CN107532155B

CN107532155B - 截短普鲁兰酶及其生产方法和应用方法

Info

Publication number: CN107532155B
Application number: CN201580075329.7A
Authority: CN
Inventors: 范岩; 陆亚敏; 杜秀贞; 杜华东; 李峰
Original assignee: Nanjing Bestzyme Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Nanjing Bestzyme Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2015-02-04
Filing date: 2015-11-10
Publication date: 2019-06-25
Anticipated expiration: 2035-11-10
Also published as: EP3253869A1; US20160369254A1; WO2016126294A1; JP2018504136A; CN107532155A; US10400228B2; EP3253869A4; HK1244842A1; JP6505240B2

Abstract

提供具有亲本普鲁兰酶N末端缺失的截短普鲁兰酶。与亲本普鲁兰酶相比，这些截短普鲁兰酶具有改变的特性，包括提高的糖化效率、低于4.5的酸性pH值下以及高达64℃的更高温度下更高的催化活性。与亲本酶相比，这些截短普鲁兰酶还具有改善的热稳定性。还提供了包含截短普鲁兰酶和葡糖淀粉酶的组合物，以及在淀粉工业中应用截短普鲁兰酶和该组合物的方法。还描述了编码截短普鲁兰酶的多核苷酸，以及用于生产截短普鲁兰酶的重组宿主细胞。

Description

截短普鲁兰酶及其生产方法和应用方法

背景技术

提取自玉米、木薯、大米、马铃薯和小麦的淀粉是淀粉工业大规模生产糖及衍生物的原料的主要来源。一般淀粉通常包含两种类型的大分子：直链淀粉和支链淀粉，这两种大分子的相对数量主要取决于来源的种类。直链淀粉是一种线性多糖，由仅通过α-1,4糖苷键连接的葡萄糖残基组成；而支链淀粉，除了α-1,4糖苷键以外，葡萄糖残基还通过α-1,6糖苷键连接而形成分支点。为了降解淀粉并获得单糖，淀粉首先由耐热的α-淀粉酶解聚，其部分降解α-1,4糖苷键，然后是糖化步骤，在该步骤中，通过添加葡糖淀粉酶或β-淀粉酶，将较小的分支和线性单元进一步转化为葡萄糖或麦芽糖(Norman,1982)。

有人提出，添加能够在淀粉糖化的过程中水解α-1,6糖苷键的脱支酶能产生更高纯度的葡萄糖和麦芽糖糖浆。同时，脱支酶能减少糖化时间并提高应用底物的浓度(Bakshi等,1992)。现在，这种应用已广泛用于工业，例如用于淀粉转化、啤酒酿造和直链淀粉生产。

普鲁兰酶(普鲁兰糖6-葡聚糖水解酶,EC 3.2.1.41)被归类为一种脱支酶，其特异性水解淀粉、普鲁兰糖以及相关的支链多糖中的α-1,6糖苷键。鉴于淀粉糖化期间对改进这样的酶技术和降低生产成本的需求不断增长，寻求淀粉转化中更有效的改进普鲁兰酶在工业界和学术界均已成为一个重要领域。

已经从植物和微生物中发现和表征了很多微生物普鲁兰酶，包括克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumonia)(d’Enfert,Ryter等,1987)、嗜热厌氧菌闪光杆菌(Fervidobacterium pennavorans)(Koch,Canganella等,1997)、嗜温高温放线菌(Thermoactinomyces thalpophilus)(Odibo等,1988)以及芽孢杆菌(Bacillus species)(Nakamura,Watanabe等,1975)。已报道了来源于细菌普鲁兰酶的经改造的普鲁兰酶(例如，美国专利号7,906,306、美国专利号7,449,320和美国专利号7,968,691)。例如，美国专利号7,449,320报告了来源于天然细菌普鲁兰酶(SEQ ID NO:25)的截短型普鲁兰酶的混合物，所述混合物N末端缺失98个和102个氨基酸残基，是由重组宿主细胞的胞外蛋白酶切割成熟普鲁兰酶而获得的。据报道，这个混合物在pH4.5最稳定。然而，截短型没有被分离，混合物的活性也没有与未截短成熟形式的活性进行比较。

美国专利号7,968,691公开了一种来源于天然细菌普鲁兰酶的截短普鲁兰酶，其N末端缺失104个氨基酸，通过将编码截短普鲁兰酶的质粒转化入枯草芽孢杆菌(B.subtilis)并在普鲁兰覆盖分析中筛选降解圈的形成，测试了普鲁兰酶活性(0.1％100mM NaAc pH 5.0,1％)。

最具商业价值的普鲁兰酶是来源于芽孢杆菌的普鲁兰酶，尤其是嗜酸普鲁兰芽胞杆菌(Bacillus acidopullulyticus)(Lappalainen等,1991；Kusano等,1988)和脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)(Deweer等，美国专利号6,074,854，2000)。这些普鲁兰酶的分子量约为100KD，大小与其他来源的普鲁兰酶类似，具有在60℃和酸性pH下水解α-1,6糖苷键的能力。尽管适合用于淀粉工业中高纯度葡萄糖和麦芽糖浆的生产，但在升高的温度及低pH条件下(特别是在超过60℃的温度及低于4.5的pH值下)，来源于嗜酸普鲁兰芽胞杆菌和脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶显示出缓慢的糖化效率和降低的酶活性，而这些条件是控制工业生产的常用条件。

因此，本领域需要改进的普鲁兰酶，其在温度超过60℃及pH值低于4.5时，具有提高的糖化效率和改善的酶活性。

发明概述

本发明提供截短普鲁兰酶，与相应的亲本普鲁兰酶相比，其具有改善的催化α-1,6糖苷键的糖化的能力，从而满足了上述需求。特别是，与相应的亲本普鲁兰酶的酶活性相比，本发明的截短普鲁兰酶在超过60℃的温度及低于4.5的pH值下表现出改善的酶活性。

在一方面，本发明涉及分离或纯化的截短普鲁兰酶，其包含亲本普鲁兰酶氨基末端94到115个氨基酸残基的缺失，其中，亲本普鲁兰酶包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

根据本发明的具体实施方式，截短普鲁兰酶包含亲本普鲁兰酶氨基末端94个氨基酸、102个氨基酸或104个氨基酸的缺失。在其他具体实施方式中，截短普鲁兰酶由SEQ IDNO:6、8或9的氨基酸序列组成。

在另一方面，本发明涉及一种水解碳水化合物中α-1,6糖苷键的方法，包括：在适合水解α-1,6糖苷键的条件下，用本发明的分离或纯化的截短普鲁兰酶接触碳水化合物。

在另一方面，本发明涉及一种催化具有一个或多个α-1,6糖苷键的碳水化合物糖化的方法，包括：在适合糖化的条件下，用分离或纯化的包含亲本普鲁兰酶氨基末端94到115个氨基酸缺失的截短普鲁兰酶接触碳水化合物，其中，所述条件包括：4.5或更低的pH、以及60℃或更高温度中的至少一个，并且，其中，该亲本普鲁兰酶包含SEQ ID NO:2或SEQID NO:4的氨基酸序列。

在另一方面，本发明涉及一种催化具有一个或多个α-1,6糖苷键的碳水化合物糖化的方法，包括：在适合糖化的条件下，用葡糖淀粉酶和分离或纯化的包含亲本普鲁兰酶氨基末端94到115个氨基酸缺失的截短普鲁兰酶接触碳水化合物，其中，所述条件包括4.5或更低的pH、以及60℃或更高温度中的至少一个，并且，其中，该亲本普鲁兰酶包含SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

在还另一方面，本发明涉及一种用于催化具有一个或多个α-1,6糖苷键的碳水化合物糖化的系统，包括碳水化合物、葡糖淀粉酶、以及分离或纯化的包含亲本普鲁兰酶氨基末端94到115个氨基酸缺失的截短普鲁兰酶，处于适合糖化的条件下，其中，所述条件包括4.5或更低的pH、以及60℃或更高温度中的至少一个，其中，该亲本普鲁兰酶包含SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

在本发明的具体实施方式中，截短普鲁兰酶由选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成。

在还另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含葡糖淀粉酶、分离或纯化的具有亲本普鲁兰酶氨基末端94到115个氨基酸缺失的截短普鲁兰酶，其中，亲本普鲁兰酶包含SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

且在还另一方面，本发明涉及一种生产本发明截短普鲁兰酶的方法，包括：

(a)在适合截短普鲁兰酶表达的条件下，培养包含编码截短普鲁兰酶的合成多核苷酸的重组宿主细胞；以及

(b)从重组宿主细胞或其上清液中获得截短普鲁兰酶。

本发明的实施方式还涉及编码本发明截短普鲁兰酶的多核苷酸、包含编码本发明截短普鲁兰酶的合成多核苷酸的表达载体以及含有该表达载体的重组宿主细胞。

附图说明

图1为pYF-tsDE载体的示意图，包括：30℃有活性的温度敏感型复制起点和红霉素决定基因(ErmC)，其在大肠杆菌(E.coli)中可以耐受300μg/mL的红霉素且在枯草芽孢杆菌中可以耐受5μg/mL的红霉素，所述载体可用于构建包含编码本发明实施方式的截短普鲁兰酶的合成核酸的重组宿主细胞。

图2为pUC57-KS-erm载体的示意图，从该载体中可以获得本发明实施方式中的pYF-tsDE载体。

图3为显示亲本普鲁兰酶(SEQ ID NO:4)(泳道1)与相应的包含亲本普鲁兰酶N末端1-104个氨基酸残基的缺失的截短普鲁兰酶(SEQ ID NO:8)(泳道2)的大小比较的SDS-PAGE凝胶照片。

发明详述

除非另有规定外，本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。本申请中使用的某些术语，其具有说明书中规定的含义。必须指出的是，除非上下文中另有明确规定外，本文和所附的权利要求所使用的单数形式包括复数形式。

本文所使用的术语“普鲁兰酶”指能够水解多糖中α-1,6糖苷键的酶。普鲁兰酶也被称为脱支酶，因为它们能水解支链多糖(如淀粉)中的α-1,6糖苷键，以产生直链多糖、二糖或单糖组分。例如，普鲁兰酶能降解淀粉，产生直链淀粉聚合物、主要是α-1,4连接的葡萄糖的聚合物。

本文所使用的术语“亲本普鲁兰酶”指天然普鲁兰酶。天然普鲁兰酶优选为细菌普鲁兰酶，包括但不局限于来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、克雷伯氏肺炎菌、嗜热厌氧菌闪光杆菌、嗜温高温放线菌、嗜酸普鲁兰芽胞杆菌、脱支芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的普鲁兰酶。

根据本发明的优选实施方式，天然普鲁兰酶是来源于芽孢杆菌菌株的普鲁兰酶，优选来源于嗜酸普鲁兰芽胞杆菌或脱支芽孢杆菌。从嗜酸普鲁兰芽胞杆菌和脱支芽孢杆菌获得的普鲁兰酶的全长编码序列分别示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3。这些普鲁兰酶的相应的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4。

