CN102212499B - 一种编码4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的基因的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种编码4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的基因(XC_0450)在黄原胶生产中的应用，该基因用于构建及选育黄原胶高产的基因工程菌。该基因工程菌携带所述基因的重组质粒(pL0450)，通过将该pL0450导入野油菜黄单胞菌野油菜变种(Xcc)的野生型菌株(8004)获得。该基因工程菌为携带所述基因的多拷贝pL0450的8004/pL0450。
Description
技术领域
本发明涉及微生物遗传工程技术，尤其涉及一种编码4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的基因在改良黄原胶高产菌株中的应用。
背景技术
黄原胶(Xanthan gum)是一种由野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)所产生的胞外多糖(extracellular polysaccharide，EPS)聚合物，由多个“五糖单元”聚合而成。两个D-葡萄糖分子通过β-(1→4)糖苷键连接成主链骨架，一条由甘露糖-(β→1，4)-葡萄糖醛酸-(β→1，2)-甘露糖组成的侧链通过α-(1→3)糖苷键连接到主链的一个D-葡萄糖残基，组成一个“五糖单元”(Swings & Civerolo，1993)。“五糖单元”侧链的甘露糖残基不同程度地被乙酰化或丙酮酰化。不同来源的菌株和不同培养条件所产生的黄原胶的结构基本相同，但侧链的酰基化程度不同，因而乙酸和丙酮酸的含量不同，黄原胶的质量也就不同(Cadmus et al.，1976；Stankowski et al.，1993)。工业生产上通常采用野油菜黄单胞菌野油菜变种(Xanthomonascampestris pv.campestris，简称Xcc)作为生产菌种进行发酵生产黄原胶。
黄原胶是目前仅次于抗生素和溶剂的第三大类发酵产品，具有良好的假塑性和流变性，被作为悬浮剂、增稠剂、乳化剂等广泛应用于二十多个工业行业的一百多种产品的生产中。目前全球对黄原胶的年消耗量超过5万吨，并且每年仍以10％的速度增长(Becker et al.，1998；Garcia-Ochoa et al.，2000；Swings & Civerolo，1993)。
由于黄原胶具有巨大的商业价值，其生物合成机理的研究从上世纪八十年代起在国际上就受到人们的重视，已发现黄原胶合成的一些重要途径和所需的酶系统。目前已鉴定Xcc染色体上有三簇基因与黄原胶合成有关：参与糖核苷等衍生物前体形成的一个35.3kb的基因簇(Harding et al.，1993； 
et al.，1992)，参与“五糖单元”的顺序性组装、残基修饰、重复单元间的聚合以及黄原胶分泌的gum基因簇(Harding et al.，1987；Ielpi et al.，1993)，以及一个包含三个基因但在黄原胶合成过程的具体作用尚未十分清楚的基因簇(Lu et al.，2007)。尽管人们已对黄原胶的生物合成机理作了较多的研究，但有关黄原胶生物合成的调控、影响黄原胶生物合成的产量和质量的其他代谢途径等问题仍尚未十分清楚。
黄原胶在我国的研究开发始于八十年代，并于八十年代末实现了国产黄原胶的工业化生产。但是，国产黄原胶与国外产品相比，生产成本高、产品质量差，不具备与国外产品竞争的能力。目前国外产品在国内黄原胶市场仍占很大的份额，并随着国内黄原胶市场需求的增加其市场份额有逐渐增加趋势。改良黄原胶生产菌株、提高黄原胶产量和质量，是我国黄原胶生产面临的主要问题。发达国家黄原胶生产菌株的黄原胶产量比国内的生产菌株往往高出20％以上。另外，在黄原胶的粘度、抗盐性和对酸碱热的稳定性等质量指标方面，国外产品也比国内产品要高。因此国内黄原胶生产企业迫切需要优良的黄原胶生产菌株和新的生产工艺。由于采用传统的育种方法改良菌种效果有限，故人们寄望于采用现代遗传工程手段来定向改良菌种。鉴定和克隆与黄原胶生物合成相关的基因，将可为通过遗传工程改良菌种或设计新工艺提供工作基础(Becker et al.，1998；Garcia-Ochoa et al.，2000；Vandersliceet al.，1988)。
4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD)是催化4-羟基苯丙酮酸转化为尿黑酸的一种酶，该反应是酪氨酸代谢中的第二个步骤。酪氨酸代谢在所有需氧生物中普遍存在，是一种铁-酪氨酸蛋白。在植物中，尿黑酸用于合成光合作用中电子传递所需要的重要物质质体醌和生育酚，HPPD的缺乏可最终导致植物的白化而死亡。利用这一性质，HPPD可作为新的除草剂的药物靶标酶。在医学上，HPPD也是治疗酪氨酸病的靶标酶。酪氨酸病是一种罕见的酪氨酸代谢遗传性疾病，临床上利用HPPD的抑制剂来治疗该病。但有关HPPD在黄原胶生产中的应用尚未见文献报道。
主要参考文献
