背景技术
蛋白酶是生物体内的一类酵素（酶），它们能够分解蛋白质。分解方法是打断那些将氨基酸连结成多肽链的肽键。抑制蛋白酶活性的小分子化合物被称蛋白酶抑制剂。许多病毒蛋白酶的抑制剂是很有效的抗病毒药。蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称。按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。内肽酶将蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的眎和胨。外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶。按其活性中心和最适pH值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。
蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。微生物蛋白酶主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。
酶的应用已有千年以上的历史，虽然中性蛋白酶是最早为人类所发现并应用于工业化生产的蛋白酶制剂之一，但是广泛应用还是最近几十年的事。随着科学技术的发展，随着酶的制备、酶和细胞固定化、酶分子改造等酶技术的发展，中性蛋白酶的应用范围也不断扩大。自上世纪以来，世界各国科研工作者一直都致力于中性蛋白酶产生菌的筛选、酶提取、纯化以及酶学性质的研究和应用研究工作，取得了一定的成绩。
从目前国内中性蛋白酶发展以及研究报道来看，我国中性蛋白酶的研究总体水平来说仍处于一个起步阶段。大量研究表明，微生物发酵生产及遗传工程技术将合成特定氨基酸的基因克隆进入微生物细胞质粒中，从而借助某些微生物增殖生产等，中性蛋白酶已广泛应用，这些方法具有产量较高、生产周期短、成本低等优点。采用基因工程与传统的微生物育种方式结合来提高菌种产酶量是一条值得继续探索的发展途径。综合过去已经取得的成绩以及在研究中存在的问题，今后发展的方向主要有以下几个方面：1.继续通过基因工程与传统的微生物育种技术进一步提高微生物产酶能力。2.采用酶体外定向技术改变酶的底物特异性与适应性，如底物亲和力、pH适应性、耐热性以及耐氧化性等等,为开拓酶的新应用领域做出贡献。3.继续寻找产中性蛋白酶新的菌种，特别是极端微生物源中性蛋白酶显得尤为重要。4.在应用方面，继续开发酶的应用领域，同时，积极开展理论与应用研究，为此酶在食品与其它行业发展中如何做出更大贡献，将是未来营养研究的重要领域，必将为食品与其它行业高效、持续、稳定发展开辟新的广阔前景。
国内目前从事中性蛋白酶生产与销售的酶制剂企业很少，主要是由于所采用生产菌种大多为上世纪八十年代所开发的诱变菌株，产酶能力下降、不太稳定、部分优良性状出现部分退化或丧失，且易受到酵母及噬菌体的污染，对生产造成一定程度的损失。加之，目前我国中性蛋白酶发酵单位相对较低，浓缩成本高，不便保存与运输，而且，通常情况下，酶保存技术属商业机密，因此，有关中性蛋白酶酶保藏的研究仍是一个值得研究的领域。如何获得新的产中性蛋白酶菌株、提高菌株产酶能力以及如何保藏酶将成为一个发展方向。
中国专利CN1289659C公开了一种产高温中性蛋白酶的地衣芽孢杆菌及其制备高温中性蛋白酶的工艺和高温中性蛋白酶，所述中性蛋白酶适用反应温度为50-70℃，最适反应温度为65℃，适用pH值为5-8，最适pH值为7.0-7.2。在50℃保温1小时酶活力下降10%，在60℃下酶的半衰期45分钟。
中性蛋白酶是能催化蛋白质肽键水解,最适作用pH值在7.0左右的蛋白酶。中性蛋白酶由于具有催化反应速度快、无工业污染、催化反应条件适应性较宽等性质和优点,被应用于食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业,但是由于中性蛋白酶热稳定性差,生产与使用条件复杂,限制了它进一步应用的范围，进一步优化选育产中性蛋白酶的优良菌株，生产出热稳定性强的中性蛋白酶对酶制剂的工业化生产具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所解决的技术问题是克服现有中性蛋白酶热稳定性差的缺陷，以产强热稳定性中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）1398-2-12为出发菌株，并进行培养基优化和发酵工艺改进，经特定发酵条件下的液体深层混合发酵，制得一种热稳定性强、酶活力较高的中性蛋白酶。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化
将保存完好的枯草芽孢杆菌1398-2-12的斜面菌种接种于斜面培养基，30-36℃培养24-36h进行菌种活化，如此活化2-3次；
所述斜面培养基组成为：牛肉膏3-10g，氯化钠5-12g，蛋白胨10-20g，葡萄糖2-5g,(NH)2SO43-5g，K2HPO46-8g，CaCl21-3g，琼脂15-20g，中草药粉剂5-10g，蒸馏水l000mL，pH值7.0-7.2，121℃灭菌20min；
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪20-30份；党参10-18份；柴胡10-15份；黄芩10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70℃～90℃保持2～4h，然后降温至45-60℃，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60℃～78℃保持3～4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
所述混合酶添加量为混合物料总重量的5-10%。
