CN108823191B - 一种提高芽孢杆菌产蛋白酶的发酵方法 - Google Patents

一种提高芽孢杆菌产蛋白酶的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种提高芽孢杆菌产蛋白酶的发酵方法。在10L‑30L发酵体系中，通过30‑40％(v/v)的大剂量接种，发酵控制及补料，芽孢杆菌产蛋白酶的酶活力提高了50‑60％，为一种具有良好应用前景的发酵方法。

Description

一种提高芽孢杆菌产蛋白酶的发酵方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种提高芽孢杆菌产蛋白酶的发酵方法。
背景技术
蛋白酶(Protease)是指能催化肽链中肽键水解的一类酶，广泛存在于动物内脏、植物茎叶果实和微生物中。根据不同分类依据，可以将蛋白酶分为不同的类群。蛋白酶是工业酶中用的最多的一种酶，约占酶总量60％，其中碱性蛋白酶就占25％。碱性蛋白酶(Alkaline Protease)属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，可以在碱性条件下水解蛋白质肽键，其最适作用pH一般为9～11，主要应用于加酶洗涤剂工业，在制革、丝绸、饲料、医药、食品、环保等工业也有广泛的应用，其在商业中的巨大应用前景吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究。
专利申请CN106676024A公开了一株地衣芽孢杆菌BLP-1及发酵生产的碱性蛋白酶。该菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BLP-1，能发酵生产碱性蛋白酶，发酵液中碱性蛋白酶的酶活力可达2200U/mL。
专利申请CN102382786A公开了一种碱性蛋白酶高产菌株及其所产的碱性蛋白酶及蛋白酶的发酵方法，该发明中诱变获得的产碱性蛋白酶菌株是由嗜碱芽孢杆菌经过低能N+离子注入诱变而得的碱性蛋白酶高产菌株，有效地提高了菌株的产酶能力，其碱性蛋白酶的摇瓶活力最大值到30700U/mL，较出发菌株提高了37.7％。
专利申请CN102517268A公开了一种碱性蛋白酶的生产方法，采用清液发酵与补料分批发酵相结合，将粗料棉籽饼粉制备为棉籽饼粉酶水解液，并采用流加碳氮源的发酵方式，有效的提高了发酵酶活，7L规模发酵罐酶活力达到41000U/mL，较原始7L规模发酵罐酶活力36000U/mL提高了13.9％。
我国人口众多，每年对碱性蛋白酶的需求量很大，如何在现有的基础上进一步提高碱性蛋白酶的产量，是众多研究者们需要迫切解决的问题。
发明内容
本发明目的是提供一种提高芽孢杆菌产蛋白酶的发酵方法，通过大剂量的接种，发酵控制及补料，极大提高了芽孢杆菌的蛋白酶胞外合成量。
本发明技术方案如下：
一种提高芽孢杆菌产蛋白酶的发酵方法，具体是向发酵培养基中以接种量30-40％v/v接种芽孢杆菌种子液，发酵条件为：温度33～35℃，转速150～650r/min，通风量1∶0.5～1∶2.5；发酵过程中溶氧维持在30％～70％，pH维持在7.3-7.5。
优选的发酵培养基组成为：玉米粉4-8g/100mL，豆粕粉3-6g/100mL，Na2HPO4 0.3-0.5g/100mL，KH2PO4 0.02-0.05g/100mL，高温淀粉酶0.05-0.1g/100mL，溶剂为水，pH 7.3-7.5。
优选的，发酵过程中，当发酵液中还原糖含量低于初始含量的一半时进行补料。
优选的补料培养基组成为：可溶性淀粉30-50g/100mL，棉籽饼粉30-50g/100mL，蛋白胨10-20g/100mL，Na2HPO4 0.2-0.5g/100mL，溶剂为水，pH自然。
优选的发酵体系为10-30L。
优选的接种芽孢杆菌种子液OD600值约为1.4–1.8。
优选的芽孢杆菌包括但不限于是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌中的一种。
有益效果：
本发明通过30-40％v/v的大剂量接种，发酵控制及补料，使芽孢杆菌发酵产蛋白酶活力达到50000-60000U/mL，相比常规接种量(5-10％v/v)条件下发酵蛋白酶活力显著提高了50-60％，而且本发明发酵方法简便易于控制，适合大规模工业应用。
