CN103509720B - 一种制备α-淀粉酶的方法及其专用菌株与相关蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备α-淀粉酶的方法及其专用菌株与相关蛋白。本发明提供的菌株樟绒枝霉（Malbranchea cinnamomea）S168，其保藏号为CGMCC NO.6022。本发明还提供了樟绒枝霉（Malbranchea cinnamomea）S168CGMCC NO.6022在制备α-淀粉酶中的应用。本发明的实验证明，本发明提供的菌株具有高产α-淀粉酶的能力，具有很好的工业化应用前景。

Description

一种制备α-淀粉酶的方法及其专用菌株与相关蛋白

技术领域

本发明涉及食品生物技术领域，尤其涉及一种制备α-淀粉酶的方法及其专用菌株与相关蛋白。

背景技术

α-淀粉酶[EC.3.2.1.1]属于糖苷水解酶类第13家族，作用于淀粉分子内部切开ɑ-1,4-糖苷键,生成糊精和还原糖,产物的末端残基碳原子为α构型，故称为α-淀粉酶。α-淀粉酶是一种重要的工业用酶制剂，也是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种，已广泛应用食品、饲料、发酵以及纺织等工业中（张志国等,2005）。α-淀粉酶广泛存在于细菌、真菌、植物以及动物等各种生物体中，自1956年首次分离α-淀粉酶的报道以来，目前已经有120多种α-淀粉酶得到了分离和鉴定。α-淀粉酶的生产主要以微生物发酵为主，生产菌株主要有不同种属的细菌如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌等，以及真菌如黑曲霉、米曲霉和根霉等。迄今，已有大量的细菌发酵生产α-淀粉酶的研究报道，然而，真菌发酵产α-淀粉酶的研究较少（Ashok et al，2000）。

随着α-淀粉酶研究的不断深入，已发现部分α-淀粉酶能同时水解多种葡聚糖及葡寡糖当中的α-1,4和α-1,6糖苷键，即同时具有麦芽糖淀粉酶、普鲁兰酶以及环糊精酶等多功能淀粉酶活性（Shimura et al,2001;Yang et al,2004;Yun et al,2004;Takeuchi et al，2006;Champreda et al,2007;Kato et al，2007;Hostinova et al,2010），其中有少数α-淀粉酶还具有葡萄糖基转移酶功能（Kim et al，1992;Shimura et al,2001;Yun et al,2004）。目前已发现和报道的多功能α-淀粉酶多数属于耐热酶，因此应用于淀粉加工时也较传统淀粉酶稳定，它们可以水解淀粉生成异麦芽低聚糖、麦芽低聚糖以及少量的葡萄糖。近来，多功能α-淀粉酶以其独特的催化功能多样性引起了人们的很大关注。应用多功能α-淀粉酶可以实现单酶生产，即以简单的一步催化水解淀粉生成异麦芽低聚糖和麦芽低聚糖，而且产品中副产物较少，产品质量较高，有些产品甚至不需要纯化而直接应用。因此，多功能α-淀粉酶在现代食品工业以及医药工业等领域中占有重要的地位，具有广阔的应用前景。

目前，世界各国都在致力于开发多功能淀粉酶，以期待降低生产麦芽低聚糖的成本。我国淀粉资源非常丰富，而且具有分布广、产量大、价格低等特点。以淀粉为原料生产高质量的麦芽低聚糖有望成为我国主要的功能性、健康性糖原，但是其生产的前提是要开发出理想的多功能淀粉酶。

发明内容

本发明的一个目的是提供樟绒枝霉（Malbranchea cinnamomea）S168。

本发明提供的樟绒枝霉（Malbranchea cinnamomea）S168，其保藏号为CGMCCNO.6022。

上述的樟绒枝霉（Malbranchea cinnamomea）S168 CGMCC NO.6022在制备α-淀粉酶中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种制备α-淀粉酶的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的樟绒枝霉（Malbrancheacinnamomea）S168 CGMCC NO.6022，收集发酵产物，即得到α-淀粉酶。

