CN111269904B - 一种糖化酶突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种糖化酶突变体及其应用。目前工业上采用丝状真菌微生物生产的糖化酶具有生产效率高、热稳定性好的优点。但微生物发酵的糖化酶在高浓度葡萄糖存在的时具有较高的转苷活性，影响糖化效率。本发明通过定点突变，降低了其转苷活力，提高了其比活力。其中转苷活力降低了16.6％‑100％不等，酶比活力最高提高了约40.4％。该发明为淀粉质原料的高效糖化及其在发酵工业中的应用奠定了基础。

Description

一种糖化酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体地说涉及糖化酶突变体及其应用。
背景技术
糖化酶，又名葡萄糖淀粉酶(glucoamylase，GA，EC 3.2.1.3)，全称为α-1，4-葡萄糖苷水解酶(α-1，4-D-glucan glucohydrolase)。它可以从可溶性淀粉、支链淀粉、麦芽糖、糖原等多聚糖和寡糖的非还原性末端水解α-1，4糖苷键，也可以缓慢水解α-1，6糖苷键和α-1，3糖苷键，依次释放β-D-葡萄糖。
糖化酶是我国产量最大、应用范围最广的酶制剂之一，主要应用于淀粉加工、酿造发酵业、纺织品工业、面包工业、医药工业、饲料工业等行业。目前工业生产上生产糖化酶的主要生产菌种是丝状真菌，其糖化酶在糖浓度较高时，具有一定的转苷活性，在糖化过程中会将水解的葡萄糖转化成非发酵性的低聚糖如异麦芽糖、潘糖等，不仅影响发酵时糖类的高效利用，也影响葡萄糖生产中最终产品的纯度和产率以及葡萄糖的结晶。因此需要对糖化酶基因进行改造，降低其转苷活性。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种丝状真菌来源的糖化酶突变体及其应用。
本发明中采用如下定义：
1、氨基酸残基使用公认IUPAC命名法，用三字母缩写或单字母符号形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
2、突变体的标识：采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示糖化酶突变体中突变的氨基酸。如D259E，表示第259位的氨基酸由亲本糖化酶的天冬氨酸Asp替换成谷氨酸Glu，位置的编号对应于SEQ ID NO：1中糖化酶的氨基酸序列编号。如D259E/S413A，表示第259位和第413位的氨基酸都发生了突变。
本发明的技术方案概述如下：
本发明通过定向改造构建的糖化酶突变体，以亲本野生型糖化酶(GenBank ID:CAC28076.1)出发，利用定点突变技术，野生型糖化酶氨基酸序列SEQ ID NO:1中在氨基酸取代位置突变，得到所述糖化酶突变体如下：
第22位、第29位、第32位、第259位、第413位中至少一个氨基酸替换为二十种常见氨基酸中的一种；
优选地，所述糖化酶突变体是氨基酸序列SEQ ID NO:1中在氨基酸取代位置突变，得到突变体如下：
第259位的天冬氨酸替换为二十种常见氨基酸中的一种，和/或第22位、第29位、第32位、第413位中至少一个氨基酸替换为二十种常见氨基酸中的一种；
更优选地，所述糖化酶突变体书氨基酸序列SEQ ID NO:1中在氨基酸取代位置突变，得到突变体如下：
(1)第22位氨基酸天冬酰胺(N)替换为半胱氨酸(C)、第29位丙氨酸(A)替换为半胱氨酸(C)以及第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为谷氨酸(E)；或，
(2)第22位氨基酸天冬酰胺(N)替换为半胱氨酸(C)、第29位丙氨酸(A)替换为半胱氨酸(C)以及第32位氨基酸丙氨酸(A)替换为脯氨酸(P)；或，
(3)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为谷氨酸(E)以及第413位丝氨酸(S)替换为丙氨酸(A)；或，
(4)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为谷氨酸(E)；或，
(5)第22位氨基酸天冬酰胺(N)替换为半胱氨酸(C)、第29位丙氨酸(A)替换为半胱氨酸(C)、第32位氨基酸丙氨酸(A)替换为脯氨酸(P)以及第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为谷氨酸(E)；或，
(6)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为苯丙氨酸(F)；或，
(7)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为丙氨酸(A)；或，
(8)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为精氨酸(R)；或，