附图说明
图1：克劳氏芽孢杆菌不同接种量发酵罐产酶曲线。
图2：克劳氏芽孢杆菌发酵过程还原糖含量图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1：克劳氏芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶
菌种：克劳氏芽孢杆菌CGMCC NO.12953。
培养基：
(1)菌种活化培养基：蛋白胨1g/100mL，酵母粉0.5g/100mL，氯化钠1g/100mL，琼脂1.8g/100mL，pH自然，溶剂为水。
(2)牛奶平板培养基：脱脂奶粉1.5g/100mL，蛋白胨1g/100mL，酵母粉0.5g/100mL，氯化钠1g/100mL，琼脂1.8g/100mL，pH自然，溶剂为水。
(3)一级种子培养基：蛋白胨1g/100mL，酵母粉0.5g/100mL，氯化钠1g/100mL，pH自然，溶剂为水。
(4)二级种子培养基：玉米粉5.4g/100mL，豆粕粉3.5g/100mL，Na2HPO4 0.4g/100mL，高温淀粉酶0.05g/100mL，pH7.3-7.5，溶剂为水。
(5)发酵培养基：玉米粉6.4g/100mL，豆粕粉4g/100mL，Na2HPO4 0.4g/100mL，KH2PO4 0.03g/100mL，高温淀粉酶0.07g/100mL，pH 7.3-7.5，溶剂为水。
(6)补料培养基：可溶性淀粉30g/100mL，棉籽饼粉30g/100mL，蛋白胨15g/100mL，Na2HPO4 0.3g/100mL，pH自然，溶剂为水。
种子液准备：
将克劳氏芽孢杆菌CGMCC NO.12953接种到活化培养基中，过夜活化12h，待菌长出后，三区划线于牛奶平板中，继续培养24-36h，挑取透明圈大的菌落接种到一级种子培养基中，37℃，220rpm，培养8-10h，再以2％接种量接种到二级种子培养基中，37℃，220rpm，培养10-12h，用于下一步发酵罐的接种。
发酵产酶：
30L发酵罐预装70％发酵培养基，接种前调节好罐压，pH及通风量，将二级种子液按30％的接种量接种到发酵罐里面，发酵条件为：温度：33-35℃；转速：150～650r/min；通风量：1∶0.5～1∶2.5；溶氧维持在30％～70％，发酵过程中自动流加氨水及0.5mol/L的磷酸，使发酵液pH值维持在7.3-7.5。每4h取样，镜检观察菌体形态，并且测定酶活力大小及还原糖含量，当还原糖含量低于初始含量的一半时，启动补料，保证菌体的正常生长及产酶。发酵72h酶活力最高达到56000U/mL，以5％(v/v)接种量为对比发酵酶活最高为35000U/mL，相比较酶活力提高了60％，酶活力变化曲线见图1。
实施例2：枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶
菌种：枯草芽孢杆菌CICC 23708。
培养基：
(1)种子培养基：蛋白胨1g/100mL，酵母粉0.5g/100mL，氯化钠1g/100mL，pH自然，溶剂为水。
(2)发酵培养基：玉米粉4g/100mL，豆粕粉6g/100mL，Na2HPO4 0.3g/100mL，KH2PO40.05g/100mL，高温淀粉酶0.08g/100mL，pH7.3-7.5，溶剂为水。
(3)补料培养基：可溶性淀粉30g/100mL，棉籽饼粉30g/100mL，蛋白胨15g/100mL，Na2HPO4 0.2g/100mL，pH自然，余量为水。
发酵产酶：
从平板上挑取单菌落枯草芽孢杆菌CICC 23708于种子培养基中，220r/min，37℃培养10-12h，30％(V/V)接种量接种至10L发酵罐中，温度：33-35℃；转速：150～650r/min；通风量：1∶0.5～1∶2.5；溶氧维持在30％～70％，发酵过程中自动流加氨水及0.5mol/L的磷酸，使发酵液pH值维持在7.3-7.5，每4h取样，镜检观察菌体形态，并且测定酶活力大小及还原糖含量，当还原糖含量低于初始含量的一半时，启动补料。发酵70h，将发酵液离心取上清测定酶活，以10％(v/v)接种量为对比，结果表明以30％的接种量不仅大大缩短了发酵产蛋白酶的时间，并且提高了菌株蛋白酶的胞外表达量，相比较10％接种量时酶活力提高了56％，从25000U/mL提高到了39000U/mL。
