CN116410957A - 一种改性淀粉酶的基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种改性淀粉酶的基因及其应用，所述改性淀粉酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。通过在原始淀粉酶的基础上，人工的理性设进行了定点突变改造，得到改造后的改性淀粉酶的氨基酸序列，然后根据该改性淀粉酶的氨基酸序列，人工重新优化设计改性淀粉酶的基因的核苷酸序列，由该改性淀粉酶的基因编码所得的改性淀粉酶可以很好地提高酶活性和产量。改性淀粉酶最适温度为60℃，最适pH为6。该酶具有良好的耐热性，在40‑90℃温度范围内，酶活均高95％；90℃处理1h，还能保持90％以上的酶活性；pH4～9范围内，淀粉酶活均保持在最高酶活性的90％以上。本发明可以获得具有良好应用前景的高产淀粉酶AMY2‑syn菌株，这非常有利于淀粉酶AMY2‑syn推广和在工业中的应用。

Description

一种改性淀粉酶的基因及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种改性淀粉酶的基因及其应用。
背景技术
淀粉酶是一类可水解淀粉的酶的统称。尽管种类繁多，常用的淀粉酶包括：α-淀粉酶，主要用于生产麦芽糖糊精；葡萄糖淀粉酶，催化糊精得到葡萄糖；β-淀粉酶，催化可以得到麦芽糖；葡萄糖异构酶，可以催化葡萄糖将其转化为果糖。
大多数淀粉酶都是以α-1,4-糖苷键为水解对象，比如α-淀粉酶、外切型的葡糖淀粉酶等。α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)，也称为α-1,4-葡聚糖-4葡聚糖水解酶，可将淀粉和糖原等碳水化合物链分解成具有两个或三个葡萄糖单位的小片段。α-淀粉酶是一种含有至少一个Ca2+离子的金属酶，其活性依赖于Ca2+的存在。α-淀粉酶分为糖化和液化类型，水解约55％的糖化的α-淀粉酶和裂解约35％的淀粉糖苷键的液化α-淀粉酶。淀粉酶可以大大简化淀粉水解的过程，在现代工业过程中，除了原料淀粉水解的α-淀粉酶之外，还需要高活性的淀粉酶。
在工业应用中，根据最适温度不同，大致将淀粉酶分为常温、中温和耐高温淀粉酶等类型。一般认为耐高温α-淀粉酶在95～105℃仍能保持高活性，其更大的耐热潜力有待探索；中温淀粉酶的最适作用温度和pH分别为60℃和6.0；最适反应温度在60℃以上的属于中高温型α-淀粉酶。它们广泛应用于啤酒酿造、酒精工业、纸浆和造纸工业等行业；
目前在工业上大量使用的α-淀粉酶主要来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)等。专利文献CN112626053B报道了一种酸性α淀粉酶及其制备方法与应用；专利文献CN115125226A报道了一种高比活淀粉酶突变体；专利文献CN112210493B报道了一种超高麦芽糖浆生产系统及其制备方法。然而，它们很难完全满足工业应用对酶的多样性的需求。此外，酶的表达水平和生产能力也有待进一步提高。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种改性淀粉酶的基因及其应用，旨在提供一种获得高表达的中温淀粉酶，而且可以提高酶的产量，节省经济成本，满足工业化应用的要求。
为实现上述目的，本发明提出一种改性淀粉酶的基因，所述改性淀粉酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提出一种改性淀粉酶，其特征在于，所述改性淀粉酶由如上所述的改性淀粉酶基因编码所得，所述改性淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提出一种重组表达载体，包括如上所述的改性淀粉酶的基因。
本发明还提出一种如上所述的重组表达载体的制备方法，包括以下步骤：
用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ分别对改性淀粉酶基因进行双酶切，得到具有粘性末端的改性淀粉酶基因片段；
用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ分别对乳酸克鲁维酵母表达载体进行双酶切，得到具有粘性末端的乳酸克鲁维酵母表达载体片段；
用T4 DNA连接酶连接具有粘性末端的改性淀粉酶基因片段和具有粘性末端的乳酸克鲁维酵母表达载体片段，获得重组表达载体。
本发明还提出一种重组表达菌株，包括如上所述的改性淀粉酶基因。可选地，所述重组表达菌株的宿主细胞包括乳酸克鲁维酵母。