(9)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为半胱氨酸(C)；或，
(10)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为谷氨酰胺(Q)；或，
(11)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为组氨酸(H)；或，
(12)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为色氨酸(W)；或，
(13)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为缬氨酸(V)；或，
(14)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为苏氨酸(T)；或，
(15)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为酪氨酸(Y)；或，
(16)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为异亮氨酸(I)；或，
(17)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为甘氨酸(G)；或，
(18)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为天冬酰胺(N)；或，
(19)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为亮氨酸(L)；或，
(20)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为赖氨酸(K)；或，
(21)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为脯氨酸(P)；或，
(22)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为丝氨酸(S)；或，
(23)第259位氨基酸天冬氨酸(D)替换为甲硫氨酸(M)。
编码所述糖化酶突变体的基因也属于本发明的范围。
包含所述糖化酶突变体的重组载体或宿主细胞也属于本发明的范围。
优选地，所述重组载体所采用的质粒可以是真菌表达系统的质粒包括但不限于pJ912、pPIC9、pPIC9K、pPIC3.5K、pPICZalphaA,B,C、pYES2、pAUR123、pRS303TEF、pRS304、pRS305、pUG6,pSH47、pUC110、pPZP-HYG2、pPZP201、pFW22.1、pFC330等；也可以是原核表达系统的质粒包括但不限于pET系列质粒、pTRC99A、pWB600、pXMJ19、pHT1等。
更优选地，所述重组载体所采用的质粒为pJ912、pPIC3.5K或pPIC9K。
优选地，所述宿主细胞为酿酒酵母、毕赤酵母、埃默森篮状菌(Talaromycesemersonii)、黑曲霉、米曲霉、黑根酶、泡盛曲霉、里氏木霉、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌其中一种。
更优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母、埃默森篮状菌或黑曲霉。
本发明获得所述糖化酶突变体的实验步骤概述如下：
根据糖化酶的基因序列，设计定点突变的突变引物，以携带GA的克隆载体为模板进行定点突变构建突变体，以质粒pJ912为表达载体，将重组质粒化转到E.coli JM109细胞或能表达该酶的宿主细胞，挑选验证后的阳性单克隆；
进一步将正确的阳性单克隆用限制性内切酶线性化后，电转到毕赤酵母感受态细胞中，涂布于含抗性的YPD平板上，挑选验证后的阳性单克隆并进行发酵培养，并从培养物中收集糖化酶突变体。
本发明还提供所述糖化酶突变体的用途，包括在埃默森篮状菌、黑曲霉、米曲霉、黑根酶、泡盛曲霉、里氏木霉等真菌和肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌等原核细胞表达中的应用及其淀粉质原料水解加工、酿造发酵、纺织品工业、面包工业、医药工业、饲料工业等行业中的应用。
本发明所述糖化酶突变体可用于水解淀粉质原料多糖或寡糖原料的α-1,4糖苷键或α-1,6糖苷键，如可溶性淀粉、液化淀粉、麦芽糊精、二糖、三糖和多糖等，制备葡萄糖或糖浆，用于发酵和食品工业。还可以在发酵生产工业乙醇和生产柠檬酸等生产菌株中表达糖化酶突变体，由于它们一般采用同时发酵糖化的生产过程，在这些生产菌株中表达糖化酶突变体，因为糖化酶突变体缺乏转苷活性，可以在发酵过程中可以防止高浓度葡萄糖转变成异麦芽糖、潘糖等不可发酵的糖类，减少发酵过程中残糖的形成，提高糖类的利用率和产品的产率，降低生产成本。