所述混合酶的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶10-20份，外β-葡聚糖酶10-20份，β-葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普鲁兰酶20-30份，β-淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5-10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1-1.5。
（2）液体种子扩大培养
①一级种子培养：将步骤（1）活化后的斜面菌种1-2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度30-36℃，培养时间10-15h；
②二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度30-36℃，培养时间10-15h；
④一级种子罐培养：将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度30-36℃，搅拌速度200-400rpm，通风量（V/V）1:1-2,罐压0.05Mpa,培养时间10-20h；
所述一级、二级、三级种子培养基重量百分比组成为：
酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，中草药粉剂1.5-2%，海藻糖1-3%，硫酸钙1g,氯化镁2g,柠檬酸钠1-3g，不足部分纯净水补足，pH值7.0-7.2，121-123℃灭菌30-40min。
所述种子罐培养基重量百分比组成为：
麦芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，中草药粉剂1.5-2%，海藻糖1-3%，蛋白胨0.1-0.5%，玉米浆0.1-0.5%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，硫酸镁0.05-0.1%，柠檬酸钠0.1-0.5%，不足部分纯净水补足，pH值7.0-7.2，121-123℃灭菌30-40min。
所述种子罐发酵液菌体浓度为7.0x108-8.0x108个/ml；
（3）发酵罐发酵
将步骤（2）中一级种子罐发酵液以6%接种量接入发酵罐，培养温度30-36℃，搅拌速度200-700r/m，通风量（V/V）1:1-3,培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，将步骤（2）中一级种子罐发酵液以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h；最后以1-2℃/h升温速率缓慢升温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至30-36℃，恒温培养15-20h；
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15-30%；
PH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在7.0-7.2；
补料控制：添加补料培养基，以维持发酵液还原糖含量为2-5mg/ml；
放罐标准：60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
所述发酵培养基组成为：麦芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆饼粉15-25g，中草药粉剂30-50g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米浆1-5g，硫酸铵1-3g，磷酸氢二钾1-2g，磷酸二氢钾1-2g，柠檬酸钠1-5g，消泡剂0.1-1g,纯净水l000mL，pH值7.0-7.2，121℃灭菌20min；
所述补料培养基重量百分比组成为：麦芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15-25%，中草药剂粉5-10%，不足部分纯净水补足，pH值7.0-7.2，121-123℃灭菌30-40min。
所述发酵培养基的调配方法为：
按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值7.0-7.2，加入中温淀粉酶（3u/g玉米粉）与高温淀粉酶（30u/g玉米粉），同时边搅拌边升温至70℃保温15-30min，然后缓慢升温至90℃保温15-30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始PH7.0-7.2，121-123℃灭菌30-40min备用。
（4）发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得强热稳定性中性蛋白酶。
所述调配过程加入浓缩酶液总重量0.5-5%中草药粉剂。
本发明提供的枯草芽孢杆菌1398-2-12是由实验室保藏的一株产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）1398-2经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得。
本发明提供的产强热稳定性中性蛋白酶的菌株具体为枯草芽孢杆菌1398-2-12。该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072），保藏号为CCTCC NO：M2013539，分类命名：枯草芽孢杆菌1398-2-12（Bacillus subtilis1398-2-12）。
