CN111560077A

CN111560077A - 一种酶及其在合成普鲁兰多糖中的作用

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Publication number: CN111560077A
Application number: CN202010435722.5A
Authority: CN
Inventors: 池振明; 池哲; 刘光磊; 陈铁军; 姜宏
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2020-05-21
Filing date: 2020-05-21
Publication date: 2020-08-21

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种酶及其在合成普鲁兰多糖中的作用。AGS2不同结构域可以完成从胞内运输普鲁兰多糖前体物到胞外、抓取普鲁兰多糖前体物(α‑1,4‑葡聚糖)、切下麦芽三糖、麦芽三糖连接成普鲁兰多糖和把合成的普鲁兰多糖连接到细胞膜脂类载体上的所有功能。这是首次发现AGS2在普鲁兰多糖合成过程中的关键酶，也是首次发现具有这些特异结构域的多功能酶。该酶的发现有助于深入了解酵母菌合成普鲁兰多糖的具体途径和调控方式，对于通过代谢工程和分子编辑普鲁兰多糖合成及其物理化学性能具有重要的实际意义。从而解决了长期普鲁兰多糖合成途径、有关的关键酶和基因未解决的问题。

Description

一种酶及其在合成普鲁兰多糖中的作用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种酶及其在合成普鲁兰多糖中的作用。

背景技术

普鲁兰多糖主要是由Aureobasidium spp.不同菌株产生的一种线性的胞外葡聚糖，在结构上是由α-(1→6)糖苷键将重复的麦芽三糖单元连接而成，其化学结构如图1所示；这种连接方式使普鲁兰多糖具有较好的结构柔性、水溶性、粘附性、成膜性和易降解性等特点。因此，它在食品、化妆品、生物医药等领域的用途广泛而备受关注。目前普鲁兰多糖是微生物产生的最重要的商品化胞外多糖之一，从上个世纪70年代开始日本的林原公司就已经开始大规模生产，并在全世界大量销售，在市场上Sigma公司销售价格是每公斤2000美元。中国国产的普鲁兰多糖价格为23万人民币/吨，进口价格为25万人民币/吨。尽管在上个世纪60年代，这种普鲁兰多糖结构(式1)就已经鉴定清楚了，但是这种化学结构在Aureobasidium spp.细胞中是如何合成的，有关的酶和基因是什么，至今还不清楚。

现在普遍认为α-磷酸葡萄糖变位酶催化来自糖酵解途径的6-磷酸-葡萄糖转化成1-磷酸-葡萄糖、在UDP-葡萄糖焦磷酸化酶催化下1-磷酸-葡萄糖和UTP起反应形成UDP-葡萄糖，形成的UDP-葡萄糖是合成普鲁兰多糖、海藻糖、糖原和细胞壁葡聚糖的共同前体物。

1982年Catley和McDowell认为来自于UDP-葡萄糖的D-葡萄糖(G)通过磷酸酯键连接到膜的脂类分子(L-P-P)上形成L-P-P-G，来自UDP-葡萄糖的另一分子D-葡萄糖连续连接到L-P-P-G形成L-P-P-G-α-1,6-G和L-P-P-G-α-1,6-G-α-1,4-G，最后这个异潘糖基(isopanosyl)通过聚合作用形成普鲁兰多糖链。

2008年，Duan等人认为在普鲁兰多糖的合成过程中，从葡萄糖转化为普鲁兰多糖需要3个关键酶：α-磷酸葡萄糖变位酶催化6-磷酸-葡萄糖转化成1-磷酸-葡萄糖、在UDP-葡萄糖焦磷酸化酶催化下1-磷酸-葡萄糖和UTP起反应形成UDP-葡萄糖和形成的UDP-葡萄糖在葡萄糖糖基转移酶作用下形成普鲁兰多糖。

在此基础上，2015年Li等人提出了普鲁兰多糖可能的合成路径。首先，UDP-葡萄糖上的葡萄糖基在葡萄糖基转移酶的催化下，转移至细胞膜脂类(Lph)受体上，并通过磷脂键形成Lph-Glu；接着在第二个葡萄糖转移酶的催化下，UDP-葡萄糖上的葡萄糖基转移至Lph-葡萄糖分子上，并通过α-(1,6)糖苷键连接形成异麦芽糖基(Lph-Glu-α-(1,6)-Glu)；接着，在第3个葡萄糖转移酶的催化下重复上述UDP-葡萄糖的葡萄糖基转移过程，通过α-(1,4)糖苷键连接至异麦芽糖基上形成异潘糖基(Lph-Glu-α-(1,6)-Glu-α-(1,4)-Glu)；最后，在普鲁兰多糖合成酶的作用下，异潘糖基作为结构单元聚合形成普鲁兰多糖。

但是上述假设的普鲁兰多糖合成途径没有任何遗传和生化证据。因此，关于普鲁兰的生物合成途径仍在不断的研究中。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种酶及其在合成普鲁兰多糖中的作用，该酶被命名为的α-葡聚糖合成酶2(α-glucan synthase2，简称AGS2)，其中一个结构域Big-5与普鲁兰多糖前体物α-1,4-葡聚糖特异结合，在α-葡聚糖合成酶2的另外一个结构域α-淀粉酶催化下从该普鲁兰多糖前体物上特异切下麦芽三糖，切下的麦芽三糖在α-葡聚糖合成酶2的糖苷转移酶1-糖原合成酶结构域催化下把多个麦芽三糖单位通过α-1,6-糖苷键连接成高分子量的普鲁兰多糖。

本发明提供的酶(AGS2)包含：α-淀粉酶催化结构域、α-1,4-葡聚糖定位结构域、GT1-糖原合成酶结构域和胞外多糖-转糖基结构域。

本发明提供的AGS2酶中至少还包含2个跨膜结构。

本发明提供的AGS2酶中所述α-淀粉酶催化结构域的氨基酸序列包含Asp-X-Glu-Asp序列，所述X由任意2～5个氨基酸组成；

作为优选，所述α-淀粉酶催化结构域包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或包括与SEQ ID NO:1具有至少90％同源性的氨基酸序列。一些具体实施例中，所述α-淀粉酶催化结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述α-淀粉酶催化结构域(SEQ ID NO7所示氨基酸序列的第16到579位)，含有D-X-E-D催化氨基酸、是水解α-1,4-葡聚糖的α-1,4-糖苷键的特异氨基酸，它负责普鲁兰多糖前体物(α-1,4-葡聚糖)分子内α-1,4-糖苷键的水解释放出麦芽三糖亚单位。

本发明提供的AGS2酶中所述α-1,4-葡聚糖定位结构域包含Leu-Gln-Ser序列；

作为优选，所述α-1,4-葡聚糖定位结构域包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或包括与SEQ ID NO:2具有至少90％同源性的氨基酸序列。一些具体实施例中，所述α-1,4-葡聚糖定位结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

AGS2酶中所述α-1,4-葡聚糖定位结构域是细菌免疫球蛋白类的结构域(SEQ IDNO：7所示氨基酸序列的第724到828位)，简称Big-5结构域，该结构域负责把AGS2附着、结合和定位在普鲁兰多糖前体物(α-1,4-葡聚糖)分子链上。

本发明提供的AGS2酶中所述GT1-糖原合成酶结构域包含Lys-Ile-Gly-Gly序列；

作为优选，所述GT1-糖原合成酶结构域包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或包括与SEQ ID NO:3具有至少90％同源性的氨基酸序列。一些具体实施例中，所述GT1-糖原合成酶结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

保守的GT1-糖原合成酶结构域(SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的第1169到1625位)，(含有KIGG催化氨基酸，植物和藻类淀粉合成酶和糖原合成酶催化位点特异氨基酸)，催化释放的麦芽三糖通过α-1,6-糖苷键连接成普鲁兰多糖大分子。