实施例3：地衣芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶
菌种：地衣芽孢杆菌2709。
培养基：
(1)种子培养基：牛肉膏0.5g/100mL，蛋白胨1g/100mL，氯化钠0.5g/100mL，pH自然，溶剂为水。
(2)发酵培养基：玉米粉5g/100mL，豆粕粉5g/100mL，Na2HPO4 0.5g/100mL，KH2PO40.02g/100mL，高温淀粉酶0.05g/100mL，pH 7.3-7.5，溶剂为水。
(3)补料培养基：可溶性淀粉30g/100mL，棉籽饼粉50g/100mL，蛋白胨10g/100mL，Na2HPO4 0.5g/100mL，pH自然，溶剂为水。
发酵产酶：
从平板上挑取单菌落地衣芽孢杆菌2709于种子培养基中，220r/min，37℃培养10-12h，40％(v/v)接种量接种至30L发酵罐(预装70％)中，温度：33-35℃；转速：150～650r/min；通风量：1∶0.5～1∶2.5；溶氧维持在30％～70％，发酵过程中自动流加氨水及0.5mol/L的磷酸，使发酵液pH值维持在7.3-7.5，每4h取样，镜检观察菌体形态，并且测定酶活力大小及还原糖含量，当还原糖含量低于初始含量的一半时，启动补料。发酵70h，将发酵液离心取上清测定酶活，以10％(v/v)接种量为对比，结果表明，40％的接种量发酵酶活力有了大大的提升，相比较10％接种量提高了60％，从28000U/mL提高到了45000U/mL。
实施例4：枯草芽孢杆菌发酵产中性蛋白酶
菌种：枯草芽孢杆菌1398。
培养基：
(1)种子培养基：牛肉膏0.5g/100mL，蛋白胨1g/100mL，氯化钠0.5g/100mL，pH自然，溶剂为水。
(2)发酵培养基：玉米粉8g/100mL，豆粕粉3g/100mL，Na2HPO4 0.4g/100mL，KH2PO40.04g/100mL，高温淀粉酶0.08g/100mL，pH 7.3-7.5，溶剂为水。
(3)补料培养基：可溶性淀粉35g/100mL，棉籽饼粉35g/100mL，蛋白胨20g/100mL，Na2HPO4 0.3g/100mL，pH自然，溶剂为水。
发酵产酶：
从平板上挑取单菌落枯草芽孢杆菌1398于种子培养基中，220r/min，37℃培养10-12h，40％(v/v)接种量接种至10L发酵罐(预装70％)中，温度：33-35℃；转速：150～650r/min；通风量：1∶0.5～1∶2.5；溶氧维持在30％～70％，发酵过程中自动流加氨水及0.5mol/L的磷酸，使发酵液pH值维持在7.3-7.5，每4h取样，镜检观察菌体形态，并且测定酶活力大小及还原糖含量，当还原糖含量低于初始含量的一半时，启动补料。发酵70h，将发酵液离心取上清测定酶活，以5％(v/v)接种量为对比，结果表明，40％的接种量菌株酶活力有了大大的提升，相比较5％接种量提高了59％，从22000U/mL提高到了35000U/mL。
实施例5：解淀粉芽孢杆菌发酵产角蛋白酶
菌种：解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.11218。
培养基：
(2)种子培养基：蛋白胨1g/100mL，酵母粉0.5g/100mL，氯化钠1g/100mL，pH自然，溶剂为水。
(3)发酵培养基：玉米粉7g/100mL，豆粕粉4g/100mL，Na2HPO4 0.4g/100mL，KH2PO40.03g/100mL，高温淀粉酶0.1g/100mL，pH 7.3-7.5，溶剂为水。
(4)补料培养基：可溶性淀粉40g/100mL，棉籽饼粉35g/100mL，蛋白胨15g/100mL，Na2HPO4 0.4g/100mL，pH自然，溶剂为水。
发酵控制：