本发明提供的枯草芽孢杆菌1398-2-12具有所产中性蛋白酶耐受温度高、适用pH值范围宽泛的特点，发酵液粗酶液75℃酶活完全稳定，最适反应温度70℃，pH值4.5-8.5酶活稳定，最适反应pH值7.2。该菌株最适生长PH值7.0-7.2，最适生长温度30-36℃，最适产酶温度32-35℃。
按诱变筛选方案，对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选，得到一株产强热稳定性中性蛋白酶的菌株枯草芽孢杆菌菌1398-2-12，发酵液中性蛋白酶酶活可达5500-7000U/mL，对酶的热稳定性进行了分析，将粗酶液分别置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃下，每隔10分钟取样测定酶活。40℃、45℃、50℃、55℃下，60分钟酶活没有下降。60℃与65℃下，30分钟降到原有酶活的95％，60分钟降到85％。70℃下，30分钟降到原有酶活的85％，60分钟降到80％。75℃下，30分钟降到原有酶活的80％，60分钟降到70％。
有益效果：
1.本发明的制备强热稳定性中性蛋白酶的方法以以产强热稳定性中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌1398-2-12为出发菌株，制备的强热稳定性中性蛋白酶酶活力为5500-7000U/mL；适用温度范围为30-75℃，最适反应温度70℃，在75℃酶活完全稳定；适用反应pH值范围为4.5-8.5，最适反应pH值为7.2。比现有的中性蛋白酶热稳定性强，酶活力较高，更适应工业化需求。
2.本发明强热稳定性中性蛋白酶的制备方法采用梯度降温和梯度升温的发酵工艺显著提高了枯草芽孢杆菌1398-2-12的抗应激能力，致使菌株产酶能力最大限度地显现。并且本发明对枯草芽孢杆菌1398-2-12培养基组成实施全程优化，添加了具有抗热应激原作用的黄芩、柴胡，添加了具有调整和修复机体功能、增强机体的免疫功能、具有微生态调节功能的黄芪、党参等，进一步增强了微生物在同一发酵环境下的机体功能性、传代适应性和共同协作性，进而增枯草芽孢杆菌1398-2-12的代谢功能，使得本发明所产强热稳定性中性蛋白酶热稳定强、酶活力较高、作用条件宽泛、稳定性强、适于工业化生产。
3.本发明强热稳定性中性蛋白酶的制备方法中培养基的重要组成部分中草药粉剂采用酶解工艺和水提醇沉工艺相结合，显著提高了各种中草药的有效成分，不仅增强了中草药的作用效力，而且还为微生物发酵提供了难得的营养物质(如中药多糖等)。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化
将保存完好的枯草芽孢杆菌1398-2-12的斜面菌种接种于斜面培养基，36℃培养36h进行菌种活化，如此活化3次；
所述斜面培养基组成为：牛肉膏10g，氯化钠12g，蛋白胨20g，葡萄糖5g,(NH)2SO45g，K2HPO48g，CaCl23g，琼脂20g，中草药粉剂10g，蒸馏水l000mL，pH值7.2，121℃灭菌20min；
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪30份；党参18份；柴胡15份；黄芩15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加6倍重量的水，控制温度90℃保持4h，然后降温至60℃，加入混合物料总重量10%的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6.8，酶解4h，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1.5，控制温度至78℃保持4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
所述混合酶的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶20份，外β-葡聚糖酶20份，β-葡萄糖苷酶15份，木聚糖酶20份，戊聚糖酶20份，普鲁兰酶30份，β-淀粉酶15份，中性蛋白酶15份，酸性蛋白酶15份，超氧化物歧化酶10份，葡萄糖氧化酶10份，酸性磷酸酶10份。
（2）液体种子扩大培养
①一级种子培养：将步骤（1）活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度36℃，培养时间15h；
②二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度36℃，培养时间15h；
④一级种子罐培养：将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度36℃，搅拌速度400rpm，通风量（V/V）1:2,罐压0.05Mpa,培养时间20h；
所述一级、二级、三级种子培养基重量百分比组成为：
酵母粉0.5%，葡萄糖1.5%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.8%，磷酸氢二钾1.5%，中草药粉剂2%，海藻糖3%，硫酸钙1g,氯化镁2g,柠檬酸钠3g，不足部分纯净水补足，pH值7.2，123℃灭菌40min。
所述种子罐培养基重量百分比组成为：
麦芽糊精15%，酵母0.8%，中草药粉剂2%，海藻糖3%，蛋白胨0.5%，玉米浆0.5%，磷酸氢二钾1.5%，硫酸镁0.1%，柠檬酸钠0.5%，不足部分纯净水补足，pH值7.2，123℃灭菌40min。
所述种子罐发酵液菌体浓度为8.0x108个/ml；
（3）发酵罐发酵