本发明还提出一种如上所述的改性淀粉酶的制备方法，培养如上所述重组表达菌株，获得改性淀粉酶。
本发明还提出一种水解淀粉的方法，包括以下步骤：在水解淀粉反应中加入如上所述的改性淀粉酶进行水解。
本发明提供的改性淀粉酶的基因，来自芽孢杆菌，是在原始淀粉酶的基因上，通过蛋白质理性设计对原始淀粉酶中的三个氨基酸进行了定点突变改造，得到改造后的改性淀粉酶的氨基酸序列。具体来说是将原始淀粉酶氨基酶中第50位的苏氨酸突变成亮氨酸(T50L)，第55位的缬氨酸突变成天冬氨酸(V55N)，第84位酪氨酸突变成亮氨酸(Y84L)。然后根据该改性淀粉酶的氨基酸序列，人工重新设计改性淀粉酶的基因的核苷酸序列，采用高频率的密码子替换低频率的密码子，降低了基因编码的mRNA的二级结构的复杂度和最小自由能，平衡基因中GC的含量及分布，移除基因中的重复序列和顺式作用单元，设计出了新型改性淀粉酶的基因序列。由该改性淀粉酶的基因编码所得的改性淀粉酶具有最适温度为60℃，最适pH为6。该酶具有良好的耐热性。在40-90℃范围内，酶活均高95％；90℃处理1h，还能保持90％以上的酶活性；pH4-9范围内，淀粉酶活均保持在最高酶活性的90％以上。本发明获得的淀粉酶水解淀粉的产物为麦芽低聚糖，适合工业上的生产应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中原始淀粉酶用于突变的三个氨基酸第50位的亮氨酸、第55位的天冬氨酸和第84位的亮氨酸在三维结构中所在的位置图；
图2为本发明实施例3中改性淀粉酶的基因amy2-syn克隆入重组表达载体pKLAC2的酶切检验结果图；
图3为原始淀粉酶的基因与本发明实施例4和实施例5中改性淀粉酶的基因分别在乳酸克鲁维酵母中表达后的SDS-PAGE电泳检测结果图；
图4为突变前的原始淀粉酶和本发明实施例6中的突变后的改性淀粉酶的最适温度测定图；
图5为本发明突变前的原始淀粉酶和本发明实施例6中的突变后的改性淀粉酶的最适pH测定图；
图6为本发明突变前的原始淀粉酶和本发明实施例6中的改性淀粉酶的温度稳定性测定图；
图7为本发明突变前的原始淀粉酶和本发明实施例6中的改性淀粉酶的pH的稳定性测定图；
图8为本发明实施例7中获得的改性淀粉酶的酶解产物分析图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提出一种改性淀粉酶的基因，所述改性淀粉酶的基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，具体序列表如下所示：
SEQ ID NO：1：
GCTGCTCCATTTAACGGTACTATGATGCAATACTTTGAATGGTACTTGCCAGATGATGGTACTTTGTGGACTAAGGTTGCTAACGAAGCTAACAACTTGTCTTCTTTGGGTATTACTGCTTTGTGGTTGCCACCAGCTTACAAGGGTTTGTCTAGATCTGATAACGGTTACGGTGTTTACGATTTGTACGATTTGGGTGAATTTAACCAAAAGGGTACTGTTAGAACTAAGTACGGTACTAAGGCTCAATTGTTGCAAGCTATTCAAGCTGCTCATGCTGCTGGTATGCAAGTTTACGCTGATGTTGTTTTTGATCATAAGGGTGGTGCTGATGGTACTGAATGGGTTGATGCTGTTGAAGTTAACCCATCTGATAGAAACCAAGAAATTTCTGGTACTTACCAAATTCAAGCTTGGACTAAGTTTGATTTTCCAGGTAGAGGTAACACTTACTCTTCTTTTAAGTGGAGATGGTACCATTTTGATGGTGTTGATTGGGATGAATCTAGAAAGTTGTCTAGAATTTACAAGTTTAGAGGTATTGGTAAGGCTTGGGATTGGGAAGTTGATACTGAAAACGGTAACTACGATTACTTGATGTACGCTGATTTGGATATGGATCATCCAGAAGTTGTTACTGAATTGAAGAACTGGGGTAAGTGGTACGTTAACACTACTAACATTGATGGTTTTAGATTGGATGCTGTTAAGCATATTAAGTTTTCTTTTTTTCCAGATTGGTTGTCTTACGTTAGATCTCAAACTGGTAAGCCATTGTTTACTGTTGGTGAATACTGGTCTTACGATATTAACAAGTTGCATAACTACATTACTAAGACTGATGGTACTATGTCTTTGTTTGATGCTCCATTGCATAACAAGTTTTACACTGCTTCTAAGTCTGGTGGTGCTTTTGATATGAGAACTTTGATGACTAACACTTTGATGAAGGATCAACCAACTTTGGCTGTTACTTTTGTTGATAACCATGATACTGAACCAGGTCAAGCTTTGCAATCTTGGGTTGATCCATGGTTTAAGCCATTGGCTTACGCTTTTATTTTGACTAGACAAGAAGGTTACCCATGTGTTTTTTACGGTGATTACTACGGTATTCCACAATACAACATTCCATCTTTGAAGTCTAAGATTGATCCATTGTTGATTGCTAGAAGAGATTACGCTTACGGTACTCAACATGATTACTTGGATCATTCTGATATTATTGGTTGGACTAGAGAAGGTGTTACTGAAAAGCCAGGTTCTGGTTTGGCTGCTTTGATTACTGATGGTCCAGGTGGTTCTAAGTGGATGTACGTTGGTAAGCATCATGCTGGTAAGGTTTTTTACGATTTGACTGGTAACAGATCTGATACTGTTACTATTAACTCTGATGGTTGGGGTGAATTTAAGGTTAACGGTGGTTCTGTTTCTGTTTGGGTTCCAAGAAAGACTACTGTTTCTACTATTGCTTAA。
本发明提供的改性淀粉酶的基因，是在原始淀粉酶的基础上，为了提高其活性、蛋白质结构的稳定性和表达量。通过蛋白质理性设计的方式对其中的三个氨基酸进行了突变，其中，采用了反向PCR扩增技术和无缝克隆技术构建突变体的方法，通过人工定向改造，提高了其活性和表达水平。
优选地，所述改性粉酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的，但是实际中，所述的改性淀粉酶的基因含有SEQ ID NO：1所示的碱基序列具有95％以上的同一性，也可实现本发明的效果。在最优情况下，本发明所述的改性淀粉酶的基因的核苷酸序列为如SEQID NO：1所示。
具体改造过程包括：以构建好的α-淀粉酶重组表达载体pKLAC-amy为模板，在要突变的位点附近设计引物P1、P2、P3、P4、P5、P6；利用高保真酶的高保真性和延长能力进行反向扩增PCR，反向扩增出线性DNA片段；利用DpnⅠ酶能够识别甲基化位点的能力来进行酶切消化模板，去除未突变的模板；然后转化到大肠杆菌里面，利用大肠杆菌同源重组修复能力即可自身环化得到突变后的重组表达质粒，先通过双酶切检测是否构建了重组载体，再进行测序检测突变是否正确。通过上述方法将原始淀粉酶氨基酸序列中第50位的苏氨酸突变成亮氨酸(T50L)，第55位的缬氨酸突变成天冬氨酸(V55N)，第84位酪氨酸突变成亮氨酸(Y84L)，从而获得改性淀粉酶的氨基酸。
所述改性淀粉酶的氨基酸的序列如SEQ ID NO：2所示，具体序列表如下所示：
SEQ ID NO：2：
AAPFNGTMM
QYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITALWLPPAYKGLSRSDNG
YGVYDLYDLGE
FNQKGTVRTKYGTKAQLLQAIQAAHAAGMQVYADVVFDHKGGADG
TEWVDAVEVNPSD
RNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDESRK
LSRIYKFRGIGK
AWDWEVDTENGNYDYLMYADLDMDHPEVVTELKNWGKWYVNTT
NIDGFRLDAVKHIKF
SFFPDWLSYVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNYITKTDGTMSLFD
APLHNKFYTAS
KSGGAFDMRTLMTNTLMKDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDP
WFKPLAYAFILTR
QEGYPCVFYGDYYGIPQYNIPSLKSKIDPLLIARRDYAYGTQHDYLDH
SDIIGWTREG
VTEKPGSGLAALITDGPGGSKWMYVGKHHAGKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSVSVWVPRKTTVSTIA。
然后根据该改性淀粉酶的氨基酸序列作为模板，并且在进化密码子中选择在乳酸克鲁维酵母中经常使用的密码子来翻译相应的氨基酸，显著提高了人工设计的淀粉酶的基因的密码子使用频率，降低了基因编码的mRNA的二级结构的复杂度和最小自由能，平衡基因中GC的含量及分布，移除基因中的重复序列和顺式作用单元，有助于提高其在乳酸克鲁维酵母细胞中的表达，由此设计出了新型改性淀粉酶的基因序列，然后通过人工合成的方法获得改性淀粉酶的基因片段，由该改性淀粉酶的基因编码所得的改性淀粉酶具有最适温度为60℃，最适pH为6，该酶具有良好的耐热性。在40-90℃范围内，酶活均高95％；90℃处理1h，还能保持90％以上的酶活性；pH在4-9范围内，淀粉酶活均保持在最高酶活性的90％以上。本发明获得的淀粉酶水解淀粉的产物为葡萄糖和麦芽低聚糖，适合工业上的生产应用。
可以理解的是，定点突变技术以及人工合成基因的技术为本领域常规的方法，具体操作步骤为本领域技术人员所公知，在此不做赘述。原始淀粉酶的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示，具体序列表如下所示：
SEQ ID NO：3：
AAPFNGTMM
QYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITALWLPPAYKGTSRSDVG
YGVYDLYDLGE
FNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQVYADVVFDHKGGADG
TEWVDAVEVNPSD
RNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDESRK
LSRIYKFRGIGK
AWDWEVDTENGNYDYLMYADLDMDHPEVVTELKNWGKWYVNTT
NIDGFRLDAVKHIKF
SFFPDWLSYVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNYITKTDGTMSLFD
APLHNKFYTAS
KSGGAFDMRTLMTNTLMKDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDP
WFKPLAYAFILTR
QEGYPCVFYGDYYGIPQYNIPSLKSKIDPLLIARRDYAYGTQHDYLDH
SDIIGWTREG
VTEKPGSGLAALITDGPGGSKWMYVGKHHAGKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSVSVWVPRKTTVSTIA
原始淀粉酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，具体序列表如下所示：
SEQ ID NO：4：
gccgc accgtttaac
ggcaccatga tgcagtattt tgaatggtac ttgccggatg atggcacgtt atggaccaaa
gtggccaatg aagccaacaa cttatccagc cttggcatca ccgctctttg gctgccgccc
gcttacaaag gaacaagccg cagcgacgta gggtacggag tatacgactt gtatgacctc
ggcgaattca atcaaaaagg gaccgtccgc acaaaatacg gaacaaaagc tcaatatctt
caagccattc aagccgccca cgccgctgga atgcaagtgt acgccgatgt cgtgttcgac
cataaaggcg gcgctgacgg cacggaatgg gtggacgccg tcgaagtcaa tccgtccgac
cgcaaccaag aaatctcggg cacctatcaa atccaagcat ggacgaaatt tgattttccc
gggcggggca acacctactc cagctttaag tggcgctggt accattttga cggcgttgat
tgggacgaaa gccgaaaatt gagccgcatt tacaaattcc gcggcatcgg caaagcgtgg
gattgggaag tagacacgga aaacggaaac tatgactact taatgtatgc cgaccttgat
atggatcatc ccgaagtcgt gaccgagctg aaaaactggg ggaaatggta tgtcaacaca