上述方法中，所述发酵温度为30-45°C，所述发酵时间为3-5天，所述发酵为180-220rpm震荡培养。

上述发酵培养基的配方如下：糯米粉35.0g，蛋白胨12.0g，酵母提取物24.0g,KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，NaCl 0.5g，CaCl₂ 0.2g，MnSO₄·7H₂O 0.05g，用水定容至1L。

本发明的第三个目的是提供一种蛋白。

本发明提供的蛋白，来源于樟绒枝霉（Malbranchea cinnamomea）S168，是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。

上述蛋白中，一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

编码上述蛋白的基因也是本发明保护的范围。

上述基因是如下（1）-（4）中任一所示的DNA分子：

（1）序列表中序列3所示的DNA分子；

（2）序列表中序列4所示的DNA分子；

（3）在严格条件下与（1）或（2）限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白的DNA分子；

（4）与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白的DNA分子。

上述严格条件为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1% SDS和1×SSC,0.1% SDS各洗膜一次。

含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

上述蛋白在作为α-淀粉酶中的应用也是本发明保护的范围。

菌株樟绒枝霉S168已于2012年4月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为NO.6022，分类命名为樟绒枝霉（Malbrancheacinnamomea）。

本发明的实验证明，本发明提供的菌株具有高产α-淀粉酶的能力，通过硫酸铵沉淀及弱阴离子层析得到55.4%回收率的高纯度α-淀粉酶，水解特性分析表明此α-淀粉酶具有广泛的底物特异性，可以用于水解淀粉高效生产低聚麦芽糖，具有较好的工业应用前景，本发明还提供了该α-淀粉酶的编码基因及其对应的氨基酸序列，为基因重组表达α-淀粉酶奠定了基础。

附图说明

图1为菌株菌落形态（A）及显微镜下产孢形态（B）

图2为樟绒枝霉液体发酵产α-淀粉酶的产酶历程图

图3为樟绒枝霉产α-淀粉酶的纯化过程电泳图

图4为所纯化α-淀粉酶的最适pH

图5为所纯化α-淀粉酶的pH稳定性

图6为所纯化α-淀粉酶的最适温度

图7为所纯化α-淀粉酶的温度稳定性

图8为所纯化α-淀粉酶水解直链淀粉、可溶性淀粉、支链淀粉、普鲁兰糖和γ-环糊精及麦芽寡糖的水解进程图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例所述引物的合成及测序工作均由上海生工生物工程有限公司（北京公司）完成。

下述实施例的主要原料及试剂：葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、潘糖、普鲁兰糖、环糊精、直链淀粉和可溶性淀粉（底物）均购自Sigma公司；酵母提取物和胰蛋白胨购自英国Oxoid公司；琼脂和可溶性淀粉（培养基）购自北京康明威培养基技术有限责任公司；KH₂PO₄、MgSO₄.7H₂O、CaCl₂、NaOH、苯酚、MnSO₄、CuSO₄.5H₂O以及酒石酸钾钠等购自北京化工厂；3,5-二硝基水杨酸购自上海远帆制剂厂。

实施例1、菌株的分离和鉴定

一、菌株的分离

本发明提供的樟绒枝霉S168是从陕西西安树林土壤中筛选得到的。

初筛培养基：淀粉高渗培养基（YpSs）：可溶性淀粉15g，酵母提取物4g，K₂HPO₄1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，琼脂20g，定容至1L，调节pH至7.0。1×10⁵Pa下湿热灭菌20min。

发酵培养基：糯米粉（中山市小榄永宁粮油综合加工厂,Q/WG 0002 S-2010）15.0g，蛋白胨8.0g，酵母提取物8.0g,KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，NaCl 0.5g，CaCl₂ 0.2g，MnSO₄·7H₂O 0.05g，用水定容至1L。1×10⁵Pa下湿热灭菌20min。

取新鲜土样稀释后涂布于分离培养基平板上，在50°C恒温培养箱中培养。待分离培养基中有菌落长出，将菌株接种到初筛培养基中，凡在菌落周围能使培养基形成透明圈的菌株，接种到发酵培养基中培养。培养条件为：50°C，200rpm，培养36h。发酵结束后取1mL发酵液于1.5mL离心管中，离心（10000×g，10min），取上清测定ɑ-淀粉酶酶活力。选取酶活力较高的菌株S168作为出发菌株进行后续研究。

酶活力测定方法：α-淀粉酶酶活力测定为100μL适当稀释的酶液（上清）加入到100μL浓度为10gL^-1的可溶性淀粉溶液（用50mM pH 6.5MES缓冲液配置）中，65°C水浴反应10min后采用DNS法（Miller GL(1959)Use of dinitrosalicylic acid reagent fordetermination of reducing sugars.Anal Chem 31:426-428）测定产生的还原糖量，以葡萄糖为标准。酶活力单位(U)定义为在以上条件下,每分钟反应生成1μmol葡萄糖所需要的酶量。

二、菌株的鉴定

1、形态学观察

将上述菌株S168在淀粉高渗平板培养基上培育，观察菌株生长情况如下：生长良好，最适生长温度为45°C。菌落铺展生长,初黄色，渐变粉红色与桔黄色交替环生,后中央深赭棕色，边缘亮硫磺色，粉状（图1A）。采用显微镜观察，发现菌丝初无色后变黄，粗壮菌丝近隔膜基部有明显隆起，从顶端到基部依次形成紧密、规则的隔膜，无分化的分生孢子梗；产孢菌丝体生式产孢，厚壁分生（节）孢子和薄壁细胞（腰）相互间插链生；薄壁细胞易萎焉、衰退，分生孢子链断裂，形成黄色粉状孢子堆，分生孢子淡黄至黄色，脱落后两端有明显的菌丝外壁残留物，短圆柱状，常轻微弯曲（图1B）。

2、18S rDNA的鉴定

使用18S rDNA通用引物NS1：GTAGTCATATGCTTGTCTC，NS8：TCCGCAGGTTCACCTACGGA，以樟绒枝霉S168的总DNA为模板，PCR扩增18SrDNA序列。目标片段经凝胶回收后测序。测序获得可靠序列1745bp（序列1）。将测序获得的基因序列再NCBI数据库中进行比对,依据相似度高低并结合菌株形态对其进行初步鉴定综合以上特征，结合该真菌18S rDNA测序结果，证实本发明得到的菌株S168为樟绒枝霉。

菌株樟绒枝霉S168已于2012年4月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为NO.6022，分类命名为樟绒枝霉（Malbrancheacinnamomea）。

实施例2、樟绒枝霉（Malbranchea cinnamomea）S168 CGMCC NO.6022在制备α-淀粉酶中的应用

一、α-淀粉酶的获得

1、发酵

将由实施例1得到的樟绒枝霉（Malbranchea cinnamomea）S168 CGMCC NO.6022进行液体发酵培养，并对发酵培养基做了单因素优化，具体如下：

最优的发酵培养基：糯米粉35.0g，蛋白胨12.0g，酵母提取物24.0g,KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，NaCl 0.5g，CaCl₂ 0.2g，MnSO₄·7H₂O 0.05g，用水定容至1L。1×10⁵Pa下湿热灭菌20min，pH 6.5。

在上述最优的发酵培养基中在35°C、200rpm震荡培养5d，收集发酵产物，将发酵产物10000×g冷冻离心10min，收集上清液进行α-淀粉酶的酶活力检测（检测方法同实施例1的一中的酶活力测定方法），结果为上清液的α-淀粉酶的酶活力最高达到308.3U mL^-1(DNS法)(图2)。

将发酵3d的发酵产物10000×g冷冻离心10min，收集上清液做进一步纯化用。

2、α-淀粉酶的纯化与鉴定

1）α-淀粉酶的纯化

（1）硫酸铵沉淀

向上述1得到的上清液中缓慢加入60%饱和度的硫酸粉末，冰水浴中搅拌1h，然后10000×g冷冻离心10min，取上清液继续添加硫酸铵粉末至酶液达到80%硫酸铵饱和度，冰水浴中搅拌1h，10000×g冷冻离心10min，收集沉淀，将沉淀用少量20mMpH 8.0 Tris-HCl缓冲液溶解，得到硫酸铵沉淀产物。