将步骤（2）中一级种子罐发酵液以6%接种量接入发酵罐，培养温度36℃，搅拌速度700r/m，通风量（V/V）1:3,培养时间15h；然后以2℃/h降温速率缓慢降温至15℃，恒温培养20h；继续以2℃/h降温速率缓慢降温至5℃，此时，将步骤（2）中一级种子罐发酵液以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养30h；最后以2℃/h升温速率缓慢升温至15℃，恒温培养20h；继续以2℃/h升温速率缓慢升温至36℃，恒温培养20h；
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧30%；
PH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在7.2；
补料控制：添加补料培养基，以维持发酵液还原糖含量为2-5mg/ml；
放罐标准：60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
所述发酵培养基组成为：麦芽糊精150g，玉米粉60g，豆饼粉25g，中草药粉剂50g，海藻糖40g，酵母粉8g，玉米浆5g，硫酸铵3g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠5g，消泡剂1g,纯净水l000mL，pH值7.2，121℃灭菌20min；
所述补料培养基重量百分比组成为：麦芽糊精30%，玉米粉20%，豆粉25%，中草药剂粉10%，不足部分纯净水补足，pH值7.2，123℃灭菌40min。
所述发酵培养基的调配方法为：
按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值7.2，加入中温淀粉酶（3u/g玉米粉）与高温淀粉酶（30u/g玉米粉），同时边搅拌边升温至70℃保温30min，然后缓慢升温至90℃保温30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始PH7.2，123℃灭菌40min备用。
（4）发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得强热稳定性中性蛋白酶，所述调配过程加入浓缩酶液总重量5%中草药粉剂。
实施例2
一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化
将保存完好的枯草芽孢杆菌1398-2-12的斜面菌种接种于斜面培养基，30℃培养24h进行菌种活化，如此活化2次；
所述斜面培养基组成为：牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白胨10g，葡萄糖2g,(NH)2SO43g，K2HPO46g，CaCl21g，琼脂15g，中草药粉剂5g，蒸馏水l000mL，pH值7.0，121℃灭菌20min；
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪20份；党参10份；柴胡10份；黄芩10份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3倍重量的水，控制温度70℃保持2h，然后降温至45℃，加入混合物料总重量5%的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5，酶解2h，最后添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1，控制温度至60℃保持3h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
所述混合酶的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶10份，外β-葡聚糖酶10份，β-葡萄糖苷酶10份，木聚糖酶15份，戊聚糖酶15份，普鲁兰酶20份，β-淀粉酶10份，中性蛋白酶10份，酸性蛋白酶10份，超氧化物歧化酶5份，葡萄糖氧化酶5份，酸性磷酸酶5份。
（2）液体种子扩大培养
①一级种子培养：将步骤（1）活化后的斜面菌种1环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度30℃，培养时间10h；
②二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度30℃，培养时间10h；
④一级种子罐培养：将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度30℃，搅拌速度200rpm，通风量（V/V）1:1,罐压0.05Mpa,培养时间10h；
所述一级、二级、三级种子培养基重量百分比组成为：
酵母粉0.3%，葡萄糖1%，蛋白胨0.3%，牛肉膏0.5%，磷酸氢二钾0.8%，中草药粉剂1.5%，海藻糖1%，硫酸钙1g,氯化镁2g,柠檬酸钠1g，不足部分纯净水补足，pH值7.0，121℃灭菌30min。
所述种子罐培养基重量百分比组成为：
麦芽糊精5%，酵母粉0.4%，中草药粉剂1.5%，海藻糖1%，蛋白胨0.1%，玉米浆0.1%，磷酸氢二钾0.8%，硫酸镁0.05%，柠檬酸钠0.1%，不足部分纯净水补足，pH值7.0，121℃灭菌30min。
所述种子罐发酵液菌体浓度为7.0x108个/ml；
（3）发酵罐发酵
将步骤（2）中一级种子罐发酵液以6%接种量接入发酵罐，培养温度30℃，搅拌速度200r/m，通风量（V/V）1:1,培养时间10h；然后以1℃/h降温速率缓慢降温至10℃，恒温培养15h；继续以1℃/h降温速率缓慢降温至2℃，此时，将步骤（2）中一级种子罐发酵液以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20h；最后以1℃/h升温速率缓慢升温至10℃，恒温培养15h；继续以1℃/h升温速率缓慢升温至30℃，恒温培养15h；
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15%；