acgaacattg atgggttccg gcttgatgcc gtcaagcata ttaagttcag tttttttcct
gattggttgt cgtatgtgcg ttctcagact ggcaagccgc tatttaccgt cggggaatat
tggagctatg acatcaacaa gttgcacaat tacattacga aaacagacgg aacgatgtct
ttgtttgatg ccccgttaca caacaaattt tataccgctt ccaaatcagg gggcgcattt
gatatgcgca cgttaatgac caatactctc atgaaagatc aaccgacatt ggccgtcacc
ttcgttgata atcatgacac cgaacccggc caagcgctgc agtcatgggt cgacccatgg
ttcaaaccgt tggcttacgc ctttattcta actcggcagg aaggataccc gtgcgtcttt
tatggtgact attatggcat tccacaatat aacattcctt cgctgaaaag caaaatcgat
ccgctcctca tcgcgcgcag ggattatgct tacggaacgc aacatgatta tcttgatcac
tccgacatca tcgggtggac aagggaaggc gtcacggaaa aaccaggatc cggactggcc
gcactgatca ccgatgggcc gggaggaagc aaatggatgt acgttggcaa acaccacgcc
ggaaaagtgt tctatgacct taccggcaac cggagtgaca ccgtcaccat caacagtgat
ggatgggggg agttcaaagt caatggcggt tcggtttcgg tttgggttcc tagaaaaacg
accgtctcta ccatcgctta g。
本发明还提出一种重组表达载体，所述重组表达载体包括如上所述的改性淀粉酶的基因。在改性淀粉酶的氨基酸序列和改性淀粉酶的基因的核苷酸序列确定的情况下，可以选择合适的表达载体或其他功能单位。对于重组表达载体的制备方法采用基因工程常规手段即可实现，在本发明具体实施时，乳酸克鲁维酵母表达体系具有生物安全性高、成熟的高密度发酵技术和配套生产技术等诸多优势，使其成为工业化生产的理想菌株，故本实施例采用的是乳酸克鲁维酵母表达载体pKLAC2。
本发明还提出一种如上所述的重组表达载体的制备方法，包括以下步骤：
用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ对改性淀粉酶的基因进行双酶切，得到具有粘性末端的改性淀粉酶基因片段；
用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ对乳酸克鲁维酵母表达载体进行双酶切，得到具有粘性末端的乳酸克鲁维酵母表达载体片段；
用T4 DNA连接酶连接具有粘性末端的改性淀粉酶基因片段和具有粘性末端的乳酸克鲁维酵母表达载体片段，获得重组表达载体。
具体地，在本发明的一实施例中，所述表达载体为乳酸克鲁维酵母表达载体pKLAC2，对应地，所述重组表达载体的制备方法包括：分别用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ对所述改性淀粉酶的基因进行双酶切，得到具有粘性末端的改性淀粉酶的基因amy2-syn片段；同时对乳酸克鲁维酵母表达载体pKLAC2再用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ进行双酶切，得到具有粘性末端的乳酸克鲁维酵母表达载体片段，再通过T4 DNA连接酶连接上述具有粘性末端的改性淀粉酶的基因片段和具有粘性末端的表达载体pKLAC2片段，获得重组表达载体pKLAC-amy2-syn。
本发明还提出一种重组表达菌株，包括如上所述的改性淀粉酶的基因，所述重组表达菌株的表达产物为氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的改性淀粉酶。所述重组表达菌株在构建时可以选用合适的宿主细胞，例如选择基因工程领域常用的宿主细胞均可，在本发明的一实施例中优选可选择乳酸克鲁维酵母作为宿主细胞，所获得的改性淀粉酶的基因在重组菌株中具有更高的表达量。