本文所使用的术语“截短普鲁兰酶”是指非天然产生的亲本普鲁兰酶的变体，其包含相应亲本普鲁兰酶氨基末端94到115个氨基酸残基的N末端缺失，并且保留了催化α-1,6糖苷键的水解的能力。根据本发明的实施方式，N末端缺失在亲本普鲁兰酶氨基酸序列的第一个氨基酸残基上(即氨基酸残基1)开始。

本文所使用的术语“糖化”一般是指将碳水化合物分解为较小的成分的过程，所述成分包括单糖、二糖和多糖。当与普鲁兰酶或者截短普鲁兰酶使用时，术语“糖化”特指碳水化合物中α-1,6糖苷键的水解，特别是支链碳水化合物中的α-1,6糖苷键的水解。

本文所使用的术语“α-1,6糖苷键”是指形成于第一个葡萄糖的C6碳和连接于第二个葡萄糖的异头碳(C1碳)的氧之间的键，其中第二个葡萄糖是α异头物。

本发明涉及来源于亲本普鲁兰酶的截短普鲁兰酶。亲本普鲁兰酶是天然普鲁兰酶，优选为天然细菌普鲁兰酶。根据本发明的实施方式，截短普鲁兰酶包含亲本普鲁兰酶氨基酸序列中94到115个氨基酸残基的N末端缺失，其中，所述缺失在亲本普鲁兰酶的氨基酸残基1上开始。

本发明也涵盖截短普鲁兰酶的变体。根据本发明的实施方式，截短普鲁兰酶的变体具有与截短普鲁兰酶的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，例如95％、96％、97％、98％、99％或者100％的序列相同性。截短普鲁兰酶可以被修饰，例如在一个或多个氨基酸残基上与小分子共价连接。

根据本发明的实施方式，亲本普鲁兰酶的氨基末端的缺失可以是缺失94个氨基酸残基和多达115个氨基酸残基。例如，N末端缺失可以是：从亲本普鲁兰酶的氨基末端开始，缺失氨基酸残基1-115、缺失氨基酸残基1-111、缺失氨基酸残基1-110、缺失氨基酸残基1-104、缺失氨基酸残基1-102、缺失氨基酸残基1-100或者缺失氨基酸残基1-94。

根据本发明的优选实施方式，截短普鲁兰酶包含亲本普鲁兰酶氨基末端94个、102个或104个氨基酸的缺失。

根据本发明的实施方式，亲本普鲁兰酶优选为天然细菌普鲁兰酶。细菌普鲁兰酶包括但不限于来自枯草芽孢杆菌、克雷伯氏肺炎菌、嗜热厌氧菌闪光杆菌、嗜温高温放线菌、嗜酸普鲁兰芽胞杆菌、脱支芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌的普鲁兰酶。

根据本发明的实施方式，亲本普鲁兰酶是从芽孢杆菌中获得的普鲁兰酶，优选为从嗜酸普鲁兰芽胞杆菌或者脱支芽孢杆菌获得的普鲁兰酶，并且更优选为从脱支芽孢杆菌获得的普鲁兰酶。在具体实施方式中，亲本普鲁兰酶是具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的嗜酸普鲁兰芽胞杆菌普鲁兰酶；或者是具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的脱支芽孢杆菌普鲁兰酶。

根据本发明的优选实施方式，截短普鲁兰酶是来源于具有SEQ ID NO:4的天然脱支芽孢杆菌的亲本普鲁兰酶。根据一个优选的实施方式，缺失具有SEQ ID NO:4的亲本普鲁兰酶N末端上的氨基酸残基1到94，从而提供包含SEQ ID NO:6的截短普鲁兰酶。在另一优选实施方式中，缺失具有SEQ ID NO:4的亲本普鲁兰酶N末端上的氨基酸残基1到104，从而提供包含SEQ ID NO:8的截短普鲁兰酶。本发明的这些截短普鲁兰酶可分别通过SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7所示的多核苷酸序列编码。在还另一优选实施方式中，缺失具有SEQ ID NO:4的亲本普鲁兰酶N末端上的氨基酸残基1-102，从而提供包含SEQ ID NO:9的截短普鲁兰酶。

在本发明的具体实施方式中，截短普鲁兰酶由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQID NO:9的氨基酸序列组成。

本发明的截短普鲁兰酶保留了催化α-1,6糖苷键水解的能力。另外，这些截短普鲁兰酶具有与亲本相比改善的性质，例如，提高的糖化效率、在酸性pH、特别是pH值低于4.5时更高的催化活性、以及在更高反应温度条件下更高的催化活性。

根据本发明的实施方式，与相应的亲本普鲁兰酶的催化活性相比，截短普鲁兰酶在pH低于4.5的酸性pH值下具有更高的催化活性，并且在温度高于60℃时、尤其是温度在60℃-64℃范围时具有更高的催化活性。这些改善的性质使得本发明的截短普鲁兰酶更适合于淀粉工业所使用的配方和工艺，至少因为这样的工艺常常在4.5以下的pH值下和/或高于60℃的温度条件下进行。

因此，在另一方面，本发明提供一种水解碳水化合物中α-1,6糖苷键的方法，包括：在适合水解反应的条件下，用分离或纯化的本发明的截短普鲁兰酶接触碳水化合物。本文描述的任何截短普鲁兰酶均能够用于本发明的水解α-1,6糖苷键的方法。

任何具有一个或多个α-1,6糖苷键的碳水化合物均可用于本发明的水解α-1,6糖苷键的方法。具有一个或多个α-1,6糖苷键的碳水化合物的非限制性实例包括淀粉、支链淀粉、右旋糖苷、麦芽糊精、普鲁兰糖、糖原等。

本发明也提供一种催化具有一个或多个α-1,6糖苷键的碳水化合物糖化的方法。根据本发明的实施方式，所述方法包括：在适合糖化的条件下，用分离或纯化的包含亲本普鲁兰酶氨基末端94到115个氨基酸缺失的截短普鲁兰酶接触碳水化合物，其中所述条件包括4.5或更低pH以及60℃或更高温度中的至少一个，并且，其中，亲本普鲁兰酶包含SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

很多具有α-1,6糖苷键的碳水化合物还含有α-1,4糖苷键，比如，举个例子，支链淀粉。“α-1,4糖苷键”是指形成于第一个葡萄糖的C4与第二个葡萄糖的结合于异头碳的氧的键，其中第二个葡萄糖是α异头物。

因此，在还另一个方面，本发明提供一种催化具有一个或多个α-1,6糖苷键的碳水化合物糖化的方法，所述方法包括：在适合糖化的条件下，用葡糖淀粉酶和分离或纯化的包含亲本普鲁兰酶氨基末端94到115个氨基酸缺失的截短普鲁兰酶接触碳水化合物，其中所述条件包括4.5或更低pH以及60℃或更高温度中的至少一个，并且，其中，亲本普鲁兰酶包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

本文描述的任何截短普鲁兰酶均可用于本发明的糖化方法。在优选的实施方式中，截短普鲁兰酶来源于细菌亲本普鲁兰酶，更优选来源于脱支芽孢杆菌亲本普鲁兰酶。在特别优选的实施方式中，本发明的方法中使用的截短普鲁兰酶由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成。

根据本发明的实施方式，与用亲本普鲁兰酶实施的方法相比，糖化方法显示出提高的糖化效率、低于4.5的酸性pH下更高的催化活性、以及高达64℃的温度下更高的催化活性中的至少一个。

任何淀粉酶均可用于本说明书的糖化方法。本文所使用的“淀粉酶”指水解α-1,4糖苷键的糖苷水解酶。淀粉酶的实例包括但不限于葡糖淀粉酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶。淀粉酶优选为葡糖淀粉酶。

将本发明的截短普鲁兰酶与葡糖淀粉酶在糖化反应中联合使用具有从淀粉提供更高纯度的葡萄糖和麦芽糖浆的优势。此外，这样的糖化反应允许使用更低浓度的底物，提高转化效率，且在更高的温度和/或酸性pH值下进行时也能有更高的催化活性，所述条件与工业方法中常用于分解淀粉的条件一致。

利用本发明的截短普鲁兰酶，可在适合水解α-1,6糖苷键的任何温度和pH下进行糖化方法和/或水解α-1,6糖苷键的方法。例如，糖化反应可在60℃至64℃之间提高的温度下进行，比如60℃、61℃、62℃、63℃或64℃。糖化和水解反应也可在4.0至5.5范围的酸性pH值下进行，例如pH4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、5.0或5.5。

在一个具体的实施方式中，糖化的条件包括4.0的pH。

在另一个具体的实施方式中，糖化的条件包括60℃的温度。

在还另一具体的实施方式中，糖化的条件包括4.5或更低的pH、以及60℃到64℃的温度。

根据本发明的实施方式，与用相应的亲本普鲁兰酶进行的相同反应相比，用本发明的截短普鲁兰酶进行的糖化反应表现出提高的糖化效率、酸性pH下更高的催化活性、以及60℃以上的温度下更高的催化活性中的至少一个。糖化反应优选在低于4.5的pH值和/或60℃至64℃之间的温度下表现出更高的水解α-1,6糖苷键的催化效率。

本发明还涉及一种组合物，其包含葡糖淀粉酶以及分离或纯化的包含亲本普鲁兰酶氨基末端94到115个氨基酸缺失的截短普鲁兰酶，其中，亲本普鲁兰酶包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

根据本发明的实施方式，组合物可包含任何本发明描述的截短普鲁兰酶。在优选的实施方式中，组合物包含含有亲本普鲁兰酶氨基末端氨基酸残基1-94、1-102或1-104缺失的截短普鲁兰酶，其中，亲本普鲁兰酶包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在特别优选的实施方式中，组合物包含由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9组成的截短普鲁兰酶。

根据本发明的实施方式，含有本发明的截短普鲁兰酶和葡糖淀粉酶的组合物可用于本文描述的任何糖化方法。

在还另一方面，本发明涉及一种用于催化具有一个或多个α-1,6糖苷键的碳水化合物糖化的系统，其包含碳水化合物、葡糖淀粉酶、以及分离或纯化的包含亲本普鲁兰酶氨基末端94至115个氨基酸残基缺失的截短普鲁兰酶，处于适合糖化的条件下，其中，所述条件包括4.5或更低pH、以及60℃或更高温度中的至少一个，其中，该亲本普鲁兰酶包含SEQID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

本文描述的任何截短普鲁兰酶均可用于本发明的系统。任何适合糖化的条件均可用于本发明的系统。

在该系统的一个具体的实施方式中，截短普鲁兰酶由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或者SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成。