有益效果：
糖化酶是我国产量最大、应用范围最广的酶制剂之一，主要应用于淀粉加工、酿造发酵业、纺织品工业、面包工业、医药工业、饲料工业等行业。目前工业用糖化酶在糖化过程中由于其转苷酶活性的存在，会将水解葡萄糖转化成非发酵性的低聚糖如异麦芽糖、潘糖等，不仅影响发酵时糖类的高效利用，也影响葡萄糖生产中最终产品的纯度和产率以及葡萄糖的结晶。本发明提供的糖化酶突变体，不仅其转苷酶活性显著下降甚至没有转苷酶活性，也提高了其比活力和催化活性，与其野生型糖化酶相比，转苷活力降低了16.6％-100％，这样不仅在制备葡萄糖或糖浆时可以提高产品纯度和产率，而且，在同时糖化发酵过程中可以防止异麦芽糖和潘糖等非发酵性糖类的形成、降低残糖含量、提高糖类的利用率和产品产量；同时一些糖化酶突变体的最适反应温度提高了5-10℃，比活力最高提高约40.4％，水解麦芽糖的催化效率最高可达到野生型糖化酶的2倍，水解可溶性淀粉的催化效率最高提高了约72％具有显著的技术进步。本发明为淀粉质原料多糖及寡糖的高效糖化奠定了基础。
附图说明
图1：野生型糖化酶的氨基酸序列(仅成熟肽)。
图2：实施例中糖化酶中转苷活性检测HPLC谱图；其中，A：标准品葡萄糖、麦芽糖、异麦芽糖；B：20％麦芽糖作对照；C：野生型糖化酶WT水解20％麦芽糖HPLC图；D-F：突变体糖化酶M2、M4、M5水解20％麦芽糖HPLC图；1：葡萄糖；2：麦芽糖；3：异麦芽糖；4：麦芽糖中杂质。
图3：实施例中不同表达宿主表达的重组糖化酶突变体的转苷酶活力下降(％)示意图。
图4：实施例中野生型糖化酶及其突变体的最适温度。
图5：实施例中野生型糖化酶及其突变体温度稳定性。
图6：实施例中野生型糖化酶及其突变体的最适pH值。
图7：实施例中野生型糖化酶及其突变体的pH稳定性。
图8：实施例中野生型糖化酶及其突变体水解淀粉时的催化效率。
图9：实施例中野生型糖化酶及其突变体水解麦芽糖时的催化效率。
图10：实施例中几个纯化突变体的SDS-PAGE电泳图。其中，M：蛋白Marker；1：M2；2：M4；3：M5；4：WT。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非本文另外定义，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属的技术领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
数字范围包括限定该范围内的数在内。除非另外指出，核酸从5’至3’方向书写，氨基酸序列从氨基端至羧基端书写。
术语“突变体”在本发明中被定义为糖化酶基因序列或氨基酸序列中任何不同于野生型糖化酶基因序列或氨基酸序列的变化，包括一个或几个核苷酸和/或氨基酸残基的替换(转换和颠换)、缺失或插入以及一段或几段核苷酸序列或氨基酸残基序列的替换、缺失或插入。
术语“突变位点”在本发明中被定义为野生型糖化酶氨基酸序列中相应的氨基酸残基所在位点，也包括该氨基酸残基所对应的核苷酸碱基位点。位点所在位置计数可以包含或不包含野生型糖化酶N-端的信号肽序列。
术语“单点突变”指糖化酶氨基酸序列中一个氨基酸残基位点或对应的核苷酸序列的突变，也指糖化酶氨基酸序列中含有某个氨基酸残基位点的一个氨基酸残基或其对应的核苷酸的变化。
术语“组合突变”指糖化酶氨基酸序列中两个或两个以上氨基酸残基位点(或指其对应的核苷酸)的同时突变。两个或两个或两个以上氨基酸残基位点中，至少有一个是本发明指明的突变位点。
二十种常见的氨基酸是指苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、半胱氨酸、色氨酸、精氨酸、甘氨酸。
术语“载体”或“质粒”是指能将糖化酶基因引入到宿主菌株中的核苷酸序列，包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、表达盒和类似载体。重组载体或质粒含有本发明中的糖化酶突变体基因序列。
术语“宿主细胞”是指能够作为本发明的载体的宿主和表达媒介起作用的细胞。在本发明的一些实施方式中，“宿主细胞”是真菌细胞，主要是酵母细胞和丝状真菌。
以下将通过一些具体实施例对本发明做进一步的解释说明。
本发明使用的糖化酶基因序列(GenBank ID:AJ304803.1)已在文献中公开，具体如下：
Nielsen B R，Lehmbeck J，Frandsen T P.Cloning，heterologous expression，and enzymatic characterization of a thermostable glucoamylase fromTalaromyces emersonii[J].Protein Expression&Purification，2002，26(1)：1-8.