具体地，在本发明的一实施例中，所述表达载体为乳酸克鲁维酵母表达载体pKLAC2，所述宿主细胞为乳酸克鲁维酵母，对应地，所述重组表达菌株的制备方法包括：用限制性内切酶BglⅡ将上述制备得到的重组表达载体pKLAC-amy2-syn线性化，再通过电转化的方式将线性化的重组表达载体pKLAC-amy2-syn导入乳酸克鲁维酵母细胞中，并在含有zeocin抗性的YPD平板上筛选阳性克隆即获得重组表达菌株。
本发明还提出一种如上所述的改性淀粉酶的制备方法，培养如上所述重组表达菌株，获得改性淀粉酶，再在水解淀粉反应中加入上述所述的改性淀粉酶进行水解。
所述改性淀粉酶水解淀粉的产物为葡萄糖和麦芽低聚糖，适合工业上的生产应用。
具体地，在本发明的一实施例中，所述培养的操作步骤如下：挑选所述获得的重组表达菌株单菌落接种至YPD液体培养基中，于28℃、180rpm过夜培养作为种子液，再将种子液以1/10(种子液与发酵培养基的体积比)的接种量接种至30L基础盐培养基中，培养条件为28℃，每隔20h后，通过流加方式补充50％的甘油，随后，以2～4mL/L/h物料的速度添加甲醇诱导表达。在诱导120h后停止发酵，取发酵上清液测定淀粉酶的活性，利用Bradford法测定蛋白含量。
在实际操作时，将一定量的所述改性淀粉酶加入到淀粉，在一定条件下与淀粉充分接触，即可实现淀粉的水解。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1对原始淀粉酶进行定点突变的过程
本实例用于说明将原始淀粉酶Amy中的三个氨基酸进行定点突变的过程。具体实施实施过程如下：根据原始芽孢杆菌α-淀粉酶Amy的三维结构，通过蛋白质结构设计的方式对其中三个氨基酸进行突变。具体的步骤包括：
(1)利用原始淀粉酶基因构建好的已知目的基因序列的重组载体，设计突变位点，突变位点的两侧沿相反方向设计引物，上游引物为突变位点上游9bp碱基加突变位点下游20bp碱基；下游引物为突变位点下游9bp碱基加突变位点上游20bp碱基的反向互补序列。互补区域的设计主要为了在PCR产物的两端引入一对20bp的同源臂，便于线性片段的同源重组和自身环化。
上游引物P1：5’-TACAAAGGATTGAGCCGCAGCGACGTAGGGTA-3’
下游引物P2：5’-GCTGCGGCTCAATCCTTTGTAAGCGGGCGGCA-3’
上游引物P3：5’-CGCAGCGACAATGGGTACGGAGTATACGACTT-3’
下游引物P4：5’-TCCGTACCCATTGTCGCTGCGGCTTGTTCCTT-3’
上游引物P5：5’-AAAGCTCAACTGCTTCAAGCCATTCAAGCCGC-3’
下游引物P6：5’-GGCTTGAAGCAGTTGAGCTTTTGTTCCATATT-3’
PCR反应体系为50μL：20μL Prime STAR、25μL ddH2O、2μL上游引物、2μL下游引物、1μL质粒。反应条件：95℃,3min；随后98℃10s，55℃5s，72℃50s循环25次；最后72℃5min。再消除模板PCR产物里面含有原来序列的模板，体系为：rcutSmart buffer 5μL、DpnⅠ1μL，放置于37℃水浴锅内水浴1h。使用胶回收纯化扩增的目的片段。
(2)通过同源重组的原理来计算重组反应所需的DNA量。
根据一步克隆体系算X＝(0.02x重组载体大小)/浓度
体系是10μL：2μL线性化载体、2μL5XCE buffer、1μLExnaseⅡ、5μL ddH2O。使用移液枪吹打混匀，短暂离心将反应液收集至管底；37℃反应30min，立即放于冰上。
(3)在冰上解冻克隆感受态细胞
取10μL一步克隆产物加入100μL大肠杆菌感受态中，混匀，于冰上30min；42℃水浴45s，立即放于冰上2-3min；加900μL LB培养基(无抗)，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)；5000rpm离心5min，弃去900μL上清，涂平板。
(4)双酶切和测序验证：原始淀粉酶Amy序列中第50位的苏氨酸是否突变成亮氨酸(T50L)，第55位的缬氨酸是否突变成天冬氨酸(V55N)，第84位酪氨酸是否突变成亮氨酸(Y84L)。突变后的淀粉酶AMY2-syn的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，原始淀粉酶Amy的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。图1所示为突变位点在淀粉酶三维结构中所在的位置。
实施例2改性淀粉酶的密码子的优化