在该系统的另一个具体的实施方式中，适合糖化的条件包括4.0的pH。

在该系统的另一个具体的实施方式中，适合糖化的条件包括60℃的温度。

在该系统的还另一具体的实施方式中，适合糖化的条件包括4.5或更低的pH、以及60℃到64℃的温度。

在还另一方面，本发明提供表达载体以及包含该表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体包含编码本发明截短普鲁兰酶的合成多核苷酸。本发明的表达载体可包含编码本文所描述的任何截短普鲁兰酶的合成多核苷酸。该表达载体还可具有整合至宿主细胞染色体的能力。根据本发明的具体实施方式，表达载体包含具有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的合成多核苷酸。

本发明的表达载体可进一步包括一个天然或合成的启动子序列、一个天然或合成的核糖体结合位点、以及一个天然或合成的终止序列。这些遗传元件也可以与编码本发明的截短普鲁兰酶的合成多核苷酸序列一起组成一个表达组件，其中这样的表达组件组成表达载体的一部分。例如，表达载体可以包含含有下述元件的表达组件：一个启动子序列、一个合成的核糖体结合位点、一个编码本发明截短普鲁兰酶的合成多核苷酸、以及一个合成的终止序列。引导所表达的截短普鲁兰酶分泌的信号序列，也可被包括在表达载体或者表达组件内，并且优选被插入至编码截短普鲁兰酶起始密码子的上游。优选地，表达载体包含引导截短普鲁兰酶分泌的信号序列。

根据本发明的优选实施方式，表达载体适宜在细菌宿主细胞中表达，优选在芽孢杆菌菌株、且更优选在枯草芽孢杆菌中表达。在特别优选的实施方式中，表达载体能够整合到芽孢杆菌菌株的染色体上，并且更优选能够整合到枯草芽孢杆菌的染色体上。鉴于本说明书，可用于将多核苷酸序列整合到宿主细胞染色体中的表达载体、以及构建这种表达载体的方法是本领域普通技术人员所公知的。

根据本发明的实施方式，可将重组宿主细胞基因工程改造以包含一个或多个编码本发明截短普鲁兰酶的合成多核苷酸序列。本领域已知的任何方法均可用于基因工程上改造宿主细胞，以使其包含一个或多个编码本发明截短普鲁兰酶的合成多核苷酸序列，例如，举例来说，染色体整合。能够用于整合步骤的载体是本领域公知的(Sueharu等,1992)，并且，优选包含温度敏感的起始子和筛选标记。这些载体通过坎贝尔机制选择性整合至宿主染色体的特定区域，随后，通过后续孵育期间的同源重组步骤，质粒的筛选标记被移除。

根据本发明的实施方式，重组宿主细胞可为经基因工程改造以使内源性蛋白失活的经改造的重组宿主细胞。经改造的宿主细胞中能被失活的内源性蛋白包括但不限于胞外蛋白酶以及在孢子形成的细菌中影响孢子形成的蛋白质。在将一个或多个编码本发明截短普鲁兰酶的合成多核苷酸导入宿主细胞之前，或在将一个或多个编码本发明截短普鲁兰酶的合成多核苷酸导入宿主细胞之后，可改造重组宿主细胞以使内源性蛋白失活。优选地，在将一个或多个编码本发明截短普鲁兰酶的合成多聚核苷酸导入宿主细胞之前，改造重组宿主细胞以使内源性蛋白失活。

在一个优选的实施方式中，重组宿主细胞是预先经改造以使一些内源性蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌。特别是，枯草芽孢杆菌菌株可经过改造以使胞外蛋白酶失活，例如枯草杆菌蛋白酶(AprE)和中性金属蛋白酶E(NprE)。还可改造枯草芽孢杆菌菌株以灭活在孢子形成中发挥作用的蛋白，例如spoIIAC基因编码的孢子形成特异性Σ-F因子。这些基因工程改造的枯草芽孢杆菌菌株具有提供改善的普鲁兰酶的表达和分泌的优势。

在还另一方面，本发明提供一种生产本发明截短普鲁兰酶的方法。根据本发明的实施方式，该方法包括：在适合截短普鲁兰酶表达的条件下，将包含编码本发明截短普鲁兰酶的多核苷酸序列的重组宿主细胞进行培养，并从重组宿主细胞或者其上清液中获得截短普鲁兰酶。

本文描述的任何重组宿主细胞均能在生产本发明截短普鲁兰酶的方法中使用。可在适合表达截短普鲁兰酶的任何条件下，表达和培养包含至少一个编码本发明截短普鲁兰酶的合成多核苷酸序列的重组宿主细胞。从重组宿主细胞分泌的截短普鲁兰酶可以从细胞培养物中收集，包括从重组宿主细胞或其上清液中收集，收集的方法可以为本领域公知的任何方法，包括但不限于过滤、离心等。

根据本发明的实施方式，高产量地生产本发明的截短普鲁兰酶可以通过下述方法来实现：发酵经过基因工程改造的枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌整合有包含编码截短普鲁兰酶的合成多核苷酸的基因构建物。优选所使用的枯草芽孢杆菌已经去掉了耐抗生素的基因，因此对环境无害并且适合生产可用于为食品工业商业化制备葡萄糖或麦芽糖的截短普鲁兰酶。

不希望受到任何理论的束缚，有人认为，基于晶体结构分析，来源于嗜酸普鲁兰芽胞杆菌的成熟普鲁兰酶的N末端开始的111个氨基酸是无序的(Turkenburg,Brzozowski等2009)。观察到的成熟普鲁兰酶的N末端的不确定结构表明，这个酶能够承受N末端残基的移除而不损伤酶的天然三维结构，这种改变有可能导致更好的构像稳定性和更高的酶活性。不希望再一次受到任何理论的束缚，有人认为，通过末端截短引起结构变动，将是一种研究蛋白热稳定性和酶催化活性的可能改善的快速、高效率且有效的途径，而无须在高温下进行筛选。酶的截短形式也可能有下述优势：具有较低分子量、以及潜在的比能够从淀粉糖化中的微生物获得或生产自所述微生物的天然普鲁兰酶更高的特异性催化活性，这在淀粉工业中是有用的。因此，基于来源于嗜酸普鲁兰芽胞杆菌的成熟普鲁兰酶的晶体结构暗示，人们认为，由于上述原因，这种酶有可能可以承受其N末端氨基酸残基的移除。

本发明的下述实施例进一步阐述了本发明的本质。应当理解，下面的实施例不限制本发明，并且本发明的范围是由所附的权利要求确定的。

实施例

实施例1:pYF-tsDE质粒的构建

pYF-tsDE(参见图1)是一个温度敏感型质粒，是大肠杆菌/枯草芽孢杆菌穿梭质粒。pYF-tsDE质粒包含一个在30℃有活性的温度敏感型复制起点和一个红霉素抗性基因(ErmC)，该抗性基因在大肠杆菌中的抗性是300μg/ml，在枯草芽孢杆菌中的抗性是5μg/ml(Sueharu等,1992)。在37℃的非允许温度时，复制起点失活，质粒被整合到宿主细胞染色体的指定位点，用ErmC进行基因筛选。

pYF-tsDE质粒的构建描述如下：将质粒pUC57-KS-erm(由GenScript提供,图2)用BglII双酶切。纯化由酶切产生的3.8kbp的片段，并用T4连接酶(New England Biolabs)重新连接。克隆的质粒表示为pYF-tsDE。在大肠杆菌TOP10细胞中增殖，并且作为以下所有基因操作的骨架。

实施例2:蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌菌株的构建

使用基因工程改造的杆菌作为生产重组酶的宿主细胞已有报道(Widner等,2000)。这些重组宿主细胞一般包含一个或多个编码用于表达的目标酶序列的核酸构建物。在本发明中，选择枯草芽孢杆菌作为基因操作的受体菌。用核酸构建物转化芽孢杆菌菌株可以通过本领域公知的方法来实现，如感受态细胞转化、电穿孔转化或原生质体转化(Young和Spizizen,1961；Shigekawa和Dower,1988；Chang和Cohen,1979)。

在本发明中，典型地，一个单独的普鲁兰表达框设计为：包含：合成或天然的启动子序列、一个用于有效输出的选自杆菌的信号肽序列、一个合成的核糖体结合位点、一个来源于脱支芽孢杆菌的编码普鲁兰酶的基因、以及一个合成的转录终止子。这样的设计将大大增强宿主菌株中基因的表达水平和普鲁兰酶的分泌量。将编码普鲁兰酶的基因遗传交换至芽孢杆菌细胞染色体上的特定位点可通过质粒介导的单交叉同源重组来实现。

在枯草杆菌中，胞外蛋白酶的活性对异种酶的分泌是不利的。现已证实，在枯草杆菌中，有2种主要的胞外蛋白酶：枯草杆菌蛋白酶E(AprE)和中性金属蛋白酶E(NprE)，发挥了超过85％的胞外蛋白酶活性。此外，能形成孢子的枯草杆菌可以在发酵中形成休眠细胞，使生产效率呈指数降低。编码孢子形成特异性Σ-F因子的spoIIAC基因在引导RNA聚合酶转录特异性中发挥关键作用，并且，spoIIAC的基因表达产物是孢子形成所必需的。

因此，在本发明中，为了获得普鲁兰酶基因表达的结构完整性，采用连续方式的单交叉坎贝尔型机制将上述三个基因灭活。简单来说，pYF-tsDE(如实施例1所描述的那样获得)用BglII消化，用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)处理以防止自连。为了获得各基因敲除，通过PCR从基因组DNA扩增需要敲除的基因侧翼的大约500bp的同源区域。分离到的枯草芽孢杆菌的单克隆经98℃处理5min，直接作为PCR反应的DNA模板，以下所示引物(SEQ ID NO:13-24)由Genscript合成，分别用于PCR以扩增枯草芽孢杆菌Apr、Npr和SpoIIAC基因侧翼的序列：

典型地，扩增反应在如下50uL总体积中进行：98℃预变性8min，随后反应25～30个循环(96℃15s，58℃15s，72℃30s)，最终，72℃2min结束反应。扩增产物经0.8％的琼脂糖凝胶检测并纯化。

采用拼接重叠延伸PCR(SOE)的方法，如下构建每个基因的内部缺失载体：将各自PCR反应得到的每个基因的经纯化的上游和下游序列按1:1摩尔比混合在一起，作为扩增模板。标记为XX-CZ-F1和XX-CZ-R2的引物用于产生每个基因的拼接片段。随后使用来自Genscript的Clone-EZ克隆试剂盒，将该片段克隆到线性化pYF-tsDE载体的BglII位点上。跟相应的完整基因相比，构建好的温度敏感型质粒通常会有400-500bp的内部缺失。这些重组质粒分别被命名为pYF-tsDE-Apr、pYF-tsDE-Npr和pYF-tsDE-SpoII。