本发明提供的AGS2酶中所述胞外多糖-转糖基结构域包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；或包括与SEQ ID NO:4具有至少90％同源性的氨基酸序列。一些具体实施例中，所述胞外多糖-转糖基结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

保守的胞外多糖_转糖基结构域(SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的第1965到2351位)负责把合成的普鲁兰多糖大分子连接到细胞膜的脂类载体分子上。

通过疏水性分析发现AGS2除了含有上述4个结构域外，还含有2个跨膜结构，其中之一的结构(在AGS2蛋白中间)跨膜一次，另外一个跨膜结构(在AGS2蛋白的羧基端)跨膜11次。

2个所述跨膜结构分别为跨膜结构A和跨膜结构B：

跨膜结构A在包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的位置跨膜1次；

跨膜结构B在包括SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的位置跨膜11次。

本发明获得的AGS2酶中，Big-5结构域、保守的α-淀粉酶催化结构域、保守的GT1-糖原合成酶结构域和保守的胞外多糖_转糖基结构域均朝向细胞外。跨膜11次的跨膜结构负责把胞内合成的普鲁兰多糖前体物(α-1,4-葡聚糖)运输到细胞膜外表面，以便上述的朝向细胞外的各个催化结构域催化合成普鲁兰多糖分子。AGS2酶中，所述Big-5结构域、保守的α-淀粉酶催化结构域、保守的GT1-糖原合成酶结构域和保守的胞外多糖_转糖基结构域的排列顺序不限。本发明中，从N端至C端，依次为，α-淀粉酶催化结构域、Big-5结构域、GT1-糖原合成酶结构域和胞外多糖_转糖基结构域。

一些具体实施例中，本发明提供的AGS2酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

本发明还提供了编码AGS2酶的DNA序列。

一些实施例中，编码AGS2酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

本发明还提供包含编码AGS2酶的DNA序列的表达载体。

本发明还提供了表达所述AGS2酶的宿主细胞。

本发明提供的AGS2酶在合成普鲁兰多糖中的作用。

本发明还提供了一种普鲁兰多糖的制备方法，发酵表达所述AGS2酶的宿主细胞，获得普鲁兰多糖。

本发明提供的另一种普鲁兰多糖的合成方法，以α-1,4-葡聚糖为底物，以AGS2酶催化，获得普鲁兰多糖。

AGS2可以完成从胞内运输普鲁兰多糖前体物到胞外、抓取普鲁兰多糖前体物(α-1,4-葡聚糖)、切下麦芽三糖、麦芽三糖连接成普鲁兰多糖和把合成的普鲁兰多糖连接到细胞膜脂类载体上的所有功能。这是首次发现AGS2在普鲁兰多糖合成过程中的关键作用，也是首次发现具有这些特异结构域的多功能酶。该酶的发现有助于深入了解酵母菌合成普鲁兰多糖的具体途径和调控方式，对于通过代谢工程和分子编辑普鲁兰多糖合成及其物理化学性能具有重要的实际意义。从而解决了长期普鲁兰多糖合成途径、有关的关键酶和基因未解决的问题。

附图说明

图1示普鲁兰多糖新合成途径；

图2示AGS2催化结构域；

图3示AGS2的跨膜结构；

图4示AGS2基因进行敲除载体的构建过程；

图5示扩增得到AGS2基因的5’arm和3’arm片段；Marker为D2000 DNA ladder，从上到下依次是2Kb、1Kb、750bp、500bp、250bp和100bp；

图6示阳性重组菌株(B)在诺尔丝菌素抗性的双层HCS平板上的生长情况，而未转化的P16菌株(A)在该平板上不生长；

图7示P16和不同敲除菌株胞外多糖产量、细胞干重及单位菌体干重产糖量，与P16相比,*P<0.05,**P<0.01；

图8示PCR验证电泳图；Marker为1Kb DNA ladder，从上到下依次是10Kb、8Kb、6Kb、5Kb、4Kb、3Kb、2Kb、1Kb；泳道1代表以原始菌株P16基因组为模板，泳道2代表以敲除菌株AGS2-13基因组为模板；

图9示P16及敲除菌株ΔAGS2-13菌株菌落形态；

图10示野生型菌株P16及敲除菌株ΔAGS2-13菌株的细胞形态；

图11示胞外多糖的纯化；

图12示胞外多糖的酶解产物；其中，1.葡萄糖；2.麦芽三糖；3.P16菌株所产胞外多糖水解产物；4.ΔAGS2-1菌株所产胞外多糖水解产物；5.ΔAGS2-3菌株所产胞外多糖水解产物；6.ΔAGS2-7菌株所产胞外多糖水解产物；7.ΔAGS2-13菌株所产胞外多糖水解产物；8.灭活普鲁兰酶液；

图13示ΔAGS2-13菌株所产胞外多糖核磁共振碳谱分析，13-A为:¹³C谱；13-B为：¹H谱。

具体实施方式

本发明提供了一种酶及其在合成普鲁兰多糖中的作用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中，P16菌株来自中国海洋大学。

所述普兰多糖属于酵母菌合成和分泌的一种胞外多糖，结构上是麦芽三糖通过α-1,6糖苷键连接起来的高分子量线性多糖分子。

本发明提供的α-葡聚糖合成酶是催化麦芽三糖之间形成α-1,6糖苷键糖苷键的酶，简称AGS2。

本发明中，所述结构域是指生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，特别指蛋白质中这样的区域。本发明提供的AGS2酶中，各结构域间通氨基酸序列连接。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例：

1、AGS2基因克隆和分析

用YPD培养基培养高产普鲁兰多糖的产黑色素短梗霉P16菌株(Aureobasidiumpullulans var.melanogenum P16，来自中国海洋大学)，提取基因组DNA，设计特异扩增AGS2基因的引物：

AGS2-F:ATGGCTTGCAAAATGATCAAACTGGCCGC；

AGS2-R:TCAAGGCTTGAACAACTGTTCGTTGCGG。

扩增的AGS2基因碱基序列如SEQ ID NO:8所示。根据该基因的碱基序列，推导出的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。AGS2基因全长7629bp，在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行在线BLAST比对，含有5段内含子，编码2389个氨基酸。推导出的AGS2酶的氨基酸序列比对结果为α-葡聚糖合成酶，与A.melanogenum CBS110374菌株的α-葡聚糖合成酶相似性最高，相似度为88％。在网站http://www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl上对AGS2基因上游序列(240bp)进行启动子预测，结果显示在-115bp至-164bp之间有一段50bp的启动子和在-124bp处有转录起始位点C。在ORF框上游调控区未发现CAAT box和TATA box。5’-HGATAR-3’序列是GATA型转录抑制因子结合位点，在AGS2基因上游-203bp存在1段5’-HGATAR-3’序列，说明该基因的转录会受到氮源的阻遏，大量证据表明普鲁兰多糖的合成会受到氮阻遏。AGS2基因ORF框的上游序列中不存在5′-SYGGRG-3′序列，该序列为Mig1或CreA阻遏蛋白结合位点，说明AGS2基因的转录不会受到葡萄糖的阻遏，这与P16菌株在高碳氮比的培养基中可以大量合成普鲁兰多糖的研究结果相符。

将AGS2基因编码蛋白质的氨基酸序列在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi网站上进行保守结构域预测，预测结果如上述的图2所示。从图2结果可以看出AGS2蛋白含有4个关键的结构域：

1.细菌免疫球蛋白类的结构域，该结构域特有的氨基酸序列是Leu-Gln-Ser；简称Big-5结构域，该结构域负责把AGS2附着、结合和定位在普鲁兰多糖前体物(α-1,4-葡聚糖)分子链上(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)；