实施例1糖化酶突变载体表达载体的构建
野生型糖化酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。通过在PDB数据中进行同源性比对，获得与其相似度较高的糖化酶序列和蛋白结构，利用SWISS-MOLDEL在线建模网站进行同源建模，筛选出可能影响糖化酶转苷活性的突变体位点，并设计出单突变和组合突变体M1-M23(对应的突变体标识见表2)。根据设计首先送苏州泓迅生物科技有限公司合成具有4个组合突变位点的突变体基因M5，再以M5基因为模板，根据突变位点设计突变位点的引物，利用重叠延伸PCR获得具有3个突变位点的组合突变体M1和M2。同时以野生型糖化酶基因(WT)为模板，也是根据相应的突变位点设计突变位点的引物，通过重叠延伸PCR获得具有一个突变位点的单突变体M4和M6-M23。进一步以M4为模板，根据突变位点设计突变位点的引物，利用重叠延伸PCR获得具有2个突变位点的组合突变体M3。用Xho I和Not I双酶切PCR扩增出的糖化酶野生型和突变体基因片段，连接到同样双酶切的毕赤酵母表达载体pJ912上，构建成能分泌表达糖化酶野生型基因和23个突变体基因的表达载体pJ912-WT和pJ912-M1～pJ912-M23(各表达载体目的基因的3’-末端都设计有His-tag)。
表1突变体M1-M23对应标识
Figure GDA0003605802450000061
实施例2毕赤酵母重组菌株的构建
将重组质粒pJ912-WT和pJ912-M1～pJ912-M23分别用SacⅠ限制性内切酶进行线性化并电泳回收，将线性化后回收的质粒电转毕赤酵母X33宿主菌株，并涂布到含400μg/mLZeocin的YPD平板上30℃培养2-3天。并用PCR鉴定毕赤酵母阳性转化子，PCR鉴定正确的阳性转化子定义相应的重组菌株如X33WT、X33/M1、X33/M2、……X33/M23。
实施例3野生型和突变体糖化酶基因的诱导表达。
分别接种含野生型和不同突变体糖化酶基因的毕赤酵母重组菌株各8株于含1.5mL BMD1培养基(0.2M磷酸钾，13.4g/L YNB，0.4mg/L生物素，1.1％葡萄糖)的48孔深孔板中28℃，培养48-60h。然后加入1.25mL BMM2(0.2M磷酸钾，13.4g/L YNB，0.4mg/L生物素，1％甲醇)，28℃，220rpm振荡培养12h，再每24h加入加入250μL BMM10(0.2M磷酸钾，13.4g/LYNB，0.4mg/L生物素，5％甲醇)进行甲醇诱导，28℃，220rpm振荡培养72h。到期收集发酵液，12000r/min离心10min，去菌体，上清用于酶活测定。
对于野生型和每种突变体重组菌株，挑选酶活力较高的3个菌株接种到含3mLBMD1培养基的试管中，28℃，220r/min培养12h。将菌液全部转接于20mL BMD1培养基的三角瓶中，28℃，220r/min振荡培养24h。然后加入5mL BMM2，28℃，220r/min振荡培养12h，再每24h加入5mL BMM10进行甲醇诱导，28℃，220rpm振荡培养72h，收集发酵液，12000r/min离心10min，去菌体，上清用于酶活测定。选取酶活力表达最高的野生型和各种突变体菌株进行保存，利用它们发酵进行后面的重组酶的表达、纯化和酶学性质分析。
实施例4重组糖化酶的纯化及蛋白质浓度的测定
收集粗酶液上清，用10kDa、15mL超滤管4000r/min离心30min，至发酵液体积浓缩5倍。向浓缩发酵液中加入Loading缓冲液30mL，在4℃下与镍树脂在磁力搅拌器上结合1h。将混合液加入层析柱，使液体流下，反复三次，尽量使镍树脂全部转移到柱子中。用10mLWashing缓冲液清洗柱子一次，再用5mL Washing缓冲液清洗柱子一次。用5mL 400mMElution缓冲液清洗两次，纯化后酶液在超滤管中用pH 4.6、0.05M的醋酸钠置换Elutionbuffer至剩余1mL液体。SDS-PAGE电泳检测表明，重组糖化酶的纯度达到电泳纯(几种纯化突变体代表如图10所示)；然后用BCA试剂盒测定纯化后糖化酶的浓度。
实施例5重组糖化酶活力及比活力的测定
在NaOH和丙三醇存在条件下，3,5-二硝基水杨酸(DNS)与还原糖共热后被还原生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在过量的NaOH碱性溶液中显桔红色，在540nm波长处有最大吸收，且在一定浓度范围内光吸收值与还原糖含量成线性关系，可用比色法测定还原糖含量。在1.5mL EP管中加入2％可溶性淀粉溶液500μL和pH 4.6的0.05M醋酸钠缓冲液100μL，混匀后在40℃温水浴中预热10min；加入待测酶液40μL，反应30min后立即加入1mol/LNaOH 20μL终止反应，混匀后，迅速放入冰水浴，冷却2min；同时向对照管中加入热变性失活后的酶液40μL，作为阴性对照，并进行同样的操作过程。从各反应管中吸取反应溶液各50μL加入新的1.5mL EP管中，各加入100μL去离子水和200μL DNS溶液，沸水浴准确反应5min，立即放入冰水浴中2min；从每只反应管内取出20μL，加入到96孔板内，再加入250μL去离子水，吹打混匀；用酶标仪在540nm处测OD值；根据标准曲线计算还原糖含量。