不同的完整基因与基因组基因的等位交换通过单交叉同源重组来实现。通过Young描述的改进方法(Young和Spizizen,1961)，将相应的敲除质粒转化到枯草芽孢杆菌感受态细胞中。转化子在红霉素抗性平板上进行筛选，30℃(质粒复制允许温度)孵育。筛选出来的转化子被转接到另外一个红霉素抗性平板上，37℃(质粒复制不允许的温度)进行筛选，使温度敏感型质粒被整合到宿主的基因组上。为了得到在指定位点进行基因替换的菌株，将几个从平板上选出的克隆接种到2YT培养基中，30℃孵育5-7天(每2天更换新鲜的2YT培养基)。对红霉素敏感芽孢杆菌细胞进行PCR筛选，以进行质粒切除和等位基因替换(参见SEQ ID NO:9、10和11)。蛋白酶缺陷型表型通过添加有1％的脱脂牛奶的LB平板上的缩小的降解圈进行验证。

实施例3:产普鲁兰酶的芽孢杆菌菌株的构建

使用与上文pYF-tsDE基本上同样的方法，构建整合质粒。为了将表达框整合到基因组的指定AmyE位点，在普鲁兰酶表达框两侧，邻接基因组AmyE位点上下游序列的800碱基对同源区域。组装了一些首尾相连的自然选择的细菌染色体DNA片段和控制普鲁兰酶基因表达所需的功能性合成序列。

一个典型的普鲁兰酶表达框包括以下元件：一个天然的或合成的启动子序列、一个合成的核糖体结合位点、一个来源于脱支芽孢杆菌的编码截短普鲁兰酶的基因和一个合成的终止序列。这些序列由Genscript合成并可操作地组装在一起。一个从枯草芽孢杆菌中筛选的强的天然信号序列被插入到普鲁兰酶编码基因起始密码子的上游，该信号序列实现从下游编码区域表达的酶的高效分泌。用Clone-EZ克隆试剂盒(Genscript)将完整的普鲁兰酶表达框插入线性化的pYF-tsDE中的BglII位点。得到的温度敏感型整合质粒被命名为pYF-tsINT-puI，并转入到蛋白酶缺陷、不可形成孢子的感受态枯草芽孢杆菌中。

采用基本上如上文描述的方法，将无抗性标记的普鲁兰酶表达框替换AmyE。红色普鲁兰平板上降解圈的产生验证了普鲁兰酶编码基因成功整合至枯草芽孢杆菌染色体。PCR反应进一步验证表达框确实位于受体菌株的AmyE位点。

产普鲁兰酶的工程菌株在-80℃保存。

实施例4:摇瓶发酵中的普鲁兰酶生产

取一个新鲜的含有普鲁兰酶表达框的枯草芽孢杆菌单克隆，接种到20ml培养基中，培养16小时到对数期，该培养基含有麦芽糖浆4.0％、蛋白胨2.0％、酵母提取物0.1％、以及KH2PO4 0.6％。取1.2ml培养液接种到30ml培养基中，该培养基含有麦芽糖浆12.0％、蛋白胨1.0％、酵母提取物1.0％、KH2PO4 0.2％、和MnCl2 0.003％，在往复摇床中120rpm振荡培养3天。分别在24小时、48小时和72小时取样(1ml)，10000g离心1min。将上清液保存，做SDS-PAGE分析，将亲本普鲁兰酶和截短普鲁兰酶在8-16％SDS-PAGE胶中电泳，分别在泳道1和2，如图3所示。截短普鲁兰酶(SEQ ID NO:8)包含亲本普鲁兰酶(SEQ ID NO:4)N末端1-104位氨基酸残基的缺失，缺失从亲本普鲁兰酶的氨基末端开始。SDS-PAGE分析显示，得到的两个蛋白纯度都很高。正如预期的那样，亲本普鲁兰酶表观分子量约为100kD左右，截短普鲁兰酶约为86kD。

使用如下文实施例6中所述的方法，进行普鲁兰酶活性的测定。

实施例5:分步补料发酵工艺中的普鲁兰酶生产

将实施例3中得到的、-80℃冷冻保存的基因工程芽孢杆菌菌株划线于琼脂斜面上，37℃孵育过夜。琼脂斜面如下制备：蛋白胨1.0％、酵母提取物0.5％、NaCl 1.0％和琼脂粉2.0％(Difco)。

将数个新鲜克隆悬浮在盛有50ml培养基的种子摇瓶中，该培养基包含下述成分：麦芽糖浆4.0％、蛋白胨2.0％、酵母提取物0.1％和KH2PO4 0.6％。37℃孵育16小时后，将种子发酵液全部转移至盛有4L培养基的7L不锈钢发酵罐中，该培养基包含下述成分：麦芽糖浆6.0％、蛋白胨1.0％、酵母提取物1.0％、KH2PO4 0.2％和MnCl2 0.003％。培养在37℃进行，搅拌速度设为140g。持续发酵6小时后，通气速率调节为650L/H。然后用5.0％磷酸控制发酵pH在5.7±0.2。在前18小时以0.5L/18小时的速率、在剩下的时间以1L/18小时的速率向培养液中不断加入确定组成的无菌培养基(麦芽糖浆48％、蛋白胨6.0％、酵母提取物8.0％)。发酵在补料大约29小时后终止。收集发酵罐中所有液体培养基，并以8000g在4℃离心30分钟，测定上清液的普鲁兰酶活性。

实施例6:普鲁兰酶活力测定

普鲁兰酶活力测定用的是百斯杰普鲁兰酶活力(BPU)。1个BPU单位的定义：在pH4.5、60℃条件下，1分钟内从普鲁兰糖中产生360μg还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量。

简单的说，将1ml适当稀释的普鲁兰酶样品与1ml 0.5％普鲁兰糖混合，在60℃温浴30分钟，然后，加入3ml的3,5-二硝基水杨酸(DNS)溶液，将样品煮沸7分钟。使样品冷却，然后加入10ml水混匀。产生的还原性糖用Somogyi-Nelson法来测定(Somogyi等,1944)。

实施例7:截短普鲁兰酶的配方和应用

以下所示结果是基于SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示的截短普鲁兰酶，后文中分别称为“Td-A”和“Td-D”。这两个截短普鲁兰酶缺失了SEQ ID NO:4所示的亲本普鲁兰酶氨基末端1-94位氨基酸残基或者1-104位氨基酸残基。

除另外说明外，所使用的单位定义如下：

BGU:葡糖淀粉酶的活力测定用的是百斯杰葡糖淀粉酶单位。一个BGU被定义为在40℃、pH4.6的条件下，每小时从可溶性淀粉中产生200mg葡萄糖所需的酶量。

BPU:普鲁兰酶活力测定用的是百斯杰普鲁兰酶单位。1个BPU单位被定义为在pH4.5、60℃条件下，1分钟内从普鲁兰糖中释放360μg葡萄糖等价还原糖所需的酶量。

gDS:每克干物质

从枯草芽孢杆菌细胞中表达并从中分离获得的普鲁兰酶首先用玉米麦芽糊精溶液进行第一轮糖化测试，该溶液由31％干物质(DS)制成并充分混匀。使用HCl调节pH至4.3。反应在200ml反应体积中进行。分别以0.300、0.250和0.150BPU/gDS的剂量(来自自来水制备的稀释原液)，将普鲁兰酶加入至葡糖淀粉酶溶液(固定浓度0.225BGU/gDS)。亲本普鲁兰酶(0.300BPU/gDS)加入另一个摇瓶作为对照。反应分别在60℃进行24、40和48小时。收集样品并通过0.22μm膜过滤，经高达100℃加热使酶失活，用于HPLC分析。结果总结于下面的表1。

表1:在pH4.3时，从使用截短普鲁兰酶和相应的亲本普鲁兰酶的糖化反应获得的葡萄糖产量

结果显示，在0.300BPU/gDS剂量情况下，亲本普鲁兰酶24小时的葡萄糖产量(94.5％)高于单独用葡糖淀粉酶处理所获得的葡萄糖产量(90.9％)，这一结果确认了普鲁兰酶在糖化过程中的有利影响。在同样的酶剂量下(0.300BPU/gDS)，与亲本酶的葡萄糖产量(94.5-96.4％)相比，截短普鲁兰酶保持甚至增加了葡萄糖产量(95.6-96.5％)，这表明普鲁兰酶能够耐受N末端残基的移除而不会影响酶的活力。重要的是，当降低剂量时(降低至0.150BPU/gDS)，截短普鲁兰酶可以在反应开始的24小时内保持同等的葡萄糖产量，并且活力在延长至48小时的反应时间内也得以维持。此外，在开始反应的24小时内，截短普鲁兰酶催化的糖化速率要高于亲本普鲁兰酶(数据未列出)。综上所述，这些发现证明，普鲁兰酶N末端残基的移除(缺失从N末端第一个氨基酸残基开始)造成了更好的构象稳定性和更高的酶活力。

其次，通过在低pH下进行糖化实验，测定截短普鲁兰酶对pH的耐受性。具体地，糖化反应在除了pH值为4.0以外的上述条件下进行。结果示于下面的表2。

表2:在pH4.0时，从使用截短普鲁兰酶和相应的亲本普鲁兰酶的糖化反应获得的葡萄糖产量

如表2中的结果所示，在pH4.0，在开始反应的24小时内，截短普鲁兰酶催化的糖化反应产生的葡萄糖产量(95.8％和95.6％)高于亲本普鲁兰酶(92.8％)，并且维持了48小时。特别是，亲本普鲁兰酶没有达到淀粉工业中所必需的葡萄糖产量最小限度的百分比(96％)，即使反应时间延长至48小时。与之相反，截短普鲁兰酶在4.0的酸性pH条件下显示出更高的催化活力。在反应时间为40小时时，从截短普鲁兰酶获得的最终的葡萄糖产量达到96.5％和96.4％(表2)。重复试验得到了类似的结果(数据未列出)。

另外，还测定了截短普鲁兰酶的热稳定性和耐热性。糖化反应分别在60℃、62℃和64℃进行，这是淀粉工业中常用的几个温度。结果示于下面的表3。

表3:在不同温度下，从使用截短普鲁兰酶和相应的亲本普鲁兰酶的糖化反应获得的葡萄糖产量

正如预期的那样，在较高的温度64℃下，亲本普鲁兰酶在反应开始的24小时内催化糖化反应的能力降低(表3)。与之相反，即使在高达64℃的温度下，截短普鲁兰酶也维持了明显较高的催化能力，这说明将亲本普鲁兰酶N末端截短获得了对热稳定性和耐热性的积极影响(表3)。

第三个截短普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中表达和分离，并且，在更苛刻的条件下，将这第三个截短普鲁兰酶的活性与上述表征的两个截短普鲁兰酶进行比较。这第三个普鲁兰酶称为Td-C，序列为SEQ ID NO:9，具有SEQ ID NO:4所示的亲本普鲁兰酶氨基末端1-102位氨基酸残基的缺失。