从平板上挑取单菌落解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.11218于种子培养基中，220r/min，37℃培养10-12h，30％(v/v)接种量接种至30L发酵罐(预装70％)中，温度：33-35℃；转速：150～650r/min；通风量：1∶0.5～1∶2.5；溶氧维持在30％～70％，发酵过程中自动流加氨水及0.5mol/L的磷酸，使发酵液pH值维持在7.3-7.5。每4h取样，镜检观察菌体形态，并且测定酶活力大小及还原糖含量，当还原糖含量低于初始含量的一半时，启动补料。发酵72h，将发酵液离心取上清测定酶活，以5％(v/v)接种量为对比，结果表明，30％的接种量相比较5％的接种量其酶活力提高了52％，从2100U/mL提高到了3200U/mL。
实施例6：角蛋白酶活力测定方法
将发酵液离心10min(12000r/min，4℃)取发酵上清液，吸取250μL适当稀释的酶液，加入250μL 0.05mol/L Gly-NaOH缓冲液(pH 10.0)溶解1％的底物(角蛋白)，60℃反应10min，加入500μL 0.4mol/L三氯乙酸溶液终止反应。反应物12000r/min离心5min，吸取500μL上清液移入到新的试管中，后依此加入2.5mL 0.4mol/L Na2CO3溶液和500μL福林酚试剂，60℃显色20min。以零时间的反应液作为空白，在680nm处检测吸光值。
角蛋白酶活力定义：1g固体酶粉(或者1mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，每分钟水解角蛋白产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。
实施例7：蛋白酶活力测定
参照中华人民共和国国家标准GB/T 23527-2009(蛋白酶活力的测定)进行。
实施例8：还原糖含量的测定
(1)标准曲线的测定
取1.0mg/mL葡萄糖标准溶液，按表1加入试剂。沸水浴中加热5min，冷水冷却后定容至25mL摇匀，在520nm波长测吸光度。
表1葡萄糖标准溶液的配制
编号 葡萄糖标准溶液/mL 水/mL DNS试剂/mL
0 0 2 1.5
1 0.2 1.8 1.5
2 0.4 1.6 1.5
3 0.6 1.4 1.5
4 0.8 1.2 1.5
5 1.0 1.0 1.5
6 1.2 0.8 1.5
7 1.4 0.6 1.5
8 1.6 0.4 1.5
9 1.8 0.2 1.5
10 2.0 0 1.5
(2)还原糖的测定
取发酵液2ml(梯度稀释)，加入1.5ml DNS，沸水浴中加热5min，冷水冷却后定容至25mL摇匀，在520nm波长测吸光度，再根据标准曲线计算出发酵液中还原糖的含量。

Claims (6)

1.一种提高芽孢杆菌产蛋白酶的发酵方法，其特征在于，向发酵培养基中以接种量30-40％v/v接种芽孢杆菌种子液，发酵条件为：温度33～35℃，转速150～650r/min，通风量1∶0.5～1∶2.5；发酵过程中溶氧维持在30％～70％，pH维持在7.3-7.5；当发酵液中还原糖含量低于初始含量的一半时进行补料。
2.如权利要求1所述的一种提高芽孢杆菌产蛋白酶的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为：玉米粉4-8g/100mL，豆粕粉3-6g/100mL，Na2HPO4 0.3-0.5g/100mL，KH2PO40.02-0.05g/100mL，高温淀粉酶0.05-0.1g/100mL，溶剂为水，pH 7.3-7.5。
3.如权利要求1所述的一种提高芽孢杆菌产蛋白酶的发酵方法，其特征在于，所述补料培养基组成为：可溶性淀粉30-50g/100mL，棉籽饼粉30-50g/100mL，蛋白胨10-20g/100mL，Na2HPO4 0.2-0.5g/100mL，溶剂为水，pH自然。
4.如权利要求1或2所述的一种提高芽孢杆菌产蛋白酶的发酵方法，其特征在于，发酵体系为10-30L。
5.如权利要求1或2所述的一种提高芽孢杆菌产蛋白酶的发酵方法，其特征在于，接种的芽孢杆菌种子液OD600值约为1.4–1.8。
6.如权利要求1或2所述的一种提高芽孢杆菌产蛋白酶的发酵方法，其特征在于，所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌中的一种。
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