2.保守的α-淀粉酶催化结构域(序列如SEQ ID NO:1所示，含有Asp-X-Glu-Asp催化氨基酸，是水解α-1,4-糖苷键的特异氨基酸)，它负责普鲁兰多糖前体物(α-1,4-葡聚糖)分子内α-1,4-糖苷键的水解释放出麦芽三糖亚单位。α-淀粉酶家族是糖苷水解酶(GH)的最大家族，大多数酶作用于淀粉、糖原和相关的寡糖和多糖。这些酶催化α-1,4和α-1,6-葡萄糖苷键的水解，该家族成员相当广泛，包括：α-淀粉酶、麦芽糖基转移酶、环糊精糖转移酶、麦芽糖淀粉酶、新普鲁兰酶、异淀粉酶、1,4-α-D-葡聚糖麦芽糖四氢化酶、4-α-葡萄糖转移酶、寡糖-1,6-葡萄糖苷酶、淀粉蔗糖酶、蔗糖磷酸化酶和麦芽糖转葡糖基酶等。该家族的酶可以水解α-1，4或α-1，6糖苷键和通过转糖基作用形成α-1，4或α-1，6糖苷键(Hochstenbachet al.,1998)；

3.保守的GT1-糖原合成酶结构域(序列如SEQ ID NO:3所示，含有Lys-Ile-Gly-Gly催化氨基酸，是植物和藻类淀粉合成酶和糖原合成酶催化位点特异氨基酸)，催化释放的麦芽三糖通过α-1,6-糖苷键连接成普鲁兰多糖大分子。这一家族包括植物的淀粉合成酶和各种生物体的糖原合成酶。

4.保守的胞外多糖_转糖基结构域(序列如SEQ ID NO:4所示)负责把合成的普鲁兰多糖大分子连接到细胞膜的脂类载体分子上。这类蛋白由两个融合结构域组成，一个是一般低保守性的N端疏水结构域和一个高度保守的C端糖转移酶结构域。

利用http://genome.cbs.dtu.dk/sevices/TMHMM-2.0网站对AGS2蛋白序列进行预测，发现AGS2还含有两个跨膜结构，其中之一的结构跨膜1次(跨膜区域序列如SEQ IDNO:5所示)，另外一个在包括SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的位置跨膜11次(图3)。

跨膜11次的结构中，跨膜区域序列分别为：

1：TrpProLeuTyrAlaTyrLeuLeuAlaPheGlyGlnIleIleAlaValAsnSerHisGlnIle ThrIle；

2：LeuTyrValValAlaSerIleTyrLeuAlaGlySerLeuPheTrpTrpPheMetVal；

3:SerLeuProPheMetPheTyrGlyLeuSerPhePhePheValGlyLeuAlaProTyrGlyMetThrIle；

4:PheTyrAlaPheAlaSerSerSerGlySerLeuTyrPheAlaLeuAsnPheAla；

5:MetIleTyrArgAlaThrValValGlnGlyIleGlnGlnLeuTrpValAlaAlaLeuTrpAlaTrpGly；

6:ValIleLeuAlaIleMetAlaProIleAlaValLeuPheValIleValGlyLeuLeuLeuLeuPheGly；

7:LeuValIleTrpPhePheIleAlaValIleValGlnAsnTyrTrpLeuSerSerLeuValGlyArgAsn；

8:TrpAlaIleValLeuLeuLeuLeuPhePhePheIleValValTrpCysThrAlaLeuTyrIleLeuAla；

9:LeuProTrpGlySerValValGlyGlyAlaIleAlaGlyArgCysLeuTrpLeuTrpLeuGlyValLeu；

10:ValAlaValThrLeuThrAlaAlaGlnValIleGlySerValAlaThrIleAlaAlaArgAlaSerAla；

11:LeuGlyAlaTrpGluPheTrpValAlaLeuLeuPheGlnMetValLeuProCysGlyPheLeuMetPhe。

同时从图3结果可以看出其中Big-5结构域、保守的α-淀粉酶催化结构域、保守的GT1-糖原合成酶结构域和保守的胞外多糖_转糖基结构域均朝向细胞外。跨膜11次的跨膜结构负责把胞内合成的普鲁兰多糖前体物(α-1,4-葡聚糖)运输到细胞膜外表面，以便上述的朝向细胞外的各个催化结构域催化合成普鲁兰多糖分子。因此，AGS2可以完成从胞内运输普鲁兰多糖前体物到胞外、抓取普鲁兰多糖前体物(α-1,4-葡聚糖)、切下麦芽三糖、麦芽三糖连接成普鲁兰多糖和把合成的普鲁兰多糖连接到细胞膜脂类载体上的所有功能。

利用http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/信号肽分析网站对AGS2基因编码的氨基酸序列进行分析，结果显示该基因编码蛋白含有一段16个氨基酸的信号肽，说明AGS2蛋白是分泌蛋白，需要经过跨膜转运或者分泌通路的输送过程。此外，AGS2蛋白序列中不含有内质网滞留信号肽KDEL，推测AGS2蛋白通过分泌途径从内质网运输到细胞质膜上。利用http://web.expasy.org/protparam/网站对AGS2基因编码蛋白的理化性质进行预测，AGS2蛋白等电点为6.01，分子量为266.47968kDa，带有225个负电荷和196个正电荷(整体带负电荷)，N末端为Met，在酵母中半衰期大于20h，不稳定系数为38.17，为稳定蛋白，脂肪系数为83.28，总平均亲水性为-0.152，为亲水性蛋白。对AGS2蛋白进行细胞定位分析，该蛋白有78.3％的可能性位于细胞质膜上，21.7％可能性位于内质网上。

2、AGS2基因敲除载体的构建

为了验证AGS2基因在合成普鲁兰多糖过程中的功能，通过同源重组的方法对P16菌株中的AGS2基因进行敲除，敲除载体构建具体过程见图4所示。以AGS2基因的序列(SEQID NO:8)为模板，设计引物扩增该基因的同源臂，即5’-arm和3’-arm(表1)。设计引物时，选择合适的酶切位点添加至引物的5’-端，用于后续的酶切连接。5’-arm上下游引物分别添加SphI和SalI酶切位点，3’-arm上下游引物分别添加BamHI和EcoRI酶切位点(表1)。

表1用于扩增敲除AGS2基因5’-arm和3’-arm的引物

Primers	Sequences(5′-3′)
		AGS2-5F	<u>GCATGC</u>GAGGGTGATGAATCCAGG(Sph I)
AGS2-5R	<u>GTCGAC</u>TCACCCTCGGAGTTCTTC(Sal I)
		AGS2-3F	<u>GGATCC</u>AAGAACTCCGAGGGTGAC(BamH I)
AGS2-3R	<u>GAATTC</u>GCCAAGTAGATCGATGCC(EcoRI)

注：表中下划线部分为酶切位点

以P16菌株的基因组DNA为模板，分别以表1的AGS2-5F、AGS2-5R和AGS2-3F、AGS2-3R为引物扩增得到AGS2基因的5’-arm和3’-arm，片段大小分别为347bp和456bp，琼脂糖凝胶电泳验证结果如图5所示。扩增得到的5’-arm和3’-arm分别连接到pFL4A-NAT-LOXP质粒上，形成pFL4A-NAT-LOXP-ΔAGS2(图4)。

以构建好的载体pFL4A-NAT-LOXP-ΔAGS2(图4)为模板，以AGS2-5F和AGS2-3R为引物，利用OneTaq DNA聚合酶进行PCR扩增，扩增得到片段5’-arm-Loxp-polyA-HPT-TEF-Loxp-3’-arm，大小为2160 bp(图5)。