应用下述更为苛刻的测试条件：玉米麦芽糊精溶液32％干物质(DS)，充分混匀，使用HCl调节pH至4.0。反应在200ml的反应体积中进行。截短普鲁兰酶(Td-C、Td-A和Td-D)按0.27BPU/gDS的剂量(来自自来水制备的稀释原液)加入至葡糖淀粉酶溶液中。溶液中葡糖淀粉酶的浓度固定在0.225BGU/gDS。反应在60℃分别进行24小时、40小时和48小时。随后，收集样品并通过0.22um膜过滤，经高达100℃加热使酶灭活，用于HPLC分析。结果总结于下面的表4。

表4:在pH4.0时，从使用截短普鲁兰酶的糖化反应获得的葡萄糖产量

如表4结果所示，在更为苛刻的条件下，在40小时的反应时间结束以后，各截短普鲁兰酶获得了相似的葡萄糖产量。在开始的24小时反应时间内，与截短普鲁兰酶Td-C(94.9％)相比，截短普鲁兰酶Td-A和Td-D表现出稍快的糖化速率和稍高的葡萄糖产量(95.4％和95.1％)。但进行检测的三个截短普鲁兰酶的葡萄糖产量都是类似的。

综上所述，上述结果表明，本发明的截短普鲁兰酶具有优越的特性，这些特性对于追求不牺牲葡萄糖产量而在更短的反应时间内(例如36小时或更短)、在更低的pH或更高的温度条件下进行糖化反应的葡萄糖生产商而言是令人满意的。具体而言，这些结果表明，与亲本普鲁兰酶的稳定性相比，在同样的温度和pH条件下，本发明的截短普鲁兰酶在低于pH4.5(包括低至pH4.0)的pH值时，具有改善的稳定性，并且在60～64℃的提高温度下具有改善的稳定性。

此外，截短普鲁兰酶具有减小的分子量，这对于更高的特定活力(活力/单位重量)是有益的。因此，就重量而言，这些截短普鲁兰酶在糖化过程中可以用更少的量而不牺牲活性。换句话说，本发明提供更低分子量的普鲁兰酶，在催化α-1,4糖苷键的水解时，其即便不具有改善的活性，也是具有同等的活性的，这使得本发明的截短普鲁兰酶用于淀粉工业尤其有利。

最后，还测试了截短普鲁兰酶与包含大麦β-淀粉酶的酶组合物(购自Genencor,1230DP/g)在糖化反应中的表现，这是普鲁兰酶在麦芽糖生产工业中的一项重要应用。简而言之，将配制成31％干重(DS)的麦芽糊精溶液混合均匀，然后用HCl调节pH至5.2。将普鲁兰酶和β-淀粉酶分别以1.000BPU/gDS和1.23DP/gDS的剂量加入至上述麦芽糊精溶液中(200mL)。在盛有麦芽糊精(31％DS,200mL)的另一个摇瓶中仅加入β-淀粉酶(1.23DP/gDS)，作为对照。该200mL反应体积在60℃保持24小时。然后，收集样品并用0.22μm的膜过滤，经高达100℃加热15min使酶失活，随后用于进行HPLC分析。结果示于下面的表5。

表5:用于麦芽糖生产的截短普鲁兰酶和亲本普鲁兰酶的麦芽糖产量

如表5中的结果所示，与亲本普鲁兰酶相比，截短普鲁兰酶在同样的反应条件下表现更好。正如预期的那样，使用亲本酶的处理中的麦芽糖产量(73.3％)比仅使用β-淀粉酶的处理中的麦芽糖产量(61.9％)高。截短普鲁兰酶提供明显比亲本普鲁兰酶高的麦芽糖产量(75.9％)，这说明截短型具有改善的催化活性。

综上所述，上述实验结果表明，与亲本酶相比，本发明的截短普鲁兰酶具有提高的pH耐受性、提高的热稳定性和提高的耐热性。因此，本发明的截短普鲁兰酶具有用于碳水化合物糖化方法的潜能，尤其用于淀粉工业中。

本领域技术人员能够理解，可以对上面描述的实施方式进行更改而不脱离本发明的广泛的发明构思。因此，应当理解，本发明不限于所公开的具体实施方式，其还包括在所附的权利要求所确定的本发明的精神和范围内进行的更改。

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gattctactt cgactaaagt tattgttcat tatcatcgtt ttgattccaa ctatacgaat 60

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tcattagggc atgtaatggg taatgttcaa gtaccggcta taagtacgct tattctcaaa 2760

caataa 2766

<210> 2

<211> 921

<212> PRT

<213> 嗜酸普鲁兰芽胞杆菌（Bacillus acidopullulyticus）

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<212> DNA

<213> 脱支芽孢杆菌（Bacillus deramificans）

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agcaaaggaa atgaggtgtg gcttgtagaa ggaaacagcc aaatttttta taatgaaaaa 300

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ctttatgaca gtgcaacggg ttctgtaaca aaaatcgtac ctatgacggc atcgggccat 1080

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accaacggat caggtactgg aaatgaaatt gcagccgaaa ggccaatggt tcaaaaattt 1800

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<210> 4

<211> 928

<212> PRT

<213> 脱支芽孢杆菌（Bacillus deramificans）

<400> 4

Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile Ile Val His Tyr Phe Arg Pro Ala Gly

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Asp Tyr Gln Pro Trp Ser Leu Trp Met Trp Pro Lys Asp Gly Gly Gly

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Ser Lys Gly Asn Glu Val Trp Leu Val Glu Gly Asn Ser Gln Ile Phe

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Tyr Asn Glu Lys Asp Ala Glu Asp Ala Ala Lys Pro Ala Val Ser Asn

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Ala Tyr Leu Asp Ala Ser Asn Gln Val Leu Val Lys Leu Ser Gln Pro

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<213> 脱支芽孢杆菌（Bacillus deramificans）

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attttttata atgaaaaaga tgctgaggat gcagctaaac ccgctgtaag caacgcttat 60

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acctttgcca cgcaaatctc tgacttcgat aaaattgtac cagaatatta ttaccgtacg 1440

gatgatgcag gtaattatac caacggatca ggtactggaa atgaaattgc agccgaaagg 1500

ccaatggttc aaaaatttat tattgattcc cttaagtatt gggtcaatga gtatcatatt 1560

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gatgcggtca atgagtttga ttggagcagg aaagctcaat atccagatgt tttcaactat 2160

tatagcgggc taatccacct tcgtcttgat cacccagcct tccgcatgac gacagctaat 2220

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<213> 脱支芽孢杆菌（Bacillus deramificans）

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Ala Ala Glu Arg Pro Met Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser Leu Lys

500 505 510

Tyr Trp Val Asn Glu Tyr His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met

515 520 525

Ala Leu Leu Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu Leu His

530 535 540

Ala Ile Asn Pro Gly Ile Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly

545 550 555 560

Thr Ser Ala Leu Pro Asp Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys

565 570 575

Gly Met Gly Val Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp

580 585 590

Gly Asn Val Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr

595 600 605

Gly Leu Thr Asp Ala Ile Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp

610 615 620

Phe Thr Ser Ser Pro Gly Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser His Asp

625 630 635 640

Asn Tyr Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp Ser

645 650 655

Glu Ala Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Met

660 665 670

Thr Ser Gln Gly Val Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg

675 680 685

Thr Lys Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Ala Val Asn

690 695 700

Glu Phe Asp Trp Ser Arg Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr

705 710 715 720

Tyr Ser Gly Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met

725 730 735

Thr Thr Ala Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro

740 745 750

Glu Asn Thr Val Ala Tyr Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys Asp Lys

755 760 765

Trp Gly Asn Ile Ile Val Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Val Ala Thr