（2）DEAE52柱纯化

将上述得到的硫酸铵沉淀产物用20mM pH 8.0Tris-HCl缓冲液透析，过DEAE52弱阴离子交换柱（Whatman），流速为1.0mL min^-1（前后均一致），用200mM NaCl溶液梯度洗脱杂蛋白，用300mM NaCl溶液梯度洗脱，收集5个柱体积的洗脱液为α-淀粉酶组分，得到纯化产物。检测纯化产物的酶活，酶活力测定方法同实施例1，采用Lowry法（Lowery OH,Rosebrough NJ,Farr AL,Randall RJ(1951)Proteinmeasurement with the folin phenol reagent.J Biol Chem 193:265-275）测定蛋白质含量。

结果如表1所示：（表中的比酶活=总酶活/总蛋白）

表1α-淀粉酶的纯化过程

从上述可以看出，纯化产物为α-淀粉酶，该菌株发酵产物及其纯化后的产物均为α-淀粉酶。

2）SDS-PAGE法检测蛋白大小

将上述1）得到的纯化产物α-淀粉酶用SDS-PAGE法检测蛋白纯度，结果如图3所示，其中泳道标记M为标准品，1为发酵产物，2为60-80%饱和度的硫酸铵沉淀纯化产物，3为经过DEAE52纯化后收集的纯化产物，可以看到，得到明显的单一条带，大小为60.3kDa，与已知的α-淀粉酶的大小一致，进一步说明，得到的是α-淀粉酶。

二、α-淀粉酶的酶学性质

1、α-淀粉酶最适pH和pH稳定性检测

α-淀粉酶最适pH的测定：将上述一得到的α-淀粉酶（纯化产物）溶于不同pH值的6种不同缓冲液体系中（磷酸/柠檬酸（pH 3.0-6.0）、醋酸（pH 4.0-5.5）、MES（2-（N-吗啉代）乙磺酸）（pH 5.0-7.0）、MOPS（3-（N-吗啉基）丙磺酸）（pH 6.5-8.0）、CHES（N-2-环已胺基乙磺酸）（pH 8.0-10.0），CAPS（3-(环已胺基)丙磺酸）（pH10.0-11.0）然后在40°C条件下测定α-淀粉酶的酶活力，酶活力测定方法同上。

pH稳定性的测定：用上述不同的pH值缓冲液（除乙酸和MES缓冲液）分别稀释纯酶液，将稀释好的酶液置于40°C水浴中分别处理30min，迅速将样品置于冰水中冷却30min，然后测定残余酶活力，酶活力测定方法同上。以未经处理的酶液作为对照，最后计算残余酶活力占未处理对照酶活力的百分比。

α-淀粉酶的最适pH及pH稳定性的结果如图4和5所示，其中（□）磷酸/柠檬酸缓冲液（pH 3.0-6.0），（◆）醋酸缓冲液（pH 4.0-5.5），（▲）MES缓冲液（pH5.0-7.0），（■）MOPS冲液（pH 6.5-8），（●）CHES缓冲液（pH 8.0-10.0），（△）CAPS（3-(环已胺基)丙磺酸）（pH 10.0-11.0）可以看出，实验测得该酶的最适pH为6.5，该酶在pH 5.0-10.0的范围内稳定。说明该酶能够在很宽的pH范围下具有较高的催化能力。

2、α-淀粉酶最适反应温度和温度稳定性检测

α-淀粉酶最适反应温度的测定：将上述一得到的α-淀粉酶（纯化产物）适当稀释于50mM pH 6.5的MES缓冲液中，然后分别在40-90°C下按照上述方法测定α-淀粉酶的酶活力，酶活力测定方法同上。