Becker，A.，Katzen，F.，Puhler，A.et al.(1998).Xanthan gumbiosynthesis and application：a biochemical/genetic perspective.Appl MicrobiolBiotechnol，50：145-152
Cadmus，M.C.，Rogovin，S.P.，Burton，K.A.et al.(1976).Colonialvariation in Xanthomonas campestris NRRL B-1459 and characterization of thepolysaccharide from a variant strain.Can J Microbiol，22(7)：942-948
Garcia-Ochoa，F.，Santos，V.E.，Casas，J.A.et al.(2000).Xanthangum：production，recovery，and properties.Biotechnol Adv，18：549-579
Harding，N.E.，Cleary，J.M.， D.K.et al.(1987).Geneticand physical analyses of a cluster of genes essential for xanthan gum biosynthesisin Xanthomonas campestris.J Bacteriol，169：2854-2861
Harding，N.E.，Raffo，S.，Raimondi，A.et al.(1993).Identification，genetic and biochemical analysis of genes involved in synthesis sugar nucleotideprecursors of xanthan gum.J Gen Microbiol，139：447-457
Ielpi，L.，Couso，R.O.，Dankert，M.A.(1993).Sequential assemblyand polymerization of the polyprenol-linked pentasaccharide repeating unit of thexanthan polysaccharide in Xanthomonas campestris.J Bacteriol，175：2490-2500
Lu，G.T.，Ma，Z.F.，Hu，J.R.，Tang，D.J.，He，Y.Q.，Feng，J.X.，Tang，J.L.(2007).A novel locus involved in extracellularpolysaccharide production and virulence of Xanthomonas campestris pathovarcampestris.Microbiology，153：737-746.
Stankowski，J.D.，Mueller，B.E.，Zeller，S.G.(1993).Locationof a second O-acetyl group in xanthan gum by the reductive-cleavage method.Carbohydr Res，241：321-326
Swings，J.G.& Civerolo，E.L.(1993).Xanthomonas.London：Chapman & Hall.
Vanderslice，R.W.，Doherty，D.H.，Capage，M.A.et al.(1988).Genetic engineering of polysaccharide structure in Xanthomonas campestris.pp.145-157.In V.Crescenzi，I.C.M.Dea，S.Paoletti，S.S.Stivala，I.W.Sutherland(ed.).Biomedical and biotechnological advances in industrial polysaccharides.New York：Gordon and Breach Science Publishers.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种编码4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase)的基因的应用，该基因用于构建能够改良黄原胶生产菌株的基因工程菌。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种编码4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的基因在黄原胶生产中的应用，该基因是序列表中序列1的DNA序列；该基因用于构建及选育黄原胶高产的基因工程菌；该基因工程菌的获得方法包括：利用该基因构建该基因的重组质粒或多拷贝的重组质粒，并导入野油菜黄单胞菌野油菜变种Xcc的野生型菌株8004中。
