CN103820419B - 一种热稳定性好的β‑葡聚糖酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种热稳定性好的β‑葡聚糖酶的制备方法，属于酶制剂制备技术领域。以保藏编号为CCTCC NO:M2013538的地衣芽孢杆菌（Βacillus licheniformis）β‑10‑25为菌种，经菌种活化、液体种子培养、发酵罐培养等步骤制备而成，制备的热稳定性好的β‑葡聚糖酶8000‑10000u/ml,是原始菌株的2.5倍；在50‑70℃条件下具有较高酶活，最适反应温度为65℃；适用反应pH值范围为5.0；在室温下保存6个月后酶活损失小于25%，4℃保存12个月后酶活损失小于20%。比现有的β‑葡聚糖酶酶活力高，酶作用最适pH值范围宽泛，热稳定性及储存稳定性均较高，特别适合饲料酶的工业化需求。

Description

一种热稳定性好的β-葡聚糖酶的制备方法
技术领域
本发明属于酶制剂制备技术领域，特别是一种高产热稳定性好的β-葡聚糖酶的地衣芽孢杆菌。
背景技术
β-葡聚糖是一种天然多糖，通常存在于特殊种类的细菌、酵母菌及真菌的细胞壁，或者高等植物种子的包被中。β-葡聚糖是构禾本植物细胞壁的一种结构性非淀粉多糖，在大麦、黑麦、高粱、大米及小米的胚乳细胞壁中含量尤其高。与一般糖类主要以α-1，4-糖苷键结合而成为线形分子不同的是，植物细胞壁中的β-葡聚糖是以混合的β-（1,3），（1,4）糖苷键连接形成的D型葡萄糖聚合物，因此β-葡聚糖可以以很大的分子量溶解于水中，从而具有粘度大、亲水性高、吸水膨胀力和持水性高的性质。当以大麦作为啤酒生产原料时，上述性质便会影响麦芽汁的过滤速度，降低固形物的浸出率，还会因凝胶沉淀作用而降低啤酒的品质；同时当含有β-葡聚糖的作物用作饲料时，会增加非反刍禽畜的肠液粘度，成为饲料的抗营养因子之一，降低饲料的利用率。
β-葡聚糖酶是高效、专一分解β-葡聚糖的主要酶，在啤酒和饲料的生产过程中添加该酶能有效的解决上述问题。在饲料工业中它能水解β-葡聚糖中的1-3或1-4糖苷键，使之降解为低分子糖，降解后的β-葡聚糖市区亲属性和粘性，不会在畜禽肠道中膨胀粘连，使得食糜的消化率以及饲料的能量利用率均得到提高。β-葡聚糖酶应用于啤酒生产中，可以转移分解粘度很高的各种大麦β-葡聚糖，疏松大麦胚乳细胞壁，促进细胞内容物的外溢，提高原料利用率，降低麦芽汁粘度，从而使啤酒产量增加，品质得以提升。
目前，美国、日本、丹麦、德国、澳大利亚、加拿大等国均已采用β-葡聚糖酶作为啤酒和饲料工业的主要酶制剂，而其在医药、纺织、废水处理和日用化工、生物防治等其他方面的应用价值也逐渐显现出来，前景十分广阔。但是热稳定性差和酶活力低已经成为影响其应用效果的制约因素。
中国专利CN103013873A公开了一株产热稳定性β-葡聚糖酶的菌株，该发明首次提供了一株来源于温泉的能够生产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高地芽孢杆菌，并克隆得到了该酶的基因，该酶在60℃条件下保存1h后仍能保持90%的酶活力。
中国专利CN102719416A提供了一种提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶热稳定性的方法，通过HNO2对β-1,3-1,4-葡聚糖酶进行化学修饰，所得的β-1,3-1,4-葡聚糖酶T50值和t（1/2,60℃）分别提高了4.76%和62.1%。
之前，市场上高品质的β-葡聚糖酶几乎被国外的酶制剂生产公司所垄断，虽然近几年我国所报道的微生物产β-葡聚糖酶的酶活力已达到甚至超过了国际水平，但是能够获得兼具高活性及热稳定性的β-葡聚糖酶及其生产菌株仍然是目前工业应用中亟待解决的一大问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种热稳定性好的β-葡聚糖酶的制备方法。
本发明提供的产热稳定性好的β-葡聚糖酶的菌株具体为地衣芽孢杆菌（Βacillus licheniformis）β-10-25。该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院），保藏号为CCTCC NO：M2013538。
所述地衣芽孢杆菌（Βacillus licheniformis）β-10-25特点如下：
所述菌株在固体平板上菌落为白色，边缘不整齐，表面干燥不透明，镜检为革兰氏阳性细菌，细胞形态呈短杆状，芽孢中生，椭圆形，不膨大。
所述菌株生理生化特征：V-P试验（+），淀粉水解（+），酪素水解（+），明胶水解（+），硝酸盐还原（+），吲哚试验（-），利用柠檬酸盐（+），硝酸还原（+），甘露醇（+），木糖（+）。
一种热稳定性好的β-葡聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：
（1）种子培养
将β-10-25斜面菌种经三级摇瓶发酵剂一级种子罐发酵；
所述种子培养的培养基为：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl1％，pH4.5-7.0，121-123℃灭菌30-40min。
（2）发酵罐发酵
将一级种子罐发酵液以3%接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度35-45℃，搅拌速度200-300r/min，通风量（V/V）1:1-3,培养时间10-15h；然后将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35-45℃时恒温培养15-20h；此时，将一级种子罐发酵液以2%接种量追加接入发酵罐，恒温培养10-15h；继续将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35-45℃时恒温培养10-15h；
所述发酵培养基组成为：麦麸75g，玉米粉55g，米糠25g，豆饼粉20g，β-葡聚糖2g，中草药剂粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水l000mL，pH值4.5-7.0，121℃灭菌20min；
所述发酵培养基的调配方法为：按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值3-7，加入中温淀粉酶（3u/g玉米粉）与高温淀粉酶（30u/g玉米粉），同时边搅拌边升温至70℃保温15-30min，然后缓慢升温至90℃保温15-30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，pH3-7，121-123℃灭菌30-40min备用。
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪20-30份；党参10-18份；柴胡10-15份；麦冬10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70℃～90℃保持2～4h，然后降温至45-60℃，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，110W功率下超声萃取0.5～1.5h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；