本实施例基于重新设计引入新的改性淀粉酶的氨基酸序列，人工重新设计了淀粉酶基因的核苷酸序列，具体改造过程包括：以改性淀粉酶的氨基酸序列为基础，在每一个氨基酸对应的简并密码子中，采用在乳酸克鲁维酵母中高频率使用的密码子替代低频率的密码子，降低了基因编码的mRNA的二级结构的复杂度和最小自由能，平衡基因中GC的含量及分布，移除基因中的重复序列和顺式作用单元。
本实例根据淀粉酶的氨基酸序列，经人工设计并优化后，获得了新型淀粉酶基因amy2-syn，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，命名为amy2-syn，所述淀粉酶基因amy2-syn编码的淀粉酶AMY2-syn的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示，所述原始淀粉酶基因amy的核苷酶序列如SEQ ID NO：4如示，所编码的淀粉酶Amy的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
实施例3重组表达载体的构建
(1)分别用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ对所述改性淀粉酶的基因进行双酶切，得到具有粘性末端的改性淀粉酶的基因amy2-syn片段；同时对乳酸克鲁维酵母表达载体pKLAC2再用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ进行双酶切，得到具有粘性末端的乳酸克鲁维酵母表达载体片段；
(2)将上述的酶切产物再通过T4 DNA连接酶连接上述具有粘性末端的改性淀粉酶的基因片段和具有粘性末端的表达载体pKLAC2片段，获得重组表达载体pKLAC-amy2-syn。其中，连接体系为：总体积为10μL，其中含有100ng的amy、50ng的pKLAC和10U的T4 DNA连接酶；在16℃条件下连接10小时，获得重组表达载体pKLAC-amy2-syn。
图2所示：图中泳道M为Marker，泳道1为pKLAC2载体，泳道2为amy2-syn基因。
由图2可知：优化后的淀粉酶基因amy2-syn和原始淀粉酶基因amy成功连接至pKLAC2重组表达载体上。
实施例4改性淀粉酶的基因在摇瓶中的发酵生产
(1)将实施例3中含有淀粉酶amy2-syn基因(或者原始淀粉酶基因)的已经导入到乳酸克鲁维酵母中的重组菌，接种到50mL BMGY培养基中，过夜培养，获得种子液。BMGY发酵培养基的配方为：1％酵母粉、2％蛋白胨、100mM磷酸缓冲液(pH 6.0)、10mM 10％甘油。
(2)将上述种子液接种至含50mL BMMY发酵培养基的摇瓶中进行发酵培养。发酵72d，每天准时加1％的甲醇。发酵结束后，取上清液进行处理后跑蛋白胶验证表达量。
图3所示：图中泳道M为Marker，泳道1，2和3为原始淀粉酶Amy，泳道4和5为优化改性后的淀粉酶AMY2-syn。
由图3可知：优化改性后的淀粉酶AMY2-syn的产量明显高于原始淀粉酶Amy。
实施例5改性淀粉酶的基因的粗酶液活性的检测
酶活单位(U)的定义：在最适条件下，每分钟水解可溶性淀粉生成1μmoL葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位。
酶活的测定方法采用DNS(3,5-二硝基水杨酸)法：将配制的1％可溶性淀粉溶液作为底物，缓冲液为0.2mol/L的Na2HPO4和0.1mol/L的柠檬酸配置，测量体系包括100μL的底物和100μL的缓冲液，再加100μL适当稀释的酶液，在50℃水浴锅中反应5min，加入300mL的DNS试剂终止反应后，置于沸水浴中处理5min，快速冷却至室温后加无菌水定容到2mL，用紫外分光光度计读取在波长540nm下的吸光值，每组反应设置1个空白对照及3个平行。
图3中：M为蛋白质标准；泳道1-3为原始淀粉酶基因表达；泳道4和5为优化后的改性淀粉酶的基因表达。
结果由图3可知：优化淀粉酶产量明显高于原始淀粉酶。经测定，原始淀粉酶Amy的总酶活为854.5U/mL，突变后的改性淀粉酶AMY2-syn的总酶活为1628.0U/mL。原始淀粉酶的比酶活为1084.4U/mg，改性淀粉酶的比酶活为2255.0U/mg。从以上数据中可以得出优化后的比酶活比原始淀粉酶高1.08倍。
实施例6突变前和突变后酶学性质的测定
(1)最适温度的测定
在pH为7的条件下，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的条件下测定酶活，以确定其最适温度。将最高酶活设定为100％，每组实验设3组重复。