PH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在7.0；
补料控制：添加补料培养基，以维持发酵液还原糖含量为2-5mg/ml；
放罐标准：60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
所述发酵培养基组成为：麦芽糊精50g，玉米粉50g，豆饼粉15g，中草药粉剂30g，海藻糖30g，酵母粉4g，玉米浆1g，硫酸铵1g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾1g，柠檬酸钠1g，消泡剂0.1g,纯净水l000mL，pH值7.0，121℃灭菌20min；
所述补料培养基重量百分比组成为：麦芽糊精20%，玉米粉10%，豆粉15%，中草药剂粉5%，不足部分纯净水补足，pH值7.0，121℃灭菌30min。
所述发酵培养基的调配方法为：
按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值7.0，加入中温淀粉酶（3u/g玉米粉）与高温淀粉酶（30u/g玉米粉），同时边搅拌边升温至70℃保温15min，然后缓慢升温至90℃保温15min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始PH7.0，121℃灭菌30min备用。
（4）发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得强热稳定性中性蛋白酶，所述调配过程加入浓缩酶液总重量0.5%中草药粉剂。
实施例3
一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化
将保存完好的枯草芽孢杆菌1398-2-12的斜面菌种接种于斜面培养基，33℃培养30h进行菌种活化，如此活化2次；
所述斜面培养基组成为：牛肉膏6g，氯化钠8g，蛋白胨15g，葡萄糖4g,(NH)2SO44g，K2HPO47g，CaCl22g，琼脂18g，中草药粉剂8g，蒸馏水l000mL，pH值7.2，121℃灭菌20min；
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪25份；党参16份；柴胡12份；黄芩12份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度80℃保持3h，然后降温至50℃，加入混合物料总重量8%的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6.0，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1.2，控制温度至70℃保持4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
所述混合酶的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶15份，外β-葡聚糖酶15份，β-葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普鲁兰酶25份，β-淀粉酶12份，中性蛋白酶12份，酸性蛋白酶12份，超氧化物歧化酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶8份。
（2）液体种子扩大培养
①一级种子培养：将步骤（1）活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度33℃，培养时间12h；
②二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度33℃，培养时间12h；
④一级种子罐培养：将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度33℃，搅拌速度300rpm，通风量（V/V）1:1.5,罐压0.05Mpa,培养时间15h；
所述一级、二级、三级种子培养基重量百分比组成为：
酵母粉0.4%，葡萄糖1.2%，蛋白胨0.4%，牛肉膏0.6%，磷酸氢二钾1.0%，中草药粉剂1.8%，海藻糖2%，硫酸钙1g,氯化镁2g,柠檬酸钠2g，不足部分纯净水补足，pH值7.2，121℃灭菌30min。
所述种子罐培养基重量百分比组成为：
麦芽糊精10%，酵母粉0.5%，中草药粉剂1.8%，海藻糖2%，蛋白胨0.2%，玉米浆0.3%，磷酸氢二钾1.0%，硫酸镁0.08%，柠檬酸钠0.3%，不足部分纯净水补足，pH值7.2，121℃灭菌30min。
所述种子罐发酵液菌体浓度为7.5x108个/ml；
（3）发酵罐发酵
将步骤（2）中一级种子罐发酵液以6%接种量接入发酵罐，培养温度35℃，搅拌速度400r/m，通风量（V/V）1:2,培养时间12h；然后以2℃/h降温速率缓慢降温至12℃，恒温培养18h；继续以2℃/h降温速率缓慢降温至4℃，此时，将步骤（2）中一级种子罐发酵液以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养25h；最后以2℃/h升温速率缓慢升温至12℃，恒温培养18h；继续以2℃/h升温速率缓慢升温至33℃，恒温培养18h；
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧20%；
PH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在7.2；
补料控制：添加补料培养基，以维持发酵液还原糖含量为2-5mg/ml；
放罐标准：60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