所述混合酶添加量为混合物料总重量的5-10%；
所述混合酶的重量份数组成为：β-葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普鲁兰酶20-30份，β-淀粉酶10-15份，果胶酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，木瓜蛋白酶5-10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份；
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1-1.5。
（3）发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得β-葡聚糖酶。
经上述制备方法得到的β-葡聚糖酶液体酶活力为8000-10000u/ml。
有益效果：
1.本发明方法制备的β-葡聚糖酶酶活力高达8000-10000u/ml，是原始菌株的2.5倍；在50-70℃条件下具有较高酶活，最适反应温度为65℃；适用反应pH值范围为5.0；在室温下保存6个月后酶活损失小于25%，4℃保存12个月后酶活损失小于20%。制得的酶比现有的β-葡聚糖酶酶活力高，酶作用最适pH值范围宽泛，热稳定性及储存稳定性均较高，特别适合反应温度高、液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求。
2.本发明对地衣芽孢杆菌β-10-25培养基组成实施全程优化，添加了具有抗热应激原作用的黄芩、柴胡，添加了具有调整和修复机体功能、增强机体的免疫功能、具有微生态调节功能的黄芪、党参等，进一步增强了两种微生物在同一发酵环境下的机体功能性、传代适应性和共同协作性，进而增强地衣芽孢杆菌β-10-25的代谢功能，使得本发明所产β-葡聚糖酶酶活力高、作用条件宽泛、稳定性强、适于工业化生产。
3.本发明β-葡聚糖酶的制备方法中培养基的重要组成部分中草药粉剂采用酶解工艺和水提醇沉工艺相结合，不仅显著提高了各种中草药的有效成分，增强了中草药的作用效力，而且还为微生物发酵提供了难得的营养物质(如中药多糖等)。添加具有抗热应激原作用的黄芩、柴胡，使得所得的β-葡聚糖酶具有更好的稳定性和保存活性。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
一种β-葡聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：
（1）液体种子扩大培养
①一级种子培养：将活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度40℃，培养时间10h；
②二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度40℃，培养时间12h；
④一级种子罐培养：将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度41℃，搅拌速度300rpm，通风量（V/V）1:1.5,罐压0.05Mpa,培养时间15h；
所述种子培养基组成为：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl1％，pH5.5，121℃灭菌35min。
（2）发酵罐发酵
将一级种子罐发酵液以3%接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度37℃，搅拌速度250r/min，通风量（V/V）1:1-3,培养时间12h；然后将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至37℃时恒温培养18h；此时，将一级种子罐发酵液以2%接种量追加接入发酵罐，恒温培养12h；继续将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至37℃时恒温培养12h；
所述发酵培养基组成为：麦麸75g，玉米粉55g，米糠25g，豆饼粉20g，β-葡聚糖2g，中草药剂粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水l000mL，pH值5.5，121℃灭菌20min；
所述发酵培养基的调配方法为：按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值5.5，加入中温淀粉酶（3u/g玉米粉）与高温淀粉酶（30u/g玉米粉），同时边搅拌边升温至70℃保温20min，然后缓慢升温至90℃保温20min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，pH5.5，121℃灭菌35min备用。
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪25份；党参15份；柴胡12份；麦冬12份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度80℃保持3h，然后降温至50℃，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，11W超声萃取1h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
所述混合酶添加量为混合物料总重量的8%。
所述混合酶的重量份数组成为：β-葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普鲁兰酶25份，β-淀粉酶18份，果胶酶12份，酸性蛋白酶12份，木瓜蛋白酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶8份。
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1.2。
（3）发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得β-葡聚糖酶。
经上述制备方法得到的β-葡聚糖酶液体酶活力为10000u/ml。
实施例2
一种β-葡聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：
（1）液体种子扩大培养
①一级种子培养：将活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度40℃，培养时间10h；
②二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度40℃，培养时间10h；
④一级种子罐培养：将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度41℃，搅拌速度300rpm，通风量（V/V）1:1.5,罐压0.05Mpa,培养时间15h；
所述种子培养基组成为：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl1％，pH4.5，121℃灭菌30min。
（2）发酵罐发酵