由图4可知，优化后改性淀粉酶的最适温度均为60℃。
(2)最适pH的测定
在最适温度的条件下，分别在pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的Na2HPO4-citricacid缓冲液和pH为9.0、10.0、11.0的Gly-NaOH缓冲液中反应5min测定酶活，以确定最适pH。将最高酶活设定为100％，每组实验设3组重复。由图5可知，原始淀粉酶的最适pH为7，突变后的改性淀粉酶的最pH为6。
(3)温度稳定性
将稀释100倍的酶液放入30℃～90℃孵育1h，然后立即放入冰上，将100μL处理后的酶液与100μL的底物和100μL的缓冲液反应5min，测定酶活。将最高酶活设定为100％，每组实验设3组重复。
由图6可知，孵育1h后突变后改性淀粉酶的相对酶活略为降低了一点，但是整体而言，突变后改性淀粉酶的耐热性优于原始淀粉酶。
(4)pH稳定性
将酶液与不同pH(pH 3.0～11.0)的缓冲液放4℃孵育30min，将100μL处理后的酶液与100μL的底物和100μL的缓冲液反应5min，测定酶活。将最高酶活设定为100％，每组实验设3组重复。
由图7可知，孵育30min后，原始淀粉酶在pH4～7之间比较稳定，突变体在pH5～7之间比较稳定。当pH为10～11，原始和突变后的改性淀粉酶的活性均大幅度降低。
实施例7淀粉酶水解淀粉的应用
将酶液与1％淀粉底物在60℃进行反应，并于不同反应时间取样，酶解产物经10000rpm/min离心后，收集上清备用。采用薄层层析法(TLC)对降解产物进行分析，展开剂为正丁醇-乙醇-水(2:1:1，体积比)，显色剂为二苯胺2g+苯胺2mL+85％磷酸10mL+浓盐酸1mL+丙酮100mL。
图8所示：图中：泳道M为标准混合物，泳道1-5分别为酶与底物反应1、2、3、4、5h的反应产物。
由图8可知：优化后的淀粉酶高产菌株与淀粉反应的最终产物为麦芽五塘、麦芽四糖、麦芽三糖、麦芽二糖、葡萄糖。随着反应时间的延长，反应产物逐渐在增加。
综上所述，本发明通过酶分子设计，向原始芽孢杆菌α-淀粉酶Amy中引入三个氨基酸突变，大幅度提高了活性和稳定性；通过乳酸克鲁维酵母对同一氨基酸的简并密码子的偏好性对淀粉酶基因的核苷酸序列进行优化设计，合成出高效表达的芽孢杆菌α-淀粉酶基因amy2-syn。该基因与表达载体pKLAC2连接后，再通过转入乳酸克鲁维酵母中表达，获得了高效表达的、高产的芽孢杆菌α-淀粉酶生产菌株。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，由于淀粉酶AMY2-syn其氨基酸序列、用于编码该淀粉酶的基因序列amy2-syn等进行改进，可显著提高淀粉酶的活性。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种改性淀粉酶的基因，其特征在于，所述改性淀粉酶的基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
2.一种改性淀粉酶，其特征在于，所述改性淀粉酶由如权利要求1所述的改性淀粉酶基因编码所得，所述改性淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包括如权利要求1所述的改性淀粉酶的基因。
4.一种如权利要求3所述的重组表达载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ分别对改性淀粉酶基因进行双酶切，得到具有粘性末端的改性淀粉酶基因片段；
用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ分别对乳酸克鲁维酵母表达载体进行双酶切，得到具有粘性末端的乳酸克鲁维酵母表达载体片段；
用T4 DNA连接酶连接具有粘性末端的改性淀粉酶基因片段和具有粘性末端的乳酸克鲁维酵母表达载体片段，获得重组表达载体。
5.一种重组表达菌株，其特征在于，包括如权利要求1所述的改性淀粉酶基因。
6.如权利要求5所述的重组表达菌株，其特征在于，所述重组表达菌株的宿主细胞包括乳酸克鲁维酵母。
7.一种改性淀粉酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
培养如权利要求5或6所述重组表达菌株，获得改性淀粉酶。
8.一种水解淀粉的方法，其特征在于，包括以下步骤：在水解淀粉反应中加入如权利要求2所述的改性淀粉酶进行水解。
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