3、酵母转化结果

利用上述获得的片段5’-arm-Loxp-polyA-HPT-TEF-Loxp-3’-arm和原生质体转化法对P16菌株感受态细胞进行转化，培养48h后，在含有50μg/mL诺尔丝菌素抗性的双层HCS平板上，生长出了敲除菌株，而原始P16菌株由于没有诺尔丝菌素抗性基因，不能在双层HCS平板上生长，如图6所示。

将在含有50μg/mL诺尔斯菌素抗性的双层HCS平板上，将图6得到的阳性重组菌株接种到含有100μg/mL诺尔丝菌素抗性的YPD平板上就行复筛，假阳性菌株将不能生长，而真正的转化菌株可以生长。

4、低产胞外多糖重组菌株的筛选及菌体干重的测定

把真正的转化菌株ΔAGS2-1、ΔAGS2-3、ΔAGS2-7、ΔAGS2-13和野生型菌株P16生长在产普鲁兰多糖培养基上，恒温振荡培养5天。通过100℃加热杀死细胞和各种蛋白质，培养液离心沉淀酵母细胞，上清液中胞外多糖用冷乙醇沉淀，沉淀的胞外多糖经多次乙醇洗涤后，80℃下烘干至恒重。沉淀的细胞经过离心洗涤，80℃下烘干至恒重。然后计算每升发酵液中的胞外多糖量、细胞干重量和每克细胞所产生的胞外多糖量，结果如图7所示。图7结果表明其中的敲除菌株ΔAGS2-13胞外多糖产量最低。从56.17g/L±1.55g/L(原始菌株P16)下降到1.70g/L±0.22g/L，下降了96.97％。敲除菌株ΔAGS2-13单位菌体干重产胞外多糖的质量也达到了0.07g/g，相对于原始菌株P16的2.42g/g下降了97.11％。

5、AGS2基因敲除的PCR验证

对P16菌株和ΔAGS2-13菌株提取基因组后，用引物AGS2-5F和AGS2-3R(表1)进行PCR验证，如图8所示。以P16菌株基因组DNA为模板扩增得到1347bp的片段，以ΔAGS2-13菌株基因组DNA为模板扩增得到了敲除片段2160bp。该结果表明，ΔAGS2-13菌株基因组DNA中的AGS2基因已经被完全敲除。

6、野生型P16菌株和AGS2基因敲除菌株的菌落和细胞形态

将P16和ΔAGS2-13菌株分别划线至YPD平板上，培养3天后对其菌落形态观察发现，P16菌株在YPD平板上菌落呈淡粉色，边缘呈放射状，菌落凸起，因为高产胞外多糖表面粘滑有光泽，不透明(图9)；ΔAGS2-13菌株菌落也呈淡粉色，边缘呈放射状，但是其菌落明显要比原始菌株小，因为低产胞外多糖无明显粘滑光泽形态特征，用竹签挑菌落时无拉丝现象，这一变化与胞外多糖产量显性降低有关(图9)。

把P16菌株和ΔAGS2-13菌株分别划线至YPD平板上，培养3天后在显微镜观察细胞形态(图10)，P16菌株和ΔAGS2-13菌株细胞主要为酵母状和出芽细胞2种形态，为典型的短梗霉属酵母菌细胞形态(图10中的A)。将YPD平板上活化好的菌株接种于含有YPD液体的试管中，28℃，180rpm振荡培养18h后观察到的细胞形态，原始菌株P16和ΔAGS2-13菌株细胞都有酵母状细胞、出芽细胞和菌丝状细胞3种形态(图10中的B)。摇瓶产普鲁兰多糖培养基培养5天结束后在显微镜下观察细胞形态，与原始菌株P16细胞相比，AGS2基因敲除菌株ΔAGS2-13的细胞有一定程度膨大，细胞内含物较多(图10中的C)。

7、原始菌株P16与ΔAGS2-13菌株胞内海藻糖，糖原，胞内多糖和总糖含量

为了了解AGS2基因敲除菌株ΔAGS2-13的细胞为何出现膨大(图10)，测定了细胞中的海藻糖、糖原、胞内多糖和总糖的含量。经过离心洗涤的ΔAGS2-13菌株和P16菌株细胞分别与0.25M Na₂CO₃溶液混合，混合液在90～95℃水浴中处理30分钟，然后加入商品化amyloglucosidase(1.2U/mL)(Cas:A7420 MSDS,Sigma,美国)对细胞悬液在57℃下酶解10小时，在这期间不断进行混合均匀。酶解释放出的葡萄糖量利用葡萄糖定量试剂盒(Nanjing Jiancheng Bioeng Institute,Nanjing,中国)进行糖原定量测定。取上述经过离心洗涤的P16菌株和ΔAGS2-13菌株细胞在80℃下烘干至恒重，准确称重，计算每毫升菌悬液中的菌体干重。根据细胞干重计算每克细胞干重中的糖原量。同时利用上述洗涤的细胞与4.0ml预冷的0.5M三氯乙酸(TCA)混合，混合液在0℃下处理20分钟，并随时进行振荡混合。处理过的混合液在4000g下离心5分钟，收集上清液(含有海藻糖),留用。沉淀的细胞用同样的方法再次提取海藻糖两次，三次提取的含有海藻糖的上清液混合均匀，形成12ml的提取液。提取液经过适当稀释，稀释液用硫酸蒽酮法测定稀释液的OD_510nm值。同时配制不同浓度的标准海藻糖溶液，同样用硫酸蒽酮法测定海藻糖溶液的OD_510nm值，绘制标准海藻糖曲线，根据该标准曲线计算每克干重细胞的海藻糖含量。首先利用高压细胞破碎仪(ConstantSystem ltd.,英国)破碎上述的离心洗涤的酵母菌细胞，破碎液经过12,000g离心20分钟，取5毫升上清液(无细胞提取液)加入上述的冷乙醇混合，4℃过夜保存，离心获得沉淀的多糖，利用冷乙醇洗涤多糖，烘干至恒重。培养液中沉淀的细胞经过离心洗涤，80℃下烘干至恒重，计算每克细胞干重中的多糖量量。同时用硫酸蒽酮法测定上清液(无细胞提取液)中的总糖。结果如表2所示，原始菌株P16细胞内的海藻糖，糖原，胞内多糖和总糖含量明显比AGS2-13菌株的低，说明AGS2-13菌株胞外多糖合成量下降明显增加了它的细胞体积。

表2野生型菌株P16及ΔAGS2-13菌株胞内海藻糖、糖原、胞内多糖和总糖的测定

8、野生型菌株P16及ΔAGS2-13菌株产生的胞外多糖纯化和纯化胞外多糖、薄层层析分析和核磁共振分析

沉淀的胞外多糖经多次乙醇洗涤后，80℃下烘干至恒重。烘干的胞外多糖溶解在去离子水中。采用这种预处理后，中性大孔吸附树脂D101装柱后通过吸附和解吸过程实现对多糖的纯化。洗脱液为超纯水，进样流速0.5mL/min，洗脱流速0.5mL/min,洗脱体积为进样体积的3倍。在洗脱过程中测定洗脱液中的多糖含量，结果如图11所示，从2管洗脱液到16管的洗脱液中胞外多糖量成一单峰，说明胞外多糖得到了纯化。

纯化的胞外多糖利用普鲁兰多糖水解酶(pullulanase，特异水解普鲁兰多糖的α-1,6糖苷键)进行水解，水解液经过薄层层析(TLC)分析，发现只有P16菌株所产胞外多糖水解产物中含有麦芽三糖，而所有AGS2基因敲除ΔAGS2-13所产的胞外多糖水解产物中没有麦芽三糖(图12)。根据TLC结果分析，敲除菌株所产胞外多糖未能被普鲁兰酶酶解，水解产物没有麦芽三糖，推测AGS2基因敲除转化子ΔAGS2-13所产胞外多糖不是普鲁兰多糖。