770 775 780

Ile Asn Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys

785 790 795 800

Val Gly Glu Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro

805 810 815

Gly Ile Ser Met Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp His Gly

820 825 830

Lys Lys

<210> 7

<211> 2475

<212> DNA

<213> 脱支芽孢杆菌（Bacillus deramificans）

<400> 7

gcagctaaac ccgctgtaag caacgcttat ttagatgctt caaaccaggt gctggttaaa 60

cttagccagc cgttaactct tggggaaggc gcaagcggct ttacggttca tgacgacaca 120

gcaaataagg atattccagt gacatctgtg aaggatgcaa gtcttggtca agatgtaacc 180

gctgttttgg caggtacctt ccaacatatt tttggaggtt ccgattgggc acctgataat 240

cacagtactt tattaaaaaa ggtgactaac aatctctatc aattctcagg agatcttcct 300

gaaggaaact accaatataa agtggcttta aatgatagct ggaataatcc gagttaccca 360

tctgacaaca ttaatttaac agtccctgcc ggcggtgcac acgtcacttt ttcgtatatt 420

ccgtccactc atgcagtcta tgacacaatt aataatccta atgcggattt acaagtagaa 480

agcggggtta aaacggatct cgtgacggtt actctagggg aagatccaga tgtgagccat 540

actctgtcca ttcaaacaga tggctatcag gcaaagcagg tgatacctcg taatgtgctt 600

aattcatcac agtactacta ttcaggagat gatcttggga atacctatac acagaaagca 660

acaaccttta aagtctgggc accaacttct actcaagtaa atgttcttct ttatgacagt 720

gcaacgggtt ctgtaacaaa aatcgtacct atgacggcat cgggccatgg tgtgtgggaa 780

gcaacggtta atcaaaacct tgaaaattgg tattacatgt atgaggtaac aggccaaggc 840

tctacccgaa cggctgttga tccttatgca actgcgattg caccaaatgg aacgagaggc 900

atgattgtgg acctggctaa aacagatcct gctggctgga acagtgataa acatattacg 960

ccaaagaata tagaagatga ggtcatctat gaaatggatg tccgtgactt ttccattgac 1020

cctaattcgg gtatgaaaaa taaagggaag tatttggctc ttacagaaaa aggaacaaag 1080

ggccctgaca acgtaaagac ggggatagat tccttaaaac aacttgggat tactcatgtt 1140

cagcttatgc ctgttttcgc atctaacagt gtcgatgaaa ctgatccaac ccaagataat 1200

tggggttatg accctcgcaa ctatgatgtt cctgaagggc agtatgctac aaatgcgaat 1260

ggtaatgctc gtataaaaga gtttaaggaa atggttcttt cactccatcg tgaacacatt 1320

ggggttaaca tggatgttgt ctataatcat acctttgcca cgcaaatctc tgacttcgat 1380

aaaattgtac cagaatatta ttaccgtacg gatgatgcag gtaattatac caacggatca 1440

ggtactggaa atgaaattgc agccgaaagg ccaatggttc aaaaatttat tattgattcc 1500

cttaagtatt gggtcaatga gtatcatatt gacggcttcc gttttgactt aatggcgctg 1560

cttggaaaag acacgatgtc caaagctgcc tcggagcttc atgctattaa tccaggaatt 1620

gcactttacg gtgagccatg gacgggtgga acctctgcac tgccagatga tcagcttctg 1680

acaaaaggag ctcaaaaagg catgggagta gcggtgttta atgacaattt acgaaacgcg 1740

ttggacggca atgtctttga ttcttccgct caaggttttg cgacaggtgc aacaggctta 1800

actgatgcaa ttaagaatgg cgttgagggg agtattaatg actttacctc ttcaccaggt 1860

gagacaatta actatgtcac aagtcatgat aactacaccc tttgggacaa aatagcccta 1920

agcaatccta atgattccga agcggatcgg attaaaatgg atgaactcgc acaagcagtt 1980

gttatgacct cacaaggcgt tccattcatg caaggcgggg aagaaatgct tcgtacaaaa 2040

ggcggcaacg acaatagtta taatgcaggc gatgcggtca atgagtttga ttggagcagg 2100

aaagctcaat atccagatgt tttcaactat tatagcgggc taatccacct tcgtcttgat 2160

cacccagcct tccgcatgac gacagctaat gaaatcaata gccacctcca attcctaaat 2220

agtccagaga acacagtggc ctatgaatta actgatcatg ttaataaaga caaatgggga 2280

aatatcattg ttgtttataa cccaaataaa actgtagcaa ccatcaattt gccgagcggg 2340

aaatgggcaa tcaatgctac gagcggtaag gtaggagaat ccacccttgg tcaagcagag 2400

ggaagtgtcc aagtaccagg tatatctatg atgatccttc atcaagaggt aagcccagac 2460

cacggtaaaa agtaa 2475

<210> 8

<211> 824

<212> PRT

<213> 脱支芽孢杆菌（Bacillus deramificans）

<400> 8

Ala Ala Lys Pro Ala Val Ser Asn Ala Tyr Leu Asp Ala Ser Asn Gln

1 5 10 15

Val Leu Val Lys Leu Ser Gln Pro Leu Thr Leu Gly Glu Gly Ala Ser

20 25 30

Gly Phe Thr Val His Asp Asp Thr Ala Asn Lys Asp Ile Pro Val Thr

35 40 45

Ser Val Lys Asp Ala Ser Leu Gly Gln Asp Val Thr Ala Val Leu Ala

50 55 60

Gly Thr Phe Gln His Ile Phe Gly Gly Ser Asp Trp Ala Pro Asp Asn

65 70 75 80

His Ser Thr Leu Leu Lys Lys Val Thr Asn Asn Leu Tyr Gln Phe Ser

85 90 95

Gly Asp Leu Pro Glu Gly Asn Tyr Gln Tyr Lys Val Ala Leu Asn Asp

100 105 110

Ser Trp Asn Asn Pro Ser Tyr Pro Ser Asp Asn Ile Asn Leu Thr Val

115 120 125

Pro Ala Gly Gly Ala His Val Thr Phe Ser Tyr Ile Pro Ser Thr His

130 135 140

Ala Val Tyr Asp Thr Ile Asn Asn Pro Asn Ala Asp Leu Gln Val Glu

145 150 155 160

Ser Gly Val Lys Thr Asp Leu Val Thr Val Thr Leu Gly Glu Asp Pro

165 170 175

Asp Val Ser His Thr Leu Ser Ile Gln Thr Asp Gly Tyr Gln Ala Lys

180 185 190

Gln Val Ile Pro Arg Asn Val Leu Asn Ser Ser Gln Tyr Tyr Tyr Ser

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210 215 220

Val Trp Ala Pro Thr Ser Thr Gln Val Asn Val Leu Leu Tyr Asp Ser

225 230 235 240

Ala Thr Gly Ser Val Thr Lys Ile Val Pro Met Thr Ala Ser Gly His

245 250 255

Gly Val Trp Glu Ala Thr Val Asn Gln Asn Leu Glu Asn Trp Tyr Tyr

260 265 270

Met Tyr Glu Val Thr Gly Gln Gly Ser Thr Arg Thr Ala Val Asp Pro

275 280 285

Tyr Ala Thr Ala Ile Ala Pro Asn Gly Thr Arg Gly Met Ile Val Asp

290 295 300

Leu Ala Lys Thr Asp Pro Ala Gly Trp Asn Ser Asp Lys His Ile Thr

305 310 315 320

Pro Lys Asn Ile Glu Asp Glu Val Ile Tyr Glu Met Asp Val Arg Asp

325 330 335

Phe Ser Ile Asp Pro Asn Ser Gly Met Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu

340 345 350

Ala Leu Thr Glu Lys Gly Thr Lys Gly Pro Asp Asn Val Lys Thr Gly

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Ile Asp Ser Leu Lys Gln Leu Gly Ile Thr His Val Gln Leu Met Pro

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Val Phe Ala Ser Asn Ser Val Asp Glu Thr Asp Pro Thr Gln Asp Asn

385 390 395 400

Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr Asp Val Pro Glu Gly Gln Tyr Ala

405 410 415

Thr Asn Ala Asn Gly Asn Ala Arg Ile Lys Glu Phe Lys Glu Met Val

420 425 430

Leu Ser Leu His Arg Glu His Ile Gly Val Asn Met Asp Val Val Tyr

435 440 445

Asn His Thr Phe Ala Thr Gln Ile Ser Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro

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Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Asn Gly Ser

465 470 475 480

Gly Thr Gly Asn Glu Ile Ala Ala Glu Arg Pro Met Val Gln Lys Phe

485 490 495

Ile Ile Asp Ser Leu Lys Tyr Trp Val Asn Glu Tyr His Ile Asp Gly

500 505 510

Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu Leu Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys

515 520 525

Ala Ala Ser Glu Leu His Ala Ile Asn Pro Gly Ile Ala Leu Tyr Gly

530 535 540

Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser Ala Leu Pro Asp Asp Gln Leu Leu

545 550 555 560

Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly Met Gly Val Ala Val Phe Asn Asp Asn

565 570 575

Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn Val Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly

580 585 590

Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu Thr Asp Ala Ile Lys Asn Gly Val

595 600 605

Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr Ser Ser Pro Gly Glu Thr Ile Asn

610 615 620

Tyr Val Thr Ser His Asp Asn Tyr Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Leu

625 630 635 640

Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu

645 650 655

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660 665 670

Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn

675 680 685

Ala Gly Asp Ala Val Asn Glu Phe Asp Trp Ser Arg Lys Ala Gln Tyr

690 695 700

Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser Gly Leu Ile His Leu Arg Leu Asp

705 710 715 720

His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr Ala Asn Glu Ile Asn Ser His Leu

725 730 735

Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn Thr Val Ala Tyr Glu Leu Thr Asp

740 745 750

His Val Asn Lys Asp Lys Trp Gly Asn Ile Ile Val Val Tyr Asn Pro

755 760 765

Asn Lys Thr Val Ala Thr Ile Asn Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala Ile

770 775 780

Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly Glu Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu

785 790 795 800

Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile Ser Met Met Ile Leu His Gln Glu

805 810 815

Val Ser Pro Asp His Gly Lys Lys

820

<210> 9

<211> 826

<212> PRT

<213> 脱支芽孢杆菌（Bacillus deramificans）

<400> 9

Glu Asp Ala Ala Lys Pro Ala Val Ser Asn Ala Tyr Leu Asp Ala Ser

1 5 10 15

Asn Gln Val Leu Val Lys Leu Ser Gln Pro Leu Thr Leu Gly Glu Gly

20 25 30

Ala Ser Gly Phe Thr Val His Asp Asp Thr Ala Asn Lys Asp Ile Pro

35 40 45

Val Thr Ser Val Lys Asp Ala Ser Leu Gly Gln Asp Val Thr Ala Val

50 55 60

Leu Ala Gly Thr Phe Gln His Ile Phe Gly Gly Ser Asp Trp Ala Pro

65 70 75 80

Asp Asn His Ser Thr Leu Leu Lys Lys Val Thr Asn Asn Leu Tyr Gln

85 90 95

Phe Ser Gly Asp Leu Pro Glu Gly Asn Tyr Gln Tyr Lys Val Ala Leu

100 105 110

Asn Asp Ser Trp Asn Asn Pro Ser Tyr Pro Ser Asp Asn Ile Asn Leu

115 120 125

Thr Val Pro Ala Gly Gly Ala His Val Thr Phe Ser Tyr Ile Pro Ser

130 135 140

Thr His Ala Val Tyr Asp Thr Ile Asn Asn Pro Asn Ala Asp Leu Gln

145 150 155 160

Val Glu Ser Gly Val Lys Thr Asp Leu Val Thr Val Thr Leu Gly Glu

165 170 175

Asp Pro Asp Val Ser His Thr Leu Ser Ile Gln Thr Asp Gly Tyr Gln

180 185 190

Ala Lys Gln Val Ile Pro Arg Asn Val Leu Asn Ser Ser Gln Tyr Tyr

195 200 205

Tyr Ser Gly Asp Asp Leu Gly Asn Thr Tyr Thr Gln Lys Ala Thr Thr

210 215 220

Phe Lys Val Trp Ala Pro Thr Ser Thr Gln Val Asn Val Leu Leu Tyr

225 230 235 240

Asp Ser Ala Thr Gly Ser Val Thr Lys Ile Val Pro Met Thr Ala Ser

245 250 255

Gly His Gly Val Trp Glu Ala Thr Val Asn Gln Asn Leu Glu Asn Trp

260 265 270

Tyr Tyr Met Tyr Glu Val Thr Gly Gln Gly Ser Thr Arg Thr Ala Val

275 280 285

Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Ile Ala Pro Asn Gly Thr Arg Gly Met Ile

290 295 300

Val Asp Leu Ala Lys Thr Asp Pro Ala Gly Trp Asn Ser Asp Lys His

305 310 315 320

Ile Thr Pro Lys Asn Ile Glu Asp Glu Val Ile Tyr Glu Met Asp Val

325 330 335

Arg Asp Phe Ser Ile Asp Pro Asn Ser Gly Met Lys Asn Lys Gly Lys

340 345 350

Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys Gly Thr Lys Gly Pro Asp Asn Val Lys

355 360 365

Thr Gly Ile Asp Ser Leu Lys Gln Leu Gly Ile Thr His Val Gln Leu

370 375 380

Met Pro Val Phe Ala Ser Asn Ser Val Asp Glu Thr Asp Pro Thr Gln

385 390 395 400

Asp Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr Asp Val Pro Glu Gly Gln