优选地，序列1的DNA序列是Xcc野生菌株8004的基因组中的一段DNA序列，由1071个核苷酸组成，是含完整的所述编码4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的基因，自5′端的第64～第1131位核苷酸为该基因的开放阅读框(ORF)，自5′端的第64～第66位核苷酸为该基因的起始密码子ATG，自5′端的第1132～第1134位核苷酸为该基因的终止密码子TAG。
优选地，
在序列表中序列2的蛋白质是所述基因编码的4-羟基苯丙酮酸双加氧酶演绎的氨基酸序列，由356个氨基酸组成；该蛋白质预测分子量为39968.10道尔顿，等电点为4.99。
优选地，含有所述基因的表达载体为所述基因的重组质粒。
优选地，所述基因的缺失突变体为所述基因被整合突变获得的整合突变 体。
本发明鉴定了Xcc8004菌株基因组中编码4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的基因(编号为XC_0450，其EC为1.13.11.27)与黄原胶产量有关，该基因可用于构建、选育黄原胶高产的基因工程菌株。
图1为本发明对XC_0450基因整合突变体0450nK的PCR验证，其中：
M：100bp DNA ladder；1：野生型菌株8004；2、3：整合突变体0450nK；
图2为XC_0450基因的克隆酶切电泳图谱，其中：
M：100bp标准DNA；1：XC_0450基因片段；2：重组质粒pL0450的酶切图；
图3为本发明对Xcc的XC_0450基因突变体0450nK及工程菌8004/pL0450的黄原胶产量的定性检测。
以下结合附图和优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。以下例举的实施例仅意图说明本发明，而不意图限制本发明的技术方案。本发明的范围由后附的权利要求限定。
附图说明
本发明提供的一种编码4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的基因(XC_0450)，其是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中序列1的DNA序列；
2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列是Xcc野生菌株8004的基因组中的一段DNA序列，由1071个核苷酸组成。含完整的编码4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的基因XC_0450，自5′端的第64-1131位核苷酸为该基因的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，自5′端的第64-66位核苷酸为该基因的起 始密码子ATG，自5′端的第1132-1134位核苷酸为终止密码子TAG。
具体实施方式
序列表中序列2的蛋白质是XC_0450基因编码的4-羟基苯丙酮酸双加氧酶演绎的氨基酸序列，由356个氨基酸组成。该蛋白质预测分子量为39968.10道尔顿，等电点为4.99。
该XC_0450基因的序列已在美国国立生物技术信息中心(NCBI)公布，基因组序列号NC_007086，该基因编码蛋白序列号YP_241552.1。该基因的整合突变体0450nK、携带该基因的质粒pL0450以及携带多拷贝pL0450的Xcc基因工程菌8004/pL0450已在广西大学生命科学与技术学院保存。
本发明还涉及含有上述基因的表达载体，优选为pL0450。
本发明提供上述基因在基因工程改良黄原胶的生产菌种中的应用。
在以下本发明的实施例中所用到的材料包括：
野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)野生型菌株8004，购于英国植物病原细菌国家保藏中心(The National Collection of Plant Pathogenic Bacteria，NCPPB)，保藏号为NCPPB No.1145；
大肠杆菌(Escherichia coli)株系JM109、载体pGEM-3Zf(+)购自Promega公司，带有lac启动子的载体pLAFR3(Staskawiczetal.，1987)；
自杀质粒pK18mob( 
et al.，1994)为本研究室保存的柯斯质粒；
限制性内切酶、连接酶和其它修饰酶等试剂购自Promega、QIAGEN公司等；
PCR反应所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
实施例1
Xcc中XC_0450基因突变体的构建
采用自杀质粒pK18mob诱变XC_0450基因，具体方法参照Windgassen等(FEMS Microbiol.Lett.2003，193：201-205)所描述。