所述发酵培养基组成为：麦芽糊精100g，玉米粉55g，豆饼粉20g，中草药粉剂40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水l000mL，pH值7.2，121℃灭菌20min；
所述补料培养基重量百分比组成为：麦芽糊精25%，玉米粉15%，豆粉20%，中草药剂粉8%，不足部分纯净水补足，pH值7.2，121℃灭菌30min。
所述发酵培养基的调配方法为：
按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值7.2，加入中温淀粉酶（3u/g玉米粉）与高温淀粉酶（30u/g玉米粉），同时边搅拌边升温至70℃保温20min，然后缓慢升温至90℃保温20min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始PH7.2，121℃灭菌30min备用。
（4）发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得强热稳定性中性蛋白酶，所述调配过程加入浓缩酶液总重量3%中草药粉剂。
实施例4：中性蛋白酶的热稳定性分析
将实施例1粗酶液分别置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃下，每隔10分钟取样测定酶活。粗酶液40℃、45℃、50℃、55℃下，60分钟酶活没有下降。60℃与65℃下，30分钟降到原有酶活的95％，60分钟降到85％。70℃下，30分钟降到原有酶活的85％，60分钟降到80％。75℃下，30分钟降到原有酶活的80％，60分钟降到70％。
实施例5：中性蛋白酶pH稳定性分析
将实施例1粗酶液分别置于pH值3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5下，每隔10分钟取样测定酶活。粗酶液pH值5.5、6.5、7.5下，60分钟酶活没有下降。pH值4.5与8.5下，30分钟降到原有酶活的95％，60分钟降到85％。pH值3.5下，30分钟降到原有酶活的80％，60分钟降到70％。

Claims (7)

1.一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，以枯草芽孢杆菌CCTCC M 2013539为出发菌株经液体深层发酵制备，包括如下步骤：枯草芽孢杆菌CCTCC M 2013539经菌种活化和逐级扩大培养获得液体种子；将液体种子以6％接种量接入发酵罐，培养温度30-36℃，搅拌速度200-700r/m，通风量1:1-3V/V,培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，将液体种子以4％接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h；最后以1-2℃/h升温速率缓慢升温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至30-36℃，恒温培养15-20h；发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体中性蛋白酶；所述调配过程加入浓缩酶液总重量0.5-5％中草药粉剂；
所述中草药粉剂的制备方法如下：称取黄芪20-30份；党参10-18份；柴胡10-15份；黄芩10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70℃-90℃保持2-4h，然后降温至45-60℃，加入混合物料总重量5-10％的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇的质量比例为1：1-1.5，控制温度至60℃-78℃保持3-4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；
所述混合酶制剂的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶10-20份，外β-葡聚糖酶10-20份，β-葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普鲁兰酶20-30份，β-淀粉酶10-15份，中性蛋白酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，超氧化物歧化酶5-10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
2.如权利要求1所述的一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，制备中性蛋白酶时斜面培养基组成为：牛肉膏3-10g，氯化钠5-12g，蛋白胨10-20g，葡萄糖2-5g,(NH)2SO43-5g，K2HPO46-8g，CaCl21-3g，琼脂15-20g，中草药粉剂5-10g，蒸馏水l000mL，pH值7.0-7.2。
3.如权利要求1所述的一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，制备中性蛋白酶时种子罐培养基重量百分比组成为：麦芽糊精5-15％，酵母粉0.4-0.8％，中草药粉剂1.5-2％，海藻糖1-3％，蛋白胨0.1-0.5％，玉米浆0.1-0.5％，磷酸氢二钾0.8-1.5％，硫酸镁0.05-0.1％，柠檬酸钠0.1-0.5％，不足部分纯净水补足，pH值7.0-7.2。