将一级种子罐发酵液以3%接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度35℃，搅拌速度200r/min，通风量（V/V）1:1-3,培养时间10h；然后将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35℃时恒温培养15h；此时，将一级种子罐发酵液以2%接种量追加接入发酵罐，恒温培养10h；继续将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35℃时恒温培养10h；
所述发酵培养基组成为：麦麸75g，玉米粉55g，米糠25g，豆饼粉20g，β-葡聚糖2g，中草药剂粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水l000mL，pH值4.5，121℃灭菌20min；
所述发酵培养基的调配方法为：按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值4.5，加入中温淀粉酶（3u/g玉米粉）与高温淀粉酶（30u/g玉米粉），同时边搅拌边升温至70℃保温15min，然后缓慢升温至90℃保温15min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始PH4.5，121℃灭菌30min备用。
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪20份；党参10份；柴胡10份；麦冬10份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加6倍重量的水，控制温度70℃90℃保持2h，然后降温至45℃，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5，酶解2h，最后添加混合物料0.5倍重量乙醇和丙醇的混合物，110W功率下超声萃取0.5h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；
所述混合酶添加量为混合物料总重量的5%；
所述混合酶的重量份数组成为：β-葡萄糖苷酶10份，木聚糖酶15份，戊聚糖酶15份，普鲁兰酶20份，β-淀粉酶10份，果胶酶10份，酸性蛋白酶10份，木瓜蛋白酶5份，葡萄糖氧化酶5份，酸性磷酸酶5份；
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1。
（3）发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得β-葡聚糖酶。
经上述制备方法得到的β-葡聚糖酶液体酶活力为8000u/ml。
实施例3
一种β-葡聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：
（1）液体种子扩大培养
①一级种子培养：将活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度40℃，培养时间10h；
②二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度40℃，培养时间15h；
④一级种子罐培养：将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度41℃，搅拌速度300rpm，通风量（V/V）1:1.5,罐压0.05Mpa,培养时间15h；
所述种子培养基组成为：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl1％，pH7.0，121℃灭菌35min。
（2）发酵罐发酵
将一级种子罐发酵液以3%接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度45℃，搅拌速度300r/min，通风量（V/V）1:1-3,培养时间15h；然后将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至45℃时恒温培养20h；此时，将一级种子罐发酵液以2%接种量追加接入发酵罐，恒温培养15h；继续将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至45℃时恒温培养15h；
所述发酵培养基组成为：麦麸75g，玉米粉55g，米糠25g，豆饼粉20g，β-葡聚糖2g，中草药剂粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水l000mL，pH值7.0，121℃灭菌20min；
所述发酵培养基的调配方法为：按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值7，加入中温淀粉酶（3u/g玉米粉）与高温淀粉酶（30u/g玉米粉），同时边搅拌边升温至70℃保温30min，然后缓慢升温至90℃保温30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，pH7.0，121℃灭菌40min备用。
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪30份；党参18份；柴胡15份；麦冬15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3倍重量的水，控制温度90℃保持4h，然后降温至60℃，加入混合酶制剂进行酶解，用乳酸调节pH值为6.8，酶解4h，最后添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，110W功率下超声萃取1.5h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；
所述混合酶添加量为混合物料总重量的10%；
所述混合酶的重量份数组成为：β-葡萄糖苷酶15份，木聚糖酶20份，戊聚糖酶20份，普鲁兰酶30份，β-淀粉酶15份，果胶酶15份，酸性蛋白酶15份，木瓜蛋白酶10份，葡萄糖氧化酶10份，酸性磷酸酶10份；
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1.5。
（3）发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得β-葡聚糖酶。
经上述制备方法得到的β-葡聚糖酶液体酶活力为8500u/ml。

Claims (7)

1.一种热稳定性好的β-葡聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述热稳定性好的β-葡聚糖酶由地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)β-10-25通过发酵法制得，菌种保藏号为CCTCC NO:M2013538。