对经过大孔吸附树脂纯化后的多糖过夜透析之后冷冻干燥，采用重水溶解，DSS为内标进行化学位移校正，然后进行核磁共振DEPTQ-C谱分析，结果图13所示。

标准的普鲁兰多糖异头碳在碳谱中一般有3个化学位移值，分别是α-(1→6)(～99ppm)和α-(1→4)(～100.8,101.3ppm)，标准普鲁兰多糖分子由于有2种α-1,4连接的D-葡萄糖，所以在C-6化学位移值有2个信号(61.8和62.1ppm)，C-6中有α-1,6-连接的α-D-葡萄糖，所以有68.0ppm的化学位移值(Lazaridou et al.,2002)。然而ΔAGS2-13菌株产生的微量胞外多糖C谱中并没有这种化学位移值(图13-A)，图13-B的H谱也不是标准普鲁兰多糖的H谱图，说明ΔAGS2-13菌株产生的微量胞外多糖并不是普鲁兰多糖，也说明敲除AGS2基因使敲除菌株失去了大量普鲁兰多糖，合成的少量胞外多糖不含有普鲁糖多糖特有的α-1,6-糖苷键。从而证明了AGS2这种酶是催化普鲁兰多糖分子中α-1,6-糖苷键的形成。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种酶及其在合成普鲁兰多糖中的应用

<130> MP1827173

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 563

<212> PRT

<213> 出芽短梗霉产黑色素变种 P16(Aureobasidium pullulans var.melanogenumP16)

<400> 1

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<212> PRT

<400> 2

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100

<210> 3

<211> 456

<212> PRT

<400> 3

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<210> 4

<211> 386

<212> PRT

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<210> 6

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485 490 495

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515 520 525

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Asp Gly Asp Asn Val Leu Asp Trp Val Pro Pro Asp Ser Leu Ser Phe

1025 1030 1035 1040

Asn Gln Ile Asn Ile Thr Ala Pro His Trp Pro His Thr Gly Tyr Arg

1045 1050 1055

Leu Ala Val Asn Asp Gly Ser Leu Arg Tyr Thr Leu Thr Pro Ala Gly

1060 1065 1070

Ser Ala Gln Arg Gln Val Ala Leu Tyr Ile Leu Leu Ala Leu Leu Pro

1075 1080 1085

Val Ile Thr Ala Cys Ala Ala Val Ala Ile Tyr Leu Gly Ser Phe Tyr

1090 1095 1100

Arg Leu Lys Tyr Asn Ala Val Gly Leu Thr Lys Arg Ser Tyr Pro Phe

1105 1110 1115 1120

His Gln Phe Glu Lys Lys Lys Thr Ile Ala Asp Ile Leu Pro Leu Ser

1125 1130 1135

Phe Lys Lys Leu Ser Glu Lys Gln Ser Ser Val Ala Asp Asn Val Glu

1140 1145 1150

Ala Ser Gln Gly Ala Met Val Thr Thr Asn Ala Pro Gly Ala Arg Thr

1155 1160 1165

Ile Leu Ile Ala Thr Met Glu Tyr Asn Ile Ser Asp Glu Trp Asn Ile

1170 1175 1180

Ser Ile Lys Ile Gly Gly Leu Gly Val Met Ser Gly Leu Met Ala Lys

1185 1190 1195 1200

His Leu Thr Asn His Asn Leu Ile Trp Val Val Pro Cys Val Gly Asp

1205 1210 1215

Val Val Tyr Pro Ile Asp Lys Val Val Glu Pro Ile Lys Ile Thr Ile

1220 1225 1230

Met Gly Lys Gln Tyr Leu Ile Asp Cys Gln Leu His Val Val Gly Arg

1235 1240 1245

Ile Thr Tyr Val Leu Leu Asp Ala Pro Leu Phe Arg Gln Gln Thr Lys

1250 1255 1260

Lys Asp Pro Tyr Pro Ala Arg Met Asp Asp Met Asp Ser Ala Ile Tyr

1265 1270 1275 1280

Tyr Ser Ala Trp Asn Ser Cys Ile Ala Glu Val Met Arg Arg Asn Pro

1285 1290 1295

Gln Ile Asp Ile Tyr His Ile Asn Asp Tyr His Gly Ala Val Ala Pro

1300 1305 1310

Leu His Leu Leu Pro Arg Val Ile Pro Val Cys Leu Ser Leu His Asn

1315 1320 1325

Ala Glu Phe Gln Gly Leu Trp Ser Ile Ser Thr Pro Lys Arg Leu Gln

1330 1335 1340

Glu Met Ser Asp Val Phe Asn Leu Asp Lys Asp Leu Ile Arg Lys Tyr

1345 1350 1355 1360

Val Gln Trp Gly Asp Ser Phe Asn Leu Leu His Ala Gly Ala Ser Tyr

1365 1370 1375

Leu Arg Val His Gln Lys Gly Phe Gly Ala Val Gly Val Ser Lys Lys

1380 1385 1390

Tyr Gly Ser Arg Ser Phe Ser Arg Tyr Pro Ile Phe Trp Gly Leu Pro

1395 1400 1405

Lys Val Gly Met Leu Pro Asn Pro Asp Pro Ala Asp Val Glu His Phe

1410 1415 1420

Asp Lys Cys Leu Pro Asn Pro Asp Val Thr Ile Asp Gln Glu Tyr Glu

1425 1430 1435 1440

Ala Ser Arg Gly Pro Thr Arg Val Glu Ala Gln Lys Trp Ala Asn Leu

1445 1450 1455

Asp Ile Asp Pro Thr Ala Glu Leu Phe Val Phe Val Gly Arg Trp Ser

1460 1465 1470

Met Gln Lys Gly Ile Asp Leu Ile Ala Asp Val Phe Pro Lys Val Leu

1475 1480 1485

Glu Glu Asn Pro Lys Ala Gln Leu Ile Cys Val Gly Pro Val Ile Asp

1490 1495 1500

Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Ala Leu Lys Leu Asp His Leu Met Lys Lys