根据Xcc的8004菌株中XC_0450基因的DNA序列(基因组序列号 NC_007086，Qian et al.，2005)，设计引物0450F/R(0450F：CCCGGATCC AGGTCACCACCTTCGAAAATC；0450R：CCCGGATCC CATGTTGCCGAAGTACAGGT)，以Xcc 8004菌株总DNA为模板，采用PCR法(95℃预变性4min；95℃变性1min，55℃复性30s，74℃延伸30s，30个循环；74℃延伸5min)扩增XC_0450基因的ORF内5～528bp之间的523bp区域的同源片段。为方便克隆，在引物的5′端分别加上相应的酶切位点序列(即上述DNA引物序列中的带有下划线的部分)。DNA片段经BamHI酶切后，克隆到pK18mob上。将获得的重组质粒通过三亲本接合导入Xcc野生型菌株8004，筛选具有卡那霉素(Km)和利福平(Rif)抗性的接合子，三亲本接合具体方法可参考Turner等所述(1985)。随机挑选2株接合子，分别提取总DNA作为模板，以根据自杀质粒pK18mob的序列和XC_0450终止密码子下游的DNA序列分别设计的引物P18conF(GCCGATTCATTAATGCAGCTGGCAC)和C0450R1(ATCCCGAGTAGCGAATCACC)进行PCR验证，以8004菌株作为对照。根据设计，如XC_0450被整合突变，可从突变体的总DNA中扩增出约1216bp的PCR产物。
PCR反应结果如图1所示，以接合子总DNA为模板时，扩增所获得DNA片段约1216bp，与预期的大小相符，证实了这些接合子是XC_0450的整合突变体，命名为0450nK。
实施例2
XC_ 0450基因的克隆、序列测定及携带多个拷贝XC_0450基因的基因工程菌的构建
根据XC_0450基因的DNA序列(NC_007086，Qian et al.，2005)，设计引物C0450F/R(C0450F：CCCGGATCCTAGCGTGGAGAAACGACGAT；C0450R：CCCAAGCTTATCCCGAGTAGCGAATCACC)，以Xcc 8004菌株总DNA为模板，采用PCR法(95℃预变性4min；95℃变性1min，55℃复性30s，74℃延伸2min，30个循环；74℃延伸5min)扩增该基因全长序列(包含 XC_0450基因编码区上游63bp和下游31bp的1165bp的DNA片段)。为方便克隆，在引物的5′端分别加上BamHI和HindIII的酶切位点序列(上述DNA引物序列中带有下划线的部分)。将所获得的DNA片段克隆至载体pGEM3Zf(+)中，用Sanger末端中止法在ABI 377DNA自动测序仪上测定DNA核苷酸序列(见序列1)。将测序验证正确的XC_0450基因的DNA片段克隆到广谱宿主质粒pLAFR3位点上，获得了含该基因的重组质粒pL0450。该质粒用BamH、HindIII酶切，除了一条约22kb的载体DNA片段外，还有一条约1.2kb的外源片段，如图2所示。
构建携带多拷贝的XC_0450基因的基因工程菌的实施，是采用Turner等所述的三亲本接合法将重组质粒pL0450导入Xcc野生型菌株8004，获得携带重组质粒pL0450的基因工程菌株8004/pL0450，请参见图3。
实施例3
XC_0450基因突变体及工程菌8004/pL0450与黄原胶产量相关的检测
Xcc黄原胶产量的定性定量检测是参照Tang等(Mol.Gen.Genet.1991，226：409-417)所描述方法进行。
(1)定性检测
将XC_0450基因的突变体0450nK、携带多拷贝XC_0450的基因工程菌8004/pL0450接种到10mL的NYG(每升溶液含5g的peptone，3g的yeast extract和20g的glycerol，pH 7.0；Daniels et al.，1984)培养基中，28℃摇床培养过夜后，用移液器精确取1μL的培养物，分别接种于含2％葡萄糖或蔗糖的NYG培养基平板，以野生型菌株8004作对照，培养5d。
结果可见突变体0450nK形成的菌落要比野生型菌株8004小，而工程菌8004/pL0450形成的菌落则比野生型菌株较大较圆润粘稠，如图3所示。这表明与野生型菌株8004相比，突变体0450nK的黄原胶产量可能降低，而工程菌8004/pL0450的产量增加。
(2)定量检测
为准确衡量EPS的产量，采用摇瓶发酵准确测定Xcc菌株的产量。将菌 株培养在分别添加有葡萄糖和蔗糖的NYG液体培养基中，培养3d后，8004菌株、突变体0450nK以及工程菌8004/pL0450分别在含葡萄糖、蔗糖的培养基中黄原胶产量如表1所示。
表1
从表1数据可以看出，与野生型菌株相比，突变体0450nK使黄原胶产量减少了80％以上，而工程菌8004/pL0450的产量则增加15％以上，这表明在Xcc野生型菌株中增加XC_0450基因的拷贝数，可以提高提高黄原胶的产量。
从本实施例可以看出，本发明鉴定的基因其失活会直接导致Xcc的黄原胶产量下降，而增加该基因的拷贝数则能提高黄原胶的产量。因此，本发明鉴定的基因可以用于通过遗传工程(或称基因工程)改良黄原胶生产菌种。本领域技术人员可以根据本说明书的教导和启示，构建、选育出高产优质的黄原胶生产菌株。
参考文献
Daniels，M.J.，Barber，C.E.，Turner，P.C.，Sawczyc，M.K.，Byrde，R.J.W.& Fielding，A.H.(1984).Clonging of genes involved in pathogenicity of Xanthomonas campestris pv.campestris using the broad-host-range cosmid pLAFR1.EMBO J3，3323-3328.