酶活力的定义：1g固体酶粉(或1mL液体酶)在40℃、pH 4.6条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为1个酶活力单位，以U/g(或U/mL)表示。
根据测定的酶活力，除以酶的浓度，得到各种糖化酶的比活力，比活力单位为U/mg蛋白，结果如表2所示。表2中采用“宿主-载体-突变体编号-突变体标识”来表示毕赤酵母表达的重组糖化酶，如X33-pJ912-M1-N22C/A29C/D259E；X33-pJ912-WT则表示野生型糖化酶。
表2毕赤酵母表达的重组糖化酶的比活力和转苷活性
Figure GDA0003605802450000081
Figure GDA0003605802450000091
不同突变体的比活力有所改变，糖化酶突变体M18的比活力最高，为447.8U/mg，野生型WT的比活力为319.0U/mg。结果表明，通过定点突变对糖化酶进行改造，糖化酶突变体的比活力最高提高了约40.4％。
实施例6重组糖化酶的转苷活性分析
以异麦芽糖生成量为指标，来测得糖化酶中的转苷活性。
取1.5mL EP管，加入0.4mL的pH 4.8、0.05M醋酸钠缓冲液和0.1mL稀释过的糖化酶，混匀，再加入0.5mL 20％(w/v)的麦芽糖(用pH 4.8、0.05M醋酸钠缓冲液溶解)，吹打混匀，对照管中不加底物；置于37℃水浴锅中反应20h，立即放入沸水中10min使酶灭活。通过HPLC检测产物中异麦芽糖的含量来分析糖化酶中的转苷作用。色谱柱为糖分析柱(PrevailCarbohydrate ES 5μm，Grace公司)，流动相为73％乙腈，流速为1mL/min，进样量为5μL，柱温为室温，检测器为蒸发光散射检测器。HPLC色谱图可以观察异麦芽糖峰的变化(图2)。检测各突变体转苷酶活力的变化，与野生型糖化酶相比，转苷酶酶活力下降如图3所示。
从图3可知：259位的天冬氨酸(Asp259)替换为其它任何氨基酸后，和野生型相比，糖化酶突变体的转苷酶活力都明显下降。特别是Asp259Glu(M4)、Asp259Asn(M18)和Asp259Gln(M10)，这些糖化酶突变体的转苷酶活力比野生型糖化酶的转苷酶活力下降了93％以上，分别为100％、98％和94％。当Asp259与其它位点如Asn22、Ala29、Ala32和Ser413进行组合突变时(如M1、M3和M5)，糖化酶突变体的转苷酶活力比野生型糖化酶的转苷酶活力下降约97％、93％和95％。说明Asp259位点突变以及与Asp259位点的组合突变可以降低野生型糖化酶转苷活力。
实施例7重组糖化酶最适温度及温度稳定性的测定
在pH 4.6、0.05M醋酸钠缓冲液中，分别在40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃用DNS法检测糖化酶的活性，将酶活力最高的反应温度定义为重组糖化酶的最适温度，结果如图4所示。
将酶液溶于pH 4.6、0.05M醋酸钠缓冲液，分别置于50℃、55℃、60℃、65℃、70℃和75℃条件下保温4h后，立即在冰水浴中冷却，然后在40℃下用DNS法测糖化酶活力。将最高的酶活力定义为100％，将不同条件的测得的酶活力与其比较，计算其相对酶活力，根据各重组糖化酶的相对酶活力表示其温度稳定性，结果如图6所示。
最适温度和温度稳定性检测表明：WT最适温度为65℃，M1、M3、M5、M10和M14最适温度为70℃，其他突变体糖化酶最适温度为75℃。而且，这些突变体也有较好的温度稳定性。在60℃下放置4h后，除突变体M2外，其余酶活性都维持在80％以上；在65℃下放置4h后，仅突变体M1、M4、M5、M10和M18的酶活性维持在80％以上。但温度在70℃和75℃下放置4h后，野生型糖化酶的酶活性明显低于大部分糖化酶突变体的酶活性；特别是在75℃时，野生型糖化酶活力仅剩约17％，而大部分糖化酶突变体的酶活力维持在30％以上，突变体M1、M4、M5、M12和M18的残余活力还维持在40％以上，说明在70℃和75℃的温度条件下，野生型糖化酶没有大部分的糖化酶突变体稳定。
实施例8重组糖化酶最适pH和pH稳定性的测定
在3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的pH条件下0.05M醋酸钠缓冲液中，用DNS法检测40℃条件下糖化酶的活性，将重组糖化酶活力最高时的pH值定义为其最适pH值，结果如图6所示。
将酶液分别在pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5条件下的0.05M醋酸钠缓冲液中于4℃放置4h，然后在40℃下用DNS法测定剩余酶活力，以剩余的酶活力与其最高酶活力的比值即相对的残余酶活力作为评价酶pH稳定性的指标。结果如图7所示。