1505 1510 1515 1520

Tyr Pro Gly Arg Val Tyr Ser Lys Pro Gln Phe Val Tyr Ile Pro Pro

1525 1530 1535

Phe Val His Glu Gly Ala Glu Trp Ala Leu Ile Pro Ser Arg Asp Glu

1540 1545 1550

Pro Phe Gly Leu Val Ser Val Glu Phe Gly Arg Lys Gly Ala Leu Gly

1555 1560 1565

Ile Gly Ala Arg Val Gly Gly Leu Gly Gln Met Pro Gly Trp Trp Phe

1570 1575 1580

Ser Val Glu Ser Ser Thr Thr Lys His Leu Leu Thr Gln Phe Lys Lys

1585 1590 1595 1600

Cys Ile Asn Gly Ala Leu Ala Ser Asp His Gln Thr Arg Ala Leu Leu

1605 1610 1615

Arg Ala Arg Ser Lys Val Gln Arg Phe Pro Val Gln Gln Trp Val Glu

1620 1625 1630

Asp Leu Glu Thr Leu Gln Thr Lys Ala Ile Lys Leu Asn His Lys Val

1635 1640 1645

Gln Asp Gly Ser Thr Ser Ala Leu Asn Ser Pro Ile Asn Ser Leu Pro

1650 1655 1660

Asn Ser Arg Asn Pro Ser Arg Val Thr Ser Pro Ala Val Ser Arg Pro

1665 1670 1675 1680

Ser Ser Pro Ser Arg Ala Ala Ser Arg Pro Ser Ser Pro Thr Pro Ala

1685 1690 1695

Ala Ser Arg Ser Gln Ser Pro Ser Pro Glu Thr Pro Arg Pro Gln Met

1700 1705 1710

Arg Arg Arg Leu Ser Ser Leu Leu Tyr Pro Ala His Pro Ser Leu Glu

1715 1720 1725

Gln Tyr Met Pro Phe Arg Arg Arg Leu Ser Ser Leu Phe Pro Ser Ser

1730 1735 1740

Arg Arg Thr Pro Phe Ala Asp Leu Asn Pro Ser Thr Thr Glu Glu Gly

1745 1750 1755 1760

Asp Glu Ser Arg Asp Ser Leu Gly Glu Leu Gln Pro Ser Pro Pro Lys

1765 1770 1775

Ser Arg Pro Gly Thr Ala Gly Ser Leu Asn Gly Ala Ser Gln Asn Leu

1780 1785 1790

Phe Thr Pro Gly Phe Gly Phe Ser Glu Glu Pro Ala Leu Pro Gly Glu

1795 1800 1805

Val Ala Arg Pro Thr Ile Ala His Tyr Arg Arg Ser Ser Thr Leu Ser

1810 1815 1820

Val Asp Glu Val Val Gly Glu Lys Thr Asp Tyr Asn Leu Gln Lys Val

1825 1830 1835 1840

Asp Gln Ser Phe Thr Asp Ser Lys Leu Asp Tyr Tyr Arg Ile Tyr Glu

1845 1850 1855

Gly Met Leu Gly Ser Leu Thr Ala Lys Asn Ser Glu Gly Asp Leu Cys

1860 1865 1870

Ile Glu Asn Phe Leu Ala Leu Ala Glu Lys Asn Trp Tyr Arg Arg Phe

1875 1880 1885

Asn Glu Ala Lys Leu Gly Arg Ala Val Ile Ser Ala Pro Ser Val Ser

1890 1895 1900

Gly Lys Lys Gly Ala Asn Ser Leu Leu Val Thr Val Arg Glu Gly Ser

1905 1910 1915 1920

Ser Ser Glu Ser Asp Arg Ala Gly Ser Val Gly Gly Thr Ser Gln Asn

1925 1930 1935

Ser Ala Glu Gln Phe Phe Thr Asn Ala Asn Tyr Lys Pro Pro Thr Gly

1940 1945 1950

Ile Ser Lys Phe Leu Ile Ser Lys Leu Pro Tyr Ile Ala Pro Asp Trp

1955 1960 1965

Pro Leu Tyr Ala Tyr Leu Leu Ala Phe Gly Gln Ile Ile Ala Val Asn

1970 1975 1980

Ser His Gln Ile Thr Ile Ile Thr Gly Ala Gln Gly Glu Asn Ala Asn

1985 1990 1995 2000

Lys Leu Tyr Val Val Ala Ser Ile Tyr Leu Ala Gly Ser Leu Phe Trp

2005 2010 2015

Trp Phe Met Val Arg His Phe Ala Ser Lys Tyr Ala Leu Ser Leu Pro

2020 2025 2030

Phe Met Phe Tyr Gly Leu Ser Phe Phe Phe Val Gly Leu Ala Pro Tyr

2035 2040 2045

Gly Met Thr Ile Asp Ser Arg Gly Trp Ile Gln Asn Val Ala Ser Gly

2050 2055 2060

Phe Tyr Ala Phe Ala Ser Ser Ser Gly Ser Leu Tyr Phe Ala Leu Asn

2065 2070 2075 2080

Phe Ala Ser Glu Gly Gly Val Pro Ile Gly Thr Met Ile Tyr Arg Ala

2085 2090 2095

Thr Val Val Gln Gly Ile Gln Gln Leu Trp Val Ala Ala Leu Trp Ala

2100 2105 2110

Trp Gly Thr Thr Met Ser Ala His His Thr Ala Lys Tyr Thr Asn Thr

2115 2120 2125

Ile Met Asn Ser Lys Val Ile Leu Ala Ile Met Ala Pro Ile Ala Val

2130 2135 2140

Leu Phe Val Ile Val Gly Leu Leu Leu Leu Phe Gly Leu Pro Asp Tyr

2145 2150 2155 2160

Tyr His Asn Ser Pro Gly Lys Ala Pro Ser Phe Tyr Thr Ser Leu Leu

2165 2170 2175

Lys Arg Lys Leu Val Ile Trp Phe Phe Ile Ala Val Ile Val Gln Asn

2180 2185 2190

Tyr Trp Leu Ser Ser Leu Val Gly Arg Asn Trp Gln Tyr Leu Phe Asn

2195 2200 2205

Ser Thr Gln Ala Pro Ile Trp Ala Ile Val Leu Leu Leu Leu Phe Phe

2210 2215 2220

Phe Ile Val Val Trp Cys Thr Ala Leu Tyr Ile Leu Ala Arg Tyr Ser

2225 2230 2235 2240

Glu His His Ser Trp Phe Leu Pro Ile Phe Gly Ala Gly Leu Gly Ala

2245 2250 2255

Pro Arg Trp Cys Gln Met Leu Trp Ser Thr Ser Gly Met Gly Ser His

2260 2265 2270

Leu Pro Trp Gly Ser Val Val Gly Gly Ala Ile Ala Gly Arg Cys Leu

2275 2280 2285

Trp Leu Trp Leu Gly Val Leu Asp Ala Leu Asn Gly Val Gly Ile Gly

2290 2295 2300

Thr Met Leu Leu Gln Thr Leu Thr Arg His His Val Ala Val Thr Leu

2305 2310 2315 2320

Thr Ala Ala Gln Val Ile Gly Ser Val Ala Thr Ile Ala Ala Arg Ala

2325 2330 2335

Ser Ala Pro Asp Ala Thr Gly Pro Ala Ser Val Phe Pro Asn Leu Val

2340 2345 2350

Leu Asn Leu Ser Gly Leu Gly Ala Trp Glu Phe Trp Val Ala Leu Leu

2355 2360 2365

Phe Gln Met Val Leu Pro Cys Gly Phe Leu Met Phe Phe Arg Asn Glu

2370 2375 2380

Gln Leu Phe Lys Pro

2385

<210> 8

<211> 7629

<212> DNA

<400> 8

atggcttgca aaatgatcaa actggccgca atcctttgtt cttctctcat actccaccct 60

tccccaacac aagcacttag ctggtctgct gactatgttg attggaacct taaccagaat 120

gagactgcgg acagccctct ccagtactgg ggtgaatgga cagaacatcc aaaaacacct 180

tcaccttcca actggagaat gcccttctac atgctaacgc tggatcgttt tgtagatgga 240

caacctgcca acaacgatgc taacaaaact gtctttgaga atgattggac caccaatcag 300

ttccgattcg gtggagatac caaaggcctg atggaaaact tggactggat ccaggatctc 360

ggtatcaagg taagcacgat gtttacccgc tccttccctt cttcaagttt cccttcttgt 420

ccgtcccttt gcccctatct agtgtctgac cagatttgta ggccatctac ttctcgggtt 480

ctccttttat caaccagccg tgggcttccg acgggttcgg accacttgac tttacactgc 540