α-淀粉酶的温度稳定性测定：将α-淀粉酶酶液分别在不同的温度下处理30min，缓冲液为50mM pH 6.5的MES缓冲液，然后置于冰水浴中冷却30min，最后按标准的方法测定残余酶活力，酶活力测定方法同上。以未经处理的酶液作为对照。

α-淀粉酶的最适温度及温度稳定性的结果如图6和7所示，该酶的最适温度为65°C，在≤50℃时保持稳定。

三、α-淀粉酶的水解特性

用50mM，pH 6.5MES缓冲液配置1%（w/v）的各种相关底物，在底物中按照2.0U mL^-1的量加入由一得到的α-淀粉酶（纯化产物），50°C水解12h，每隔一定时间（h）取样，样品煮沸5min终止水解反应，水解生成的产物通过Kieselgel 60（Merck）薄层层析（TLC）法进行定性分析（图8，A为直链淀粉、可溶性淀粉和支链淀粉水解进程TLC图，B为普鲁兰糖和γ-环糊精水解进程TLC图，C为麦芽寡糖水解进程TLC图，其中Std为标准品：G1为葡萄糖；G2为麦芽糖；G3为麦芽三糖；G4为麦芽四糖；G5为麦芽五糖；G6为麦芽六糖）。薄层层析的展层系统为正丁醇：乙醇：水=5:3:2（v/v/v），样品点完后将硅胶板用展层剂展开两次，吹干后用甲醇：硫酸（95:5v/v）溶液浸湿，最后在100°C烘箱中烘烤显色。水解直链淀粉，支链淀粉及可溶性淀粉时主要产生麦芽糖及麦芽三糖等低聚麦芽寡糖，并有葡萄糖生成。此特性有助于提高焙烤食品的质量，水解普鲁兰糖主要生成潘糖（经¹H NMR证实），水解γ-环糊精主要生成麦芽糖及麦芽三糖，说明此酶拥有类似于麦芽糖淀粉酶的水解特性。此淀粉酶水解麦芽寡糖的同时有高聚合度的麦芽寡糖生成说明有一定的转糖苷能力。四、α-淀粉酶的测序

质谱条件及测定方法：采用ESI-MS/MS法进行α-淀粉酶（纯化产物）的肽段序列分析，对纯酶进行SDS-PAGE电泳，上样量为10μg，将纯酶条带切下放入试样管中，送往国家生物医学分析中心进行质谱测定。获得的四个肽段的序列分别为，肽段1：SHAVSNDDAYLTTPTDLK，肽段2：ALADELHAR，肽段3：LSVTLNQGLPR，肽段4：EALWLSGFNTDAPLYK。经NCBI数据库比对，肽段3、肽段4与Oreochromisniloticus、Aspergillus fumigatus、Penicillium chrysogenum、Neosartorya ficheri等真菌的α-淀粉酶内部肽段具有较高的同源性。

实施例3、樟绒枝霉S168的α-淀粉酶基因的获得

1、α-淀粉酶基因片段的克隆

根据GenBank中公布的真菌α-淀粉酶的氨基酸序列，通过比对挑取一段保守序列（GEAYHGYW），以及一段通过HPLC-ESI-MS/MS质谱测定的肽段序列（GFNTDAPLY），使用Codehop软件（http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html）在线设计简并引物，简并引物和对应保守氨基酸的序列如下：

McAmyACP1（上游引物）:CGGCGAGGCCTACCAYGGNTAYTGG（GEAYHGYW），

McAmyACP2（下游引物）:ACAGAGGGGCGTCGGTRTTRAANCC（GFNTDAPLY），

其中Y：A/G，N：A/T/G/C，R：C/T。

PCR反应以樟绒枝霉S168的总DNA为模板，McAmyACP1、McAmyACP2为引物，使用Ex taq DNA聚合酶（Takara公司）扩增。程序为：94°C预变性5min；94°C30s，50°C 30s，72°C 1min，30个循环扩增；延伸10min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶回收后连接到pMD-18T载体（Takara公司），热激法转化大肠杆菌，挑选单菌落测序。扩增片段长度为848bp。