糖化酶野生型、M2、M3、M5、M7、M10-M12、M18、M19和M22的最适pH为4.5，M1和M4的最适pH为5.0最高，其余突变体最适pH为4.0。由于糖化酶在糖化反应时的pH一般为4.2-5.0。在pH 4.5-5.0范围放置4h，野生型糖化酶及其突变体都具有87％以上的酶活性。说明突变体和野生型糖化酶都具有较高的pH稳定性。
实施例9重组糖化酶的动力学分析
用0.05M，pH 4.5的醋酸钠缓冲液配制10个浓度梯度的可溶性淀粉或麦芽糖溶液(0.125Km-8 Km)为底物，加入100μL于96孔板中，在45℃条件下，用合适浓度的酶，反应0、3、6、9、12min，加入200μL的溶液(1M Tris，5U/mL葡萄糖氧化酶，1U/mL辣根过氧化物酶，0.21mg/mL邻联茴香胺，pH7.6)终止酶解反应，同时利用葡萄糖氧化酶法检测不同底物浓度不同时间点糖化酶水解底物生成葡萄糖的量，再通过软件GraphPad Prism v5.0(GraphPadSoftware,San Diego,CA,USA)中Michaelis-Menten方程计算酶反应的Vmax和Km，并计算kcat及kcat/Km值，结果如图8和图9所示。
通过比较kcat/Km值表明：以可溶性淀粉为底物时，大部分突变体的催化效率(用kcat/Km值表示)都比野生型糖化酶的催化效率高，其中M1、M4和M18的催化效率几乎是野生型糖化酶催化效率的2倍；M3、M5、M10和M23的催化效率也比野生型提高了85％以上。以麦芽糖为底物时，突变体M3、M4、M10、M16和M18的催化效率(用kcat/Km值表示)比野生型糖化酶的催化效率明显提高，最高提高约72％，突变体M1、M5、M12、M13和M15的催化效率与野生型糖化酶的催化效率基本一致。
实施例10重组糖化酶突变体在埃默森篮状菌中的表达及其转苷活力分析
根据埃默森篮状菌的基因组序列，克隆出糖化酶基因的上下游同源片段各1kb左右，其中上游同源臂(Uparm)从糖化酶基因ORF的caattg(Mfe I)序列位点向5’端延伸，下游同源臂(Downarm)从糖化酶基因ORF的cgtacg(BsiWI)序列位点向3’端延伸，这样保证同源臂中不包含本发明的突变位点。从质粒pAN-7上扩增出潮霉素B基因的转录单元hph，其中转录单元hph的5’端设计有Mfe I酶切位点，3’端设计有BsiWI酶切位点。这三个片段通过重叠PCR连接成一个片段Uparm-hph-Downarm，并且hph的5’和3’端通过唯一Mfe I和BsiWI酶切位点与Uparm和Downarm连接。然后将这个重叠PCR片段连接到pGEM-T载体上，构建成糖化酶基因敲除载体pT-hph。通过埃默森篮状菌的原生质体转化，让hph转录单元定点替代埃默森篮状菌(TeWT)基因组上的糖化酶基因的caattg位点和cgtacg位点之间的片段，并通过含潮霉素抗性的真菌培养基平板(0.5％蛋白胨、0.2％酵母提取物、2％葡萄糖、0.1％磷酸氢二甲、0.05％硫酸镁、1.5％琼脂粉、pH5.5-6)筛选出糖化酶基因可能敲除菌株。接种这些菌株于含100mL真菌培养基(0.5％蛋白胨、0.2％酵母提取物、2％葡萄糖、0.1％磷酸氢二甲、0.05％硫酸镁，pH5.5-6)的1L的三角瓶中，30℃、200r/min培养96h，过滤取上清，按前面的方法检测糖化酶的活性，若没有检测到糖化酶活力，表示糖化酶基因已经敲除，该糖化酶基因敲除菌株表示为TeΔGA。用Mfe I和BsiWI分别从pJ912-M1～pJ912-M23载体上酶切并回收出相应的糖化酶突变体片段M1～M23，连接到用同样酶切的载体pT-hph的骨架片段上，构建出包含完整的糖化酶基因M1～M23及其上下游同源臂的载体pT-M1～pT-M23。用原生质体转化的方法，将载体pT-M1～pT-M23分别转化到糖化酶基因敲除菌株TeΔGA里并在真菌培养基平板上30℃生长4天。然后平板上挑单克隆菌株，一一对应分别接种到含潮霉素B和不含潮霉素B的真菌培养基平板上30℃继续培养4天。在含潮霉素B培养基平板上不生长而在对应的不含潮霉素B的培养基上生长的菌株为可能的糖化酶突变体基因片段替代TeΔGA基因组上潮霉素基因转录片段的菌株。接种这些可能含糖化酶基因突变体的菌株，分别在25mL真菌培养基里30℃生长4天并检测糖化酶活力，有糖化酶活力的埃默森篮状菌株为能表达糖化酶突变体的菌株，分别记为TeM1～TeM23。分别接种TeWT和TeM1～TeM23至含100mL真菌培养基容积为1L的三角瓶里，30℃、200r/min培养96h，过滤取上清，再用截留分子量为10KDa离心超滤管(Amicon Ultra)进行超滤，得到粗酶液。粗酶液用阴离子交换层析(HiTrap Q XL)进一步纯化，得到电泳纯的糖化酶野生型WT及其突变体M1～M23。按照前面的方法，测定这些重组糖化酶的转苷活性，并计算转苷活性的下降值。结果如图3所示，毕赤酵母表达的重组糖化酶突变体和埃默森篮状菌表达的重组糖化酶突变体的转苷酶活力及其活力下降基本一致，说明不同宿主菌株表达的糖化酶突变体的转苷酶活性是一致的，转苷酶活性没有明显的变化。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种糖化酶突变体及其应用