ttgatgcaca ccacggaacg atcaccgaat ggcgcgaact catcgaagag ctgcaccgcc 600

gtggtatgta cgccatcatg gagaacacaa tcggtaccat gggagatctg ctcgccttcg 660

agggctggga gaacgaaacc acacccttca atccgctcga atacgacgta ctctggaaga 720

ccagccgaca atatctcgat ttcgaggtcg acaatgacat tcttgaagac tgttcttacc 780

caattttcta tggcgacgat ggctaccctg taaaccaatc tatcatggca accttcgaga 840

accagtgccg taagtccgac ttcgatcagt atggcgacat gaagggagtc ggttacgtac 900

ctccctacca gagtcagctt tcgaagttcg ccagcgttca agatcgtctc aaactttgga 960

aacatgaagt tctcgagaag gtcatgcatt tcagctgtat gcagatcgcc atgctggaca 1020

tcgacggctt ccgagtggac aaagcgctac agactcctat tgatgctttg gccgaatggg 1080

caacatatca gcgtaactgc gctcgccagt acggaaaaga gaacttcctc attaccggtg 1140

aagtcgtagg agagctcaaa ttctcctctg tcttcttcgg ccgtggcaag tctcccgata 1200

cctacttcga agatcagctt gatggacaga atgctactgg aaagactgaa ggctatatcc 1260

gcgagtttgg caataatgcg ctcgacggca caaacttcca ttaccccaca tacgtgagtc 1320

aagcgtcgtg agccttggca gtgcttcgtg actgccaagg ctcacgtatc aagatttctg 1380

gccattcctg ctgacaagca tcatgatata gggtgccctc accagatttt tgggtctcga 1440

cggcgctatt ggcttcgaag gcgtagattt tgtggaccac tggaatgctt atctacttag 1500

cgatgacatg gtgaatgcca ataccggagt ctttgatccc aggcacatgt tcgggactac 1560

taatcaaggt aaggaaaaaa aaaagaaaaa gaaaaagaaa aaaaaagaaa aagaaaaaaa 1620

agaaaaagga aaaaaaagaa aaagaaccct cctctctctg tagctgagca tttgactgac 1680

tgttcggaaa acagacgtct tcagatggcc atcactcatt gatggaaccc aaagacaggt 1740

gctggcgttt ctcatcacct tcttggagat gcccggtatc ccagagttga tttggggaga 1800

cgaagtcgaa tacaaggtct tggagaactt ggccgctgat tacatcttcg gcagacagcc 1860

tatggcctca accagagctt ggcaaatgca cggttgctac aaggttggcg ctgctggcaa 1920

tggttatttc gatatgcctt tcggagacgc gctcacagct tgcgaagacg atacagtcag 1980

tctcgatcag aggaatgccg ctcatccttt gcgaaacctg atcaaacgca tgtttgagct 2040

gcgtaccgtc taccccgtgc tcaacgatgg tttctccctc caaacactct tcttcgatac 2100

ctacgacatt ttcctcccgt atagtggaca attgcccact ccattgggta tctggtcagt 2160

gtatcgcgga cgtactcccg aggttcaaga tctatctggc gagggaatgg gtaaccaggg 2220

cgtctggatc atctactcga accagaacaa gtctgttgag tactcgtacg actgcagcaa 2280

ttcttctcac tctctcgttg cgccattccc ggagggaacg accgtcaaaa acttgttcta 2340

tccttatcaa gaatacacct tgaattcttc tacggctaag ctcggcatcg aaggatcaga 2400

ggagaacaac ggctgtctgc ccagcatcga gctcgaggca tggggatggc gcgcgtttgt 2460

tccgatcgac aagttcgtcg cgcctgctcc agtcatcact ggcgccgtgc ctcgtcatga 2520

cgccagaatt gaaaccactg tggacctcaa tgagaccgtc tcgcttccga tcacattact 2580

gttcagcaga gaaatgaatt gcagctcgat cttgcagagt attagcatca actcgaccac 2640

acagacaggc gtcatcccat tcttcgatgc gtccagtgtg tcatgcaaga acatcacggt 2700

gaatgacaca caacgctttg tcggagaaac actttcgact ttctcgtggt ctgcaaatct 2760

cgtgaacgtt ggtcatggtg tgcacactta cacagtggtc aacgcaacta gtgtcgacgg 2820

aaccgccttc accaacacca aagctcgatt catgctccgc gtgggtcgta acgacaatcc 2880

cgtcgtcttc tccagtgcca actacacgac tggactcatt agtcgcgaca gcactactgg 2940

ccaactgcag ctgacgccaa aagctgctgg tgcgagtcta tggcgttact caaccaacta 3000

tggatcgaac tggtcaaact ggactgacta ctcctactct ggtgggccag ttctcatcga 3060

agagcaagct tggtctggta cgaaagctca acggtgggaa ggagtccatg ttgtcacaca 3120

atattggtct ccacagattg gatcgacaga tcacattcaa cactctgacc tcggagccga 3180

cgtccctcgt cgttggcctc atgttcatgt tcaagggccc tggaatcaat acggctacga 3240

cggtggtctt gacgataaga tgcatcaaga ttcgaatggt acctggaact ttgaccttta 3300

ttccgagttc ccgacatcag ttctggtcaa cgtctggggc atgaatgaag atggtcgtcc 3360

agataagtcg gctgcatacg gcgatgtcga tggcgacaat gtgctcgatt gggtgccgcc 3420

agacagtctg tccttcaacc agatcaacat cactgcaccc cactggcccc ataccggata 3480

cagactcgca gtgaatgatg gttctctgcg ctatactctt actccagccg gctctgcaca 3540

aagacaagtc gcactgtaca ttttgctggc tcttctccca gtcatcactg catgtgctgc 3600

tgtcgccatc tacctcggct cattctatcg cctgaaatac aatgccgtcg ggctcacgaa 3660

gcgcagctat cctttccatc aatttgaaaa gaagaagact atcgcagata tccttcctct 3720

gtctttcaaa aagctgtcgg agaagcagag ctccgtcgca gacaacgtcg aagccagcca 3780

gggtgccatg gtcaccacca atgctcccgg ggccagaaca attcttatcg ctacgatgga 3840

gtataacatc agcgatgaat ggaacatctc cattaagatt ggaggtcttg gagtgatgtc 3900

aggcttaatg gcgaaacatc tcacgaacca taatctcatc tgggttgtgc cctgcgtcgg 3960

ggatgttgtg tatcccatcg ataaagttgt ggagcccatc aaaattacca tcatgggtaa 4020

gcaatatttg atcgactgtc aactccatgt cgtgggacgc atcacatacg tcctgcttga 4080

tgcgccattg ttccgacagc agacgaagaa ggacccttac cccgctcgta tggatgacat 4140

ggacagcgcc atctactact cagcttggaa ttcttgtatc gccgaagtga tgagacgcaa 4200

tcctcagatt gacatctatc acatcaacga ttaccatgga gccgttgcgc cactgcacct 4260

cctgccaaga gtcatccctg tctgtctttc acttcacaac gctgaattcc agggcctctg 4320

gtcaatcagc actccaaaaa ggcttcaaga gatgagcgat gtttttaacc tggataaaga 4380

tctcatccga aagtaagtca gatcgaagcc ttaagtttgt ccggcgaaag ccgtggtgtt 4440

cctacgttgc atctttgttc catcatgcta attttcggaa aggtacgttc agtggggaga 4500

ctcgtttaat ctcttacacg ccggcgcgag ttacctgcgt gtacatcaaa agggttttgg 4560

tgccgtaggt gtctcaaaga aatatggcag tcgaagcttt tcgagatacc caatcttctg 4620

ggggcttccc aaggtgggta tgttgccgaa ccctgatcct gccgatgtag agcacttcga 4680

taagtgtctt ccgaacccgg acgttaccat cgaccaagag tacgaggcct ctcgcggacc 4740

aactcgagtt gaagcacaaa agtgggccaa cctggatatc gatccaacgg ccgagctctt 4800