4.如权利要求1所述的一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，制备中性蛋白酶时发酵培养基组成为：麦芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆饼粉15-25g，中草药粉剂30-50g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米浆1-5g，硫酸铵1-3g，磷酸氢二钾1-2g，磷酸二氢钾1-2g，柠檬酸钠1-5g，消泡剂0.1-1g,纯净水l000mL，pH值7.0-7.2。
5.如权利要求1所述的一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，制备中性蛋白酶时补料培养基重量百分比组成为：麦芽糊精20-30％，玉米粉10-20％，豆粉15-25％，中草药粉剂5-10％，不足部分纯净水补足，pH值7.0-7.2。
6.如权利要求1所述的一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，制备中性蛋白酶时种子罐发酵液菌体浓度为7.0x 108-8.0x 108个/ml。
7.如权利要求1所述的一种强热稳定性中性蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌种活化
将保存完好的枯草芽孢杆菌CCTCC M 2013539的斜面菌种接种于斜面培养基，36℃培养36h进行菌种活化，如此活化3次；
所述斜面培养基组成为：牛肉膏10g，氯化钠12g，蛋白胨20g，葡萄糖5g,(NH)2SO45g，K2HPO48g，CaCl23g，琼脂20g，中草药粉剂10g，蒸馏水l000mL，pH值7.2，121℃灭菌20min；
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪30份；党参18份；柴胡15份；黄芩15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加6倍重量的水，控制温度90℃保持4h，然后降温至60℃，加入混合物料总重量10％的混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6.8，酶解4h，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1.5，控制温度至78℃保持4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；
所述混合酶制剂的重量份数组成为：内β-葡聚糖酶20份，外β-葡聚糖酶20份，β-葡萄糖苷酶15份，木聚糖酶20份，戊聚糖酶20份，普鲁兰酶30份，β-淀粉酶15份，中性蛋白酶15份，酸性蛋白酶15份，超氧化物歧化酶10份，葡萄糖氧化酶10份，酸性磷酸酶10份；
(2)液体种子扩大培养
①一级种子培养：将步骤(1)活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度36℃，培养时间15h；
②二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度36℃，培养时间15h；
④一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度36℃，搅拌速度400rpm，通风量1:2V/V,罐压0.05Mpa,培养时间20h；
一级、二级、三级种子培养基重量百分比组成为：
酵母粉0.5％，葡萄糖1.5％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.8％，磷酸氢二钾1.5％，中草药粉剂2％，海藻糖3％，硫酸钙1g,氯化镁2g,柠檬酸钠3g，不足部分纯净水补足，pH值7.2，123℃灭菌40min；
种子罐培养基重量百分比组成为：
麦芽糊精15％，酵母0.8％，中草药粉剂2％，海藻糖3％，蛋白胨0.5％，玉米浆0.5％，磷酸氢二钾1.5％，硫酸镁0.1％，柠檬酸钠0.5％，不足部分纯净水补足，pH值7.2，123℃灭菌40min；
所述种子罐发酵液菌体浓度为8.0x 108个/ml；
(3)发酵罐发酵
将步骤(2)中一级种子罐发酵液以6％接种量接入发酵罐，培养温度36℃，搅拌速度700r/m，通风量1:3V/V,培养时间15h；然后以2℃/h降温速率缓慢降温至15℃，恒温培养20h；继续以2℃/h降温速率缓慢降温至5℃，此时，将步骤(2)中一级种子罐发酵液以4％接种量追加接入发酵罐，恒温培养30h；最后以2℃/h升温速率缓慢升温至15℃，恒温培养20h；继续以2℃/h升温速率缓慢升温至36℃，恒温培养20h；
发酵培养基组成为：麦芽糊精150g，玉米粉60g，豆饼粉25g，中草药粉剂50g，海藻糖40g，酵母粉8g，玉米浆5g，硫酸铵3g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠5g，消泡剂1g,纯净水l000mL，pH值7.2，121℃灭菌20min；
补料培养基重量百分比组成为：麦芽糊精30％，玉米粉20％，豆粉25％，中草药粉剂10％，不足部分纯净水补足，pH值7.2，123℃灭菌40min；
发酵培养基的调配方法为：
按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节pH值7.2，加入中温淀粉酶3u/g玉米粉与高温淀粉酶30u/g玉米粉，同时边搅拌边升温至70℃保温30min，然后缓慢升温至90℃保温30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始pH7.2，121℃灭菌20min备用；
(4)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得强热稳定性中性蛋白酶，所述调配过程加入浓缩酶液总重量5％中草药粉剂。
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