<141> 2020-02-27
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 591
<212> PRT
<213> 埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)
<400> 1
Ala Thr Gly Ser Leu Asp Ser Phe Leu Ala Thr Glu Thr Pro Ile Ala
1 5 10 15
Leu Gln Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Asp Val Ala
20 25 30
Gly Ala Ser Ala Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Arg Ser Asp Pro
35 40 45
Asn Tyr Phe Tyr Ser Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ala Lys Tyr
50 55 60
Leu Val Asp Ala Phe Ile Ala Gly Asn Lys Asp Leu Glu Gln Thr Ile
65 70 75 80
Gln Gln Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Lys Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro
85 90 95
Ser Gly Asp Leu Ser Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val
100 105 110
Asn Glu Thr Ala Phe Thr Gly Pro Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly
115 120 125
Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Ala Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile
130 135 140
Asp Asn Gly Glu Ala Ser Thr Ala Asp Glu Ile Ile Trp Pro Ile Val
145 150 155 160
Gln Asn Asp Leu Ser Tyr Ile Thr Gln Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Phe
165 170 175
Asp Leu Trp Glu Glu Val Glu Gly Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val
180 185 190
Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Asn Ala Leu Ala Thr Arg Leu Asn
195 200 205
His Thr Cys Ser Asn Cys Val Ser Gln Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe
210 215 220
Leu Gln Ser Tyr Trp Thr Gly Ser Tyr Val Leu Ala Asn Phe Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Arg Ser Gly Lys Asp Val Asn Ser Ile Leu Gly Ser Ile His
245 250 255
Thr Phe Asp Pro Ala Gly Gly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys
260 265 270
Ser Ala Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg
275 280 285
Ser Ile Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Ile Ala Glu Gly Ser Ala Val Ala
290 295 300
Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr
305 310 315 320
Leu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln
325 330 335
Trp Lys Lys Ile Gly Ser Ile Ser Ile Thr Asp Val Ser Leu Pro Phe
340 345 350
Phe Gln Asp Ile Tyr Pro Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Asn Ser Gly
355 360 365
Ser Thr Thr Phe Asn Asp Ile Ile Ser Ala Val Gln Thr Tyr Gly Asp
370 375 380
Gly Tyr Leu Ser Ile Val Glu Lys Tyr Thr Pro Ser Asp Gly Ser Leu
385 390 395 400
Thr Glu Gln Phe Ser Arg Thr Asp Gly Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ala
405 410 415
Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Ala Arg Arg Gln
420 425 430
Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Ser Ser Ala Ser Ser Val Pro
435 440 445
Ala Val Cys Ser Ala Thr Ser Ala Thr Gly Pro Tyr Ser Thr Ala Thr
450 455 460
Asn Thr Val Trp Pro Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Thr Ser
465 470 475 480
Ser Ala Pro Cys Thr Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Phe Asp Glu
485 490 495
Ile Val Ser Thr Ser Tyr Gly Glu Thr Ile Tyr Leu Ala Gly Ser Ile
500 505 510
Pro Glu Leu Gly Asn Trp Ser Thr Ala Ser Ala Ile Pro Leu Arg Ala
515 520 525
Asp Ala Tyr Thr Asn Ser Asn Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Asn Leu
530 535 540
Pro Pro Gly Thr Ser Phe Glu Tyr Lys Phe Phe Lys Asn Gln Thr Asp
545 550 555 560
Gly Thr Ile Val Trp Glu Asp Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro
565 570 575
Ala Tyr Cys Gly Gln Thr Thr Ala Ile Leu Asp Asp Ser Trp Gln
580 585 590

Claims (6)

1.一种糖化酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是在如SEQ ID NO:1所示的糖化酶氨基酸序列中进行如下突变：(1)第259位氨基酸天冬氨酸替换为谷氨酸；或，
(2)第259位氨基酸天冬氨酸替换为丙氨酸；或，
(3)第259位氨基酸天冬氨酸替换为谷氨酰胺；或，
(4)第259位氨基酸天冬氨酸替换为组氨酸；或，
(5)第259位氨基酸天冬氨酸替换为色氨酸；或，
(6)第259位氨基酸天冬氨酸替换为缬氨酸；或，
(7)第259位氨基酸天冬氨酸替换为天冬酰胺；或，
(8)第259位氨基酸天冬氨酸替换为亮氨酸；或，
(9)第259位氨基酸天冬氨酸替换为赖氨酸；或，
(10)第259位氨基酸天冬氨酸替换为脯氨酸；或，
(11)第259位氨基酸天冬氨酸替换为甲硫氨酸。
2.编码权利要求1所述糖化酶突变体的基因。
3.权利要求1所述糖化酶突变体的用途，其特征在于，所述糖化酶突变体用于水解淀粉质原料多糖或寡糖的α-1,4糖苷键或α-1,6糖苷键。
4.包含权利要求2所述基因的重组载体或宿主细胞。
5.如权利要求4所述重组载体或宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是毕赤酵母、黑曲霉或埃默森篮状菌。
6.一种制备糖化酶的方法，其特征在于，培养权利要求4所述宿主细胞，并从培养物中收集糖化酶。
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