2.如权利要求1所述一种热稳定性好的β-葡聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：地衣芽孢杆菌CCTCC NO:M2013538的斜面菌种活化培养获得液体种子；将一级种子罐发酵液以3％接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度35-45℃，搅拌速度200-300r/min，通风量V/V 1:1-3,培养时间10-15h；然后将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35-45℃时恒温培养15-20h；此时，将一级种子罐发酵液以2％接种量追加接入发酵罐，恒温培养10-15h；继续将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35-45℃时恒温培养10-15h；
发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得β-葡聚糖酶。
3.如权利要求2所述的一种热稳定性好的β-葡聚糖酶的制备方法，其特征在于，种子培养基组成为：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl 1％，pH4.5-7.0。
4.如权利要求2所述的一种热稳定性好的β-葡聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包含：麦芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆饼粉15-25g，中草药粉剂30-50g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米浆1-5g，硫酸铵1-3g，磷酸氢二钾1-2g，磷酸二氢钾1-2g，柠檬酸钠1-5g，消泡剂0.1-1g,纯净水l000mL，pH值4.5-7；
所述发酵培养基的调配方法为：按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值4.5-7，加入3u中温淀粉酶/g玉米粉与30u高温淀粉酶/g玉米粉，同时边搅拌边升温至70℃保温15-30min，然后缓慢升温至90℃保温15-30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，pH4.5-7，备用。
5.如权利要求4所述的一种热稳定性好的β-葡聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪20-30份；党参10-18份；柴胡10-15份；麦冬10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70℃～90℃保持2～4h，然后降温至45-60℃，加入混合物料总重量5-10％的混合酶进行酶解，用乳酸调节pH值为5.5-6.8，酶解2-4h，最后添加混合物料0.5-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，混合物中乙醇和丙醇的质量比例为1：1-1.5，110W超声萃取0.5～1.5h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
6.如权利要求5所述的一种热稳定性好的β-葡聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述混合酶的重量份数组成为：β-葡萄糖苷酶10-15份，木聚糖酶15-20份，戊聚糖酶15-20份，普鲁兰酶20-30份，β-淀粉酶10-15份，果胶酶10-15份，酸性蛋白酶10-15份，木瓜蛋白酶5-10份，葡萄糖氧化酶5-10份，酸性磷酸酶5-10份。
7.如权利要求2所述的一种热稳定性好的β-葡聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)液体种子扩大培养
①一级种子培养：将活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度40℃，培养时间10h；
②二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子培养相同；
③三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度40℃，培养时间12h；
④一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度41℃，搅拌速度300rpm，通风量V/V 1:1.5,罐压0.05Mpa,培养时间15h；
种子培养基组成为：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl 1％，pH5.5，121℃灭菌35min；
(2)发酵罐发酵
将一级种子罐发酵液以3％接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度37℃，搅拌速度250r/min，通风量V/V 1:1-3,培养时间12h；然后将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至37℃时恒温培养18h；此时，将一级种子罐发酵液以2％接种量追加接入发酵罐，恒温培养12h；继续将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至37℃时恒温培养12h；
所述发酵培养基组成为：麦麸75g，玉米粉55g，米糠25g，豆饼粉20g，β-葡聚糖2g，中草药粉剂40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水l000mL，pH值5.5，121℃灭菌20min；
所述发酵培养基的调配方法为：按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值5.5，加入3u中温淀粉酶/g玉米粉与30u高温淀粉酶/g玉米粉，同时边搅拌边升温至70℃保温20min，然后缓慢升温至90℃保温20min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，pH5.5，121℃灭菌35min备用；
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪25份；党参15份；柴胡12份；麦冬12份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度80℃保持3h，然后降温至50℃，加入混合酶进行酶解，用乳酸调节pH值为6，酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，11W超声萃取1h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；所述混合酶添加量为混合物料总重量的8％；
所述混合酶的重量份数组成为：β-葡萄糖苷酶12份，木聚糖酶18份，戊聚糖酶18份，普鲁兰酶25份，β-淀粉酶18份，果胶酶12份，酸性蛋白酶12份，木瓜蛋白酶8份，葡萄糖氧化酶8份，酸性磷酸酶8份；乙醇和丙醇的质量比例为1：1.2；
(3)发酵液经过滤、浓缩、精滤、干燥得β-葡聚糖酶；
经上述制备方法得到的β-葡聚糖酶液体酶活力为10000u/ml。
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