405 410 415

Tyr Ala Thr Asn Ala Asn Gly Asn Ala Arg Ile Lys Glu Phe Lys Glu

420 425 430

Met Val Leu Ser Leu His Arg Glu His Ile Gly Val Asn Met Asp Val

435 440 445

Val Tyr Asn His Thr Phe Ala Thr Gln Ile Ser Asp Phe Asp Lys Ile

450 455 460

Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Asn

465 470 475 480

Gly Ser Gly Thr Gly Asn Glu Ile Ala Ala Glu Arg Pro Met Val Gln

485 490 495

Lys Phe Ile Ile Asp Ser Leu Lys Tyr Trp Val Asn Glu Tyr His Ile

500 505 510

Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu Leu Gly Lys Asp Thr Met

515 520 525

Ser Lys Ala Ala Ser Glu Leu His Ala Ile Asn Pro Gly Ile Ala Leu

530 535 540

Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser Ala Leu Pro Asp Asp Gln

545 550 555 560

Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly Met Gly Val Ala Val Phe Asn

565 570 575

Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn Val Phe Asp Ser Ser Ala

580 585 590

Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu Thr Asp Ala Ile Lys Asn

595 600 605

Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr Ser Ser Pro Gly Glu Thr

610 615 620

Ile Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Asn Tyr Thr Leu Trp Asp Lys Ile

625 630 635 640

Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala Asp Arg Ile Lys Met Asp

645 650 655

Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Met Thr Ser Gln Gly Val Pro Phe Met

660 665 670

Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys Gly Gly Asn Asp Asn Ser

675 680 685

Tyr Asn Ala Gly Asp Ala Val Asn Glu Phe Asp Trp Ser Arg Lys Ala

690 695 700

Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser Gly Leu Ile His Leu Arg

705 710 715 720

Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr Ala Asn Glu Ile Asn Ser

725 730 735

His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn Thr Val Ala Tyr Glu Leu

740 745 750

Thr Asp His Val Asn Lys Asp Lys Trp Gly Asn Ile Ile Val Val Tyr

755 760 765

Asn Pro Asn Lys Thr Val Ala Thr Ile Asn Leu Pro Ser Gly Lys Trp

770 775 780

Ala Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly Glu Ser Thr Leu Gly Gln

785 790 795 800

Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile Ser Met Met Ile Leu His

805 810 815

Gln Glu Val Ser Pro Asp His Gly Lys Lys

820 825

<210> 10

<211> 1590

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AprE缺失后的序列确认（sequence confirmation after AprE deletion）

<400> 10

ttttttcatt ctatcccttt tctgtaaagt ttatttttca gaatactttt atcatcatgc 60

tttgaaaaaa tatcacgata atatccattg ttctcacgga agcacacgca ggtcatttga 120

acgaattttt tcgacaggaa tttgccggga ctcaggagca tttaacctaa aaaagcatga 180

catttcagca taatgaacat ttactcatgt ctattttcgt tcttttctgt atgaaaatag 240

ttatttcgag tctctacgga aatagcgaga gatgatatac ctaaatagag ataaaatcat 300

ctcaaaaaaa tgggtctact aaaatattat tccatctatt acaataaatt cacagaatag 360

tcttttaagt aagtctactc tgaatttttt taaaaggaga gggtaaagag tgagaagcaa 420

aaaattgtgg atcagcttgt tgtttgcgtt aacgttaatc tttacgatgg cgttcagcaa 480

catgtctgcg caggctgccg gaaaaagcag tacagaaaag aaatacattg tcggatttaa 540

acagacaatg agtgccatga gttccgccaa gaaaaaggat gttatttctg aaaaaggcgg 600

aaaggttcaa aagcaattta agtatgttaa cgcggccgca gcaacattgg atgaaaaagc 660

tgtaaaagaa ttgaaaaaag atccgagcgt tgcatatgtg gaagaagatc atattgcaca 720

tgaatatgcg caatctgttc ctactattgc agtaggtgcg gtaaacagca gcaaccaaag 780

agcttcattc tccagcgcag gttctgagct tgatgtgatg gctcctggcg tgtccatcca 840

aagcacactt cctggaggca cttacggcgc ttataacgga acgtccatgg cgactcctca 900

cgttgccgga gcagcagcgt taattctttc taagcacccg acttggacaa acgcgcaagt 960

ccgtgatcgt ttagaaagca ctgcaacata tcttggaaac tctttctact atggaaaagg 1020

gttaatcaac gtacaagcag ctgcacaata atagtaaaaa gaagcaggtt cctccatacc 1080

tgcttctttt tatttgtcag catcctgatg ttccggcgca ttctcttctt tctccgcatg 1140

ttgaatccgt tccatgatcg acggatggct gcctctgaaa atcttcacaa gcaccggagg 1200

atcaacctgg ctcagccccg tcacggccaa atcctgaaac gttttaacag cggcttctct 1260

gttctctgtc aactcgatcc catactggtc agccttattc tcctgataac gcgagacagc 1320

attagaaaaa ggcgtaaccg caaagctcaa aacagaaaac aaaagcaata acagcggaag 1380

tgccgcaaga tcatgccgcc cttctaaatg aaacatgctg cgggttaggc gaaccgtccg 1440

cttgtaaagc ttatcaatga cataaaatcc ggcgagcgac acgagcaaat agccagccag 1500

accgatgtaa acgtgcttca tgacataatg gcccatttcg tggcccataa taaacagaat 1560

ttctgaatcg tcaagtttgt tcagcgtcgt 1590

<210> 11

<211> 1705

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> spoIIAC缺失后的序列确认（sequence confirmation after spoIIAC deletion）

<400> 11

gctcggggct tggcgttatt ttaggaagat acaagcaaat taagcaaatt ggcggagaaa 60

tggttgtttg cgctatctct cctgcggtga agcgattgtt tgatatgtcg ggtctgttta 120

aaattatccg atttgaacaa tctgaacagc aggcactcct gacactgggg gtggcatcat 180

gaaaaatgaa atgcaccttg agttttctgc cctcagtcag aatgaatcgt tcgcccgtgt 240

gacagttgct tcatttatag ctcagctgga cccgacaatg gatgaactga ctgaaatcaa 300

aacagtcgtg tcagaggctg tcacgaatgc gattatccat ggatatgaag agaactgtga 360

agggaaagtt tacatttcag tgacgctgga agatcatgtc gtatatatga ctattcgtga 420

tgaaggctta ggcattacag atcttgaaga agcccgtcag cctctattta cgactaagcc 480

tgagcttgag cgctctggaa tgggctttac cattatggaa aatttcatgg atgatgtcag 540

tatcgattca tcgcctgaaa tgggaacaac gattcgctta acaaagcact tatcaaaaag 600

caaagcgctt tgtaattaag gagatttgtt atggatgtgg aggttaagaa aaacggcaaa 660

aacgctcagc tgaaggatca tgaagtaaag gaattaatca aacaaagcca aaatggcgac 720

cagcaggcaa gagacctcct catagaaaaa aacatgcgtc ttgtttggtc tgtcgtacag 780

cggtttttaa acagaggata tgagcctgac gatctcttcc agatcggctg catcgggcga 840

agaaaaatgg tttgacaaaa ttgcgctgaa agaagcgatc agcgatttgg aggaaaggga 900

aaaactaatc gtctatctca gatattataa agaccagaca cagtccgagg tggctgagcg 960

gctcgggatc tctcaggtgc aggtttccag gcttgaaaag aaaatattaa aacagatcaa 1020

ggttcaaatg gatcatacgg atggctagtc tgcagtgcag gctagctttt ttgtgcaaaa 1080

gcgtggtaat ttatggtctt ttcgagcgga tgaatgagaa caaaatcgaa ccacatacta 1140

catatataac caccgaaaga tggtgatcaa tgatggaacg acgaatattt atccggcttc 1200

gccaccgagt gctggcacat ccaggggata ttattaccgt tggagatgcc gcgcaaatag 1260

aagggcagct tcagctgaaa aagaaacttt cggctatgcc gctttatcag gtgagcgaaa 1320

aagataaaaa tatcgtaatt ctggatatca tacaagtcct cagagccatt catttacaag 1380

acccgacaat tgatgttcaa accgtaggcg gagcagaaac cattgttgaa attcagtatc 1440

gaaagcgaaa tttatcaacg gttctattta tcggtgtctg gctgcttctg tttattggat 1500

cgtgtcttgc catcatgaac tttcatgagg atgtaagcat gagagatgtt catatcgcac 1560

tatatgaaat cataaccgga gagaggaatg actatccata tttgcttcaa atcccataca 1620

gcatcggttt gggactgggg atgatcgtgt tttttaacca catatttaaa aagcgcctaa 1680

atgaagagcc cagcccgctg gaggt 1705

<210> 12

<211> 1596

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NprE缺失后的序列确认（sequence confirmation after NprE deletion）