2、RACE反应以及α-淀粉酶基因全长cDNA序列的获得

将樟绒枝霉S168接种到发酵培养基中（单位gL^-1）：糯米粉15，蛋白胨8，酵母提取物8，KH₂PO₄ 1.0，MgSO₄·7H₂O 0.5，FeSO₄·7H₂O 0.01，NaCl 0.5，CaCl₂ 0.2，MnSO₄·7H₂O 0.05，37℃摇床培养3d。冷冻离心收集菌丝，并置于液氮中研磨。取大约100mg研磨后菌体，置于1.5mL离心管中，加入1mL Trizol试剂（Invitrogen公司），提取总RNA。使用磁珠法（Omega公司）纯化mRNA，作为反转录的模板。

根据扩增出来的序列片段，设计5′、3′RACE引物。引物序列如下：

McAmyAGSP1:TACTGTTGCTCCTGGCCCGCGTAG

McAmyANGSP1:GTCTTGCGTGTACGAGGCGAAGC

McAmyAGSP2:CCGTGGCATGTTCCTCATGGTCG

McAmyANGSP2:ACAGCTCCGACTATTACCATCCACC

用纯化的mRNA作为模板，按照SMART RACE cDNA Amplification Kit（Takara公司）试剂盒方法反转录合成5′、3′RACE-Ready cDNA。以上述5′RACE-Ready cDNA为模板，McAmyAGSP1与Universal Primer A mix（试剂盒中提供）为第一轮PCR引物，以McAmyANGSP1与Nest Universal Primer（试剂盒中提供）为嵌套PCR引物，分别进行2轮PCR反应，扩增5′端cDNA全长。以3′为模板，McAmyAGSP2与UniversalPrimer A mix为第一轮PCR引物，以McAmyANGSP2与Nest Universal Primer为嵌套PCR引物，扩增3′端全长。扩增片段连接到pMD-18T载体上测序。通过5′RACE获得1150bp的产物，3′RACE获得1101 bp产物。

经序列拼接后，获得α-淀粉酶基因全长的cDNA序列，长1754bp，其核苷酸序列为序列表中的序列3，其中含有1476bp的α-淀粉酶基因的开放阅读框（序列4）。该基因翻译得到由492个氨基酸残基组成的肽段序列2，经SignalP 3.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测自氨基端（N端）第1-21位氨基酸残基为信号肽，自氨基端第22-492位氨基酸残基为成熟蛋白。经比较，氨基酸序列包含有经肽段测序的四个片段，并且氨基酸序列完全一致，说明克隆的基因正是该α-淀粉酶的基因。使用BlastP（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）与NCBI上的蛋白序列比较，该蛋白与Aspergillus nidulans（EAA64850）、Aspergillus niger（2GUY）、Fusicoccum sp.（ABG48762）和Ajellomyces capsulatus（EGC43184）的淀粉酶序列的相似性仅为57%、56%、56%和55%，具有很好的新颖性。

将此蛋白经大肠杆菌体外表达和纯化，得到的纯化产物进行α-淀粉酶活性检测，检测方法同前，检测结果为纯化产物的比酶活为500U/ml，证明其为α-淀粉酶。

Claims (9)

1.樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea)S168，其保藏号为CGMCC NO.6022。

2.权利要求1所述的樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea)S168在制备α-淀粉酶中的应用。

3.一种制备α-淀粉酶的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1所述的樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea)S168，收集发酵产物，即得到α-淀粉酶。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵温度为30-45℃，所述发酵时间为3-5天，所述发酵为180-220rpm震荡培养。

5.一种蛋白，是如序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

6.编码权利要求5所述蛋白的基因。

7.根据权利要求6所述的基因，其特征在于：所述基因是如下(1)或(2)所示的DNA分子：

(1)序列表中序列3所示的DNA分子；

(2)序列表中序列4所示的DNA分子。

8.含有权利要求6或7所述基因的重组载体、表达盒。

9.权利要求5所述蛋白在作为α-淀粉酶中的应用。