cgtcttcgtc ggaagatgga gcatgcaaaa aggcattgat ctcatcgcag atgtcttccc 4860

caaggtcctg gaagaaaatc ccaaagcaca gttgatctgt gtgggtcctg ttatcgacct 4920

gtacggtaaa ttcgctgctc tgaagctcga ccacctcatg aagaagtacc cgggtcgtgt 4980

ctactcaaag ccacagttcg tatacatccc acccttcgtc catgaggggg ccgaatgggc 5040

actgatccct tcgcgggacg agcccttcgg tttagtttca gtcgaattcg gccgcaaggg 5100

agcacttggt attggtgcga gggttggcgg tcttgtaagt taacccgaac gttcaacttt 5160

gtaacgttat gctgattgaa aaaaaaggga caaatgcccg gctggtggtt ctccgttgaa 5220

tcttccacga caaaacatct cttgactcag ttcaagaaat gtattaacgg cgctttggct 5280

tcggaccatc agactcgagc ccttctacgc gcaagaagca aggtgcaaag gttcccagtt 5340

cagcagtggg tggaagatct tgagactctt cagaccaagg ctatcaagct caaccacaag 5400

gtgcaggacg gttcgacatc tgctttgaac tctccgatca actcgcttcc caactcacgc 5460

aatccatccc gcgtgacatc tccagcagtc tcgagaccat cttcgccttc tcgggcggcc 5520

tcaagaccgt cttcacctac tccagcagcc tcaagatcgc aatcacccag tccggaaaca 5580

ccgagacctc agatgagacg ccgactttcc agtctcttgt atcctgctca tccctctctg 5640

gaacagtata tgccatttcg tcgtcgtttg tcatctctct tcccttcatc acgccgaacc 5700

ccattcgcgg atcttaaccc gagtacaact gaagagggtg atgaatccag ggacagtctc 5760

ggcgaactcc aaccatcacc accaaaatcg cgccccggta cagctggaag tctgaacgga 5820

gcctcacaaa acttgttcac ccctggcttc ggcttttctg aagaacccgc tctaccaggc 5880

gaggttgcga gacccacaat tgctcactat agacgttcct cgacgcttag cgttgatgag 5940

gttgtaggcg agaagaccga ctacaaccta cagaaggttg atcaatcctt cacagattct 6000

aagctcgact actaccgcat ctatgagggt atgcttggat ctctgaccgc gaagaactcc 6060

gagggtgacc tatgcatcga aaacttcttg gccttggcag aaaagaactg gtaccgcaga 6120

ttcaacgagg ccaagctcgg tcgagctgtt atctctgcac cgagtgtgag tggcaagaaa 6180

ggagcaaaca gtttgcttgt cacggtccgc gaaggatctt ccagtgagag cgaccgcgcg 6240

ggcagtgttg gaggcacctc gcaaaacagc gcagaacagt tcttcacaaa cgccaactac 6300

aagcccccca ctggcatctc gaagttcttg atttcgaagc tgccctacat cgcacctgac 6360

tggccattgt atgcctacct tctcgccttc ggacagatca tcgctgtcaa cagtcatcaa 6420

atcacgatca tcactggagc tcagggtgaa aatgctaaca agctttatgt tgtggcatcg 6480

atctacttgg ctgggtctct attctggtgg ttcatggtcc gtcatttcgc atccaaatat 6540

gcgttgtccc ttccgttcat gttctacggt ctgtcgttct tcttcgttgg tctcgcacca 6600

tacggcatga ctatcgatag taggggatgg attcaaaacg tggcttcagg cttctacgca 6660

tttgcttctt cgtccggatc cctgtacttt gccttgaatt tcgcaagcga aggtggcgta 6720

cctattggca ccatgatcta cagagccacc gttgttcagg gcatccagca gttgtgggtg 6780

gctgcactgt gggcctgggg aacaaccatg agcgctcacc acaccgctaa gtacaccaac 6840

actatcatga actccaaagt gattttggct atcatggccc cgatcgcagt tctgtttgtg 6900

attgttggtc tgcttctcct tttcggtctg cctgattact accacaactc gccaggaaag 6960

gctccatcat tctacaccag tttgttgaag cgcaagttgg tgatctggtt cttcattgcc 7020

gtcatcgttc agaactactg gctttcttca cttgtcggtc gcaactggca atacctcttc 7080

aacagcaccc aggctccaat ctgggctatt gttcttctac ttctgttttt cttcatcgtt 7140

gtttggtgta ctgcactcta cattcttgca cgctactctg aacaccactc ctggttcttg 7200

cccatcttcg gtgctggcct cggtgctccg cgctggtgtc aaatgctctg gagcacatcg 7260

ggcatgggca gccatctacc atggggctcg gtcgttggtg gtgcaattgc tggaaggtgc 7320

ctgtggctct ggctcggcgt tctcgatgct ctgaacggtg tcggtatcgg caccatgctt 7380

cttcagactc ttactcgcca ccacgtcgct gtcactctga ccgctgcaca agttatcggt 7440

tccgtcgcta ccatcgccgc tcgtgcatcg gcacctgatg caactggacc tgcatctgtg 7500

ttccctaatc tggttctcaa tttgagcggg ctcggtgcct gggagttttg ggtcgctctg 7560

ttgttccaga tggtcttgcc ttgtggcttc cttatgttct tccgcaacga acagttgttc 7620

aagccttga 7629

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggcttgca aaatgatcaa actggccgc 29

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcaaggcttg aacaactgtt cgttgcgg 28

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcatgcgagg gtgatgaatc cagg 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtcgactcac cctcggagtt cttc 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggatccaaga actccgaggg tgac 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaattcgcca agtagatcga tgcc 24

Claims

1.一种酶，其包含：α-淀粉酶催化结构域、α-1,4-葡聚糖定位结构域、GT1-糖原合成酶结构域和胞外多糖-转糖基结构域。

2.根据权利要求1所述的酶，其特征在于，其至少包含2个跨膜结构。

3.根据权利要求1或2所述的酶，其特征在于，所述α-淀粉酶催化结构域的氨基酸序列包含Asp-X-Glu-Asp序列，所述X由任意2～5个氨基酸组成；

作为优选，所述α-淀粉酶催化结构域包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或包括与SEQ ID NO:1具有至少90％同源性的氨基酸序列。

4.根据权利要求1或2所述的酶，其特征在于，所述α-1,4-葡聚糖定位结构域包含Leu-Gln-Ser序列；

作为优选，所述α-1,4-葡聚糖定位结构域包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或包括与SEQ ID NO:2具有至少90％同源性的氨基酸序列。

5.根据权利要求1或2所述的酶，其特征在于，所述GT1-糖原合成酶结构域包含Lys-Ile-Gly-Gly序列；

作为优选，所述GT1-糖原合成酶结构域包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或包括与SEQ ID NO:3具有至少90％同源性的氨基酸序列。

6.根据权利要求1或2所述的酶，其特征在于，所述胞外多糖-转糖基结构域包括SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列；或包括与SEQ ID NO:4具有至少90％同源性的氨基酸序列。

7.根据权利要求1或2所述的酶，其特征在于，2个所述跨膜结构分别为跨膜结构A和跨膜结构B：

跨膜结构A在包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的位置跨膜1次；

8.根据权利要求1～7任一项所述的酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

9.编码权利要求1～8任一项所述酶的DNA序列。

10.根据权利要求9所述的DNA序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

11.包含权利要求9～10任一项所述DNA序列的表达载体。

12.表达权利要求1～8任一项所述酶的宿主细胞。

13.权利要求1～8任一项所述酶在合成普鲁兰多糖中的作用。

14.一种普鲁兰多糖的生产方法，发酵权利要求12所述宿主细胞，获得普鲁兰多糖。

15.一种普鲁兰多糖的合成方法，以α-1,4-葡聚糖为底物，以权利要求1～8任一项所述酶催化，获得普鲁兰多糖。