<400> 12

ttgtctgctt aatataaaat aacgttcgaa atgcaataca taatgactga ataactccaa 60

cacgaacaac aatcctttac ttcttattaa ggcctcattc ggttagacag cggacttttc 120

aaaaagtttc aagatgaaac aaaaatatct catcttcccc ttgatatgta aaaaacataa 180

ctcttgaatg aaccaccaca tgacacttga ctcatcttga tattattcaa caaaaacaaa 240

cacaggacaa tactatcaat tttgtctagt tatgttagtt tttgttgagt attccagaat 300

gctagtttaa tataacaata taaagttttc agtattttca aaaaggggga tttattgtgg 360

gtttaggtaa gaaattgtct gttgctgtcg ctgcttcgtt tatgagttta tcaatcagcc 420

tgccaggtgt tcaggctgct gaaggtcatc agcttaaaga gaatcaaaca aatttcctct 480

ccaaaaacgc gattgcgcaa tcagaactct ctgcaccaaa tgacaaggct gtcaagcagt 540

ttttgaaaaa gaacagcaac atttttaaag gtgacccttc caaaaggctg aagcttgttg 600

aaagcacgac tgatgccctt ggatacaagc actttcgata tgcgcctgtc gttaacggag 660

tgccaattaa agattcgcaa gtgatcgttc acgtcgataa atccgataat gtctatgcgg 720

tcaatggtga attacacaat caatctgctg caaaaacaga taacagccaa aaagtctctt 780

ctgaaaaagc gctggcactc gctttcaaag ctatcggcaa atcaccagac gctgtttcta 840

acggagcggc caaaaacagc aataaagccg aattaaaagc gtaacgatac agaagactgg 900

gacatcggtg aagacattac ggtcagccag cctgctcttc gcagcctgtc caaccctaca 960

aaatacaacc agcctgacaa ttacgccaat taccgaaacc ttccaaacac agatgaaggc 1020

gattatggcg gtgtacacac aaacagcgga attccaaaca aagccgctta caacaccatc 1080

acaaaacttg gtgtatctaa atcacagcaa atctattacc gtgcgttaac aacgtacctc 1140

acgccttctt ccacgttcaa agatgccaag gcagctctca ttcagtctgc ccgtgacctc 1200

tacggctcaa ctgatgccgc taaagttgaa gcagcctgga atgctgttgg attgtaatat 1260

taggaaaagc ctgagatccc tcaggctttt attgttacat atcttgattt ctctctcagc 1320

tgaaacgacg aaaagatgct gccatgagac agaaaaccgc tcctgatttg cataaagagg 1380

gatgcagccg caagtgcgca ttttataaaa gctaatgatt cagtccacat aattgataga 1440

cgaattctgc tacaggtcac gtggctatgt gaaggatcgc gcgtccagtt aagagcaaaa 1500

acattgacaa aaaaatttat ttatgctaaa atttactatt aatatatttg tatgtataat 1560

aagattctcc tggccagggg aatcttattt tttgtg 1596

<210> 13

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pksb-apr_czF1引物序列

<400> 13

ggtatcgata agcttcctgc agatctctca ggagcattta acct 44

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pksb-apr_R1引物序列

<400> 14

gcacctactg caatagtaag gaacagattg cgcat 35

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pksb-apr_F2引物序列

<400> 15

atgcgcaatc tgttccttac tattgcagta ggtgc 35

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pksb-apr_czR2引物序列

<400> 16

aatatggcgg ccgcgaattc agatctctaa tgctgtctcg cgtt 44

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pksb-npr_czF1引物序列

<400> 17

ggtatcgata agcttcctgc agatctcatc ttccccttga t 41

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pksb-npr_R1引物序列

<400> 18

cagtcttctg tatcgttacg cttttaattc ggct 34

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pksb-npr_F2引物序列

<400> 19

agccgaatta aaagcgtaac gatacagaag actg 34

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pksb-npr_czR2引物序列

<400> 20

tatggcggcc gcgaattcag atctcctggc caggagaatc t 41

<210> 21

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pksb-spo_czF1引物序列

<400> 21

ggtatcgata agcttcctgc aggaacaatc tgaacagcag gcactc 46

<210> 22

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pksb-spo_R1引物序列

<400> 22

ttgtcaaacc atttttcttc gcccgatgca gccgatctg 39

<210> 23

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pksb-spo_F2引物序列

<400> 23

cagatcggct gcatcgggcg aagaaaaatg gtttgacaa 39

<210> 24

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pksb-spo_czR2引物序列

<400> 24

atatggcggc cgcgaattca gatctgttca tgatggcaag acac 44

<210> 25

<211> 956

<212> PRT

<213> 脱支芽孢杆菌（Bacillus deramificans）

<220>

<221> misc_feature

<222> (164)..(164)

<223> Xaa可以是任何自然产生的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (619)..(619)

<223> Xaa可以是任何自然产生的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (811)..(811)

<223> Xaa可以是任何自然产生的氨基酸

<400> 25

Met Ala Lys Lys Leu Ile Tyr Val Cys Leu Ser Val Cys Leu Val Leu

1 5 10 15

Thr Trp Ala Phe Asn Val Lys Gly Gln Ser Ala His Ala Asp Gly Asn

20 25 30

Thr Thr Thr Ile Ile Val His Tyr Phe Cys Pro Ala Gly Asp Tyr Gln

35 40 45

Pro Trp Ser Leu Trp Met Trp Pro Lys Asp Gly Gly Gly Ala Glu Tyr

50 55 60

Asp Phe Asn Gln Pro Ala Asp Ser Phe Gly Ala Val Ala Ser Ala Asp

65 70 75 80

Ile Pro Gly Asn Pro Ser Gln Val Gly Ile Ile Val Arg Thr Gln Asp

85 90 95

Trp Thr Lys Asp Val Ser Ala Asp Arg Tyr Ile Asp Leu Ser Lys Gly

100 105 110

Asn Glu Val Trp Leu Val Glu Gly Asn Ser Gln Ile Phe Tyr Asn Glu

115 120 125

Lys Asp Ala Glu Asp Ala Ala Lys Pro Ala Val Ser Asn Ala Tyr Leu

130 135 140

Asp Ala Ser Asn Gln Val Leu Val Lys Leu Ser Gln Pro Leu Thr Leu

145 150 155 160

Gly Glu Gly Xaa Ser Gly Phe Thr Val His Asp Asp Thr Ala Asn Lys

165 170 175

Asp Ile Pro Val Thr Ser Val Lys Asp Ala Ser Leu Gly Gln Asp Val

180 185 190

Thr Ala Val Leu Ala Gly Thr Phe Gln His Ile Phe Gly Gly Ser Asp

195 200 205

Trp Ala Pro Asp Asn His Ser Thr Leu Leu Lys Lys Val Thr Asn Asn

210 215 220

Leu Tyr Gln Phe Ser Gly Asp Leu Pro Glu Gly Asn Tyr Gln Tyr Lys

225 230 235 240

Val Ala Leu Asn Asp Ser Trp Asn Asn Ser Tyr Pro Ser Asp Asn Ile

245 250 255

Asn Leu Thr Val Pro Ala Gly Gly Ala His Val Thr Phe Ser Tyr Ile

260 265 270

Pro Ser Thr His Ala Val Tyr Asp Thr Ile Asn Asn Pro Asn Ala Asp

275 280 285

Leu Gln Val Glu Ser Gly Val Lys Thr Asp Leu Val Thr Val Thr Leu

290 295 300

Gly Glu Asp Pro Asp Val Ser His Thr Leu Ser Ile Gln Thr Asp Gly

305 310 315 320

Tyr Gln Ala Lys Gln Val Ile Pro Arg Asn Val Leu Asn Ser Ser Gln

325 330 335

Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Asp Leu Gly Asn Thr Tyr Thr Gln Lys Ala

340 345 350

Thr Thr Phe Lys Val Trp Ala Pro Thr Ser Thr Gln Val Asn Val Leu

355 360 365

Leu Tyr Asp Ser Ala Thr Gly Ser Val Thr Lys Ile Val Pro Met Thr

370 375 380

Ala Ser Gly His Gly Val Trp Glu Ala Thr Val Asn Gln Asn Leu Glu

385 390 395 400

Asn Trp Tyr Tyr Met Tyr Glu Val Thr Gly Gln Gly Ser Thr Arg Thr

405 410 415

Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Ile Ala Pro Asn Gly Thr Arg Gly

420 425 430

Met Ile Val Asp Leu Ala Lys Thr Asp Pro Ala Gly Trp Asn Ser Asp

435 440 445

Lys His Ile Thr Pro Lys Asn Ile Glu Asp Glu Val Ile Tyr Glu Met

450 455 460

Asp Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Pro Asn Ser Gly Met Lys Asn Lys

465 470 475 480

Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys Gly Thr Lys Gly Pro Asp Asn

485 490 495

Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu Lys Gln Leu Gly Ile Thr His Val

500 505 510

Gln Leu Met Pro Val Phe Ala Ser Asn Ser Val Asp Glu Thr Asp Pro

515 520 525

Thr Gln Asp Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr Asp Val Pro Glu

530 535 540

Gly Gln Tyr Ala Thr Asn Ala Asn Gly Asn Ala Arg Ile Lys Glu Phe

545 550 555 560

Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His Arg Glu His Ile Gly Val Asn Met

565 570 575

Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ala Thr Gln Ile Ser Asp Phe Asp

580 585 590

Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Met Ile Gln Val Ile Ile

595 600 605

Pro Thr Asp Gln Val Leu Glu Met Lys Leu Xaa Ala Glu Arg Pro Met

610 615 620

Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser Leu Lys Tyr Trp Val Asn Glu Tyr

625 630 635 640

His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu Leu Gly Lys Asp

645 650 655

Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu Leu His Ala Ile Asn Pro Gly Ile

660 665 670

Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser Ala Leu Pro Asp

675 680 685

Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly Met Gly Val Ala Val

690 695 700

Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn Val Phe Asp Ser

705 710 715 720

Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu Thr Asp Ala Ile

725 730 735

Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr Ser Ser Pro Gly

740 745 750

Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Asn Tyr Thr Leu Trp Asp

755 760 765

Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala Asp Arg Ile Lys

770 775 780

Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Met Thr Ser Gln Gly Val Pro

785 790 795 800

Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Xaa Lys Gly Gly Asn Asp

805 810 815

Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Ala Val Asn Glu Phe Asp Trp Ser Arg

820 825 830

Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser Gly Leu Ile His

835 840 845

Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr Ala Asn Glu Ile

850 855 860

Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn Thr Val Ala Tyr

865 870 875 880

Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys Asp Lys Trp Gly Asn Ile Ile Val

885 890 895

Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Val Ala Thr Ile Asn Leu Pro Ser Gly

900 905 910

Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly Glu Ser Thr Leu

915 920 925

Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile Ser Met Met Ile

930 935 940

Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp His Gly Lys Lys

945 950 955

Claims

1.一种催化具有一个或多个α-1,6糖苷键的碳水化合物糖化的方法，其特征在于，所述方法包括：在适合糖化的条件下，用分离或纯化的包含亲本普鲁兰酶氨基末端94个氨基酸缺失的截短普鲁兰酶接触所述碳水化合物，其中，所述条件包括4.5或更低的pH、以及60℃或更高的温度中的至少一个，并且，所述分离或纯化的截短普鲁兰酶由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖化的条件包括4.0的pH。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖化的条件包括60℃的温度。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖化的条件包括4.5或更低的pH以及60℃至64℃的温度。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括用葡糖淀粉酶接触所述碳水化合物。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳水化合物选自下组：淀粉、支链淀粉、右旋糖苷、麦芽糊精、普鲁兰糖和糖原。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，与使用亲本普鲁兰酶进行的方法相比，所述方法表现出提高的糖化效率、低于4.5的酸性pH下的更高的催化活性、以及在高达64℃的温度下的更高的催化活性中的至少一个。

8.一种催化具有一个或多个α-1,6糖苷键的碳水化合物糖化的方法，其特征在于，所述方法包括：在适合糖化的条件下，将所述碳水化合物与葡糖淀粉酶和分离或纯化的包含亲本普鲁兰酶氨基末端94个氨基酸缺失的截短普鲁兰酶进行接触，其中，所述条件包括4.5或更低的pH、以及60℃或更高的温度中的至少一个，并且，所述分离或纯化的截短普鲁兰酶由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述糖化的条件包括4.0的pH。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述糖化的条件包括4.5或更低的pH，以及60℃至64℃的温度。

11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述碳水化合物选自下组：淀粉、支链淀粉、右旋糖苷、麦芽糊精、普鲁兰糖和糖原。

12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，与使用亲本普鲁兰酶进行的方法相比，所述方法表现出提高的糖化效率、低于4.5的酸性pH下的更高的催化活性、以及在高达64℃的温度下的更高的催化活性中的至少一个。

13.一种用于催化具有一个或多个α-1,6糖苷键的碳水化合物糖化的系统，其特征在于，包括：将碳水化合物、葡糖淀粉酶、以及分离或纯化的包含亲本普鲁兰酶氨基末端94个氨基酸的缺失的截短普鲁兰酶处于适合糖化的条件下，其中，所述条件包括4.5或更低的pH、以及60℃或更高的温度中的至少一个，其中，所述截短普鲁兰酶由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:6。