Qian，W.，Jia，Y.，Ren，S.X.et al.(2005).Comparative and functional genomic analyses of the pathogenicity of phytopathogen Xanthomonas campestris pv.campestris.Genome Res 15，757-767.
Staskawicz，B.，Dahlbeck，D.，Keen，N.& Napoli，C.(1987).Molecular characterization of cloned avirulence genes from race 0 and race 1 of Pseudomonas syringae pv.glycinea.J Bacteriol 169，5789-5794.
Tang，J.L.，Liu，Y.N.，Barber，C.E.，Dow，J.M.，Wootton，J.C.& Daniels，M.J.(1991).Genetic and molecular analysis of a cluster of rpf genes involved in positive regulation of synthesis of extracellular enzymes and polysaccharide in Xanthomonas campestris pathovar campestris.Mol.Gen.Genet.226：409-417.
Turner，P.，Barber，C.E.& Daniels，M.J.(1985).Evidence for clustered pathogenicity genes in Xanthomonas campestris pv.campestris.Mol Gen Genet 199，338-343.
Windgassen，M.，Urban，A.& Jaeger，K.E.(2000).Rapid gene inactivation in Pseudomonas aeruginosa.FEMS Microbiol.Lett.193：201-205.
XC_0450基因序列表
序列1：DNA序列
TAGCGTGGAGAAACGACGATGAGCGCACAACCGAACACCACTGCAACGCGCCCGGACCCG 60
GGCATGCAGGTCACCACCTTCGAAAATCCGATGGGCATCGACGGGTTCGAATTCGTCGAA 120
TTCGCCGCCCCCGCCGGCCAGGCCGCGCAGTTGCACGACTACTTCCGCAAGATGGGCTTC 180
ACCGCGGTGCTGCGCCATCGCAGCCGCCCGATCACCGTGTATCGCCAGGGCGGGGTGAAC 240
TTTCTGCTCAACGAAGACCCGGATTCGTTCGCGGCCGATTTCGCCGCCGCCCACGGCCCG 300
TGCGCCTGCGGTTTTGCGATCCGCTTCCGCACCCCGGCCGACACCGTGCTGCAGACCGTG 360
CTCGGCAACGGCGGCGAAGCCGTGCAGAAGAAGCCCGACATGCGCGCGGTGCCGGCGCCG 420
GTGGTCAAGGGCATTGGCGATTGCATGCTGTACCTGGTGGACCGCTACGGCGAGGCGGGG 480
AGCATCTACGACGCCGACTACGAGGCAATCGAAGGCGCCGACCAGCACCCGGCCGGCTTC 540
GGGCTCACCTTCATCGACCACCTGACCCACAACCTGTACTTCGGCAACATGCAGCAGTGG 600
TCGGATTACTACGAGCGGCTGTTCAACTTCCGCGAGATCCGCTACTTCGACATCAAGGGC 660
GCCAAGACCGGTTTGGTGTCCAAGGCGATGACTGCCCCGGACGGCATTGTGCGCATTCCG 720
CTCAATGAGTCTTCCGACCCGAAGAGCCAGATCAACGAATACCTGGACGCGTATCAGGGC 780
GAAGGCATTCAGCACATCGCCTGCTTCACCGACGACATCTACACCTCGGTGGAACGGATG 840
CGCGCTGCCGGCGTCACATTCCTGGACACGCCGGACACCTATTTCGACGTGGTGGACCTG 900
CGCATTCCCGATCATGGTGAAGACGTCGAGCGCCTGCGTCGCAACAAGATCCTGATCGAC 960
GCCGACGTGGACACCAAACAGCGCAAGTTGCTGCAGATCTTCACCACCAACTGCATCGGC 1020
CCGATCTTCTTCGAGATCATCCAGCGCAAGGGCAATGAAGGCTTCGGCGAAGGCAACTTC 1080
CAGGCCTTGTTCGAAAGCATCGAGCGCGATCAGATGAAGCGTGGGGTGCTTTGATAGCCG 1140
GGATGGGTGATTCGCTACTCGGGAT 1165
序列2：蛋白质序列
Met Gln Val Thr Thr Phe Glu Asn Pro Met Gly Ile Asp Gly Phe
5 10 15
Glu Phe Val Glu Phe Ala Ala Pro Ala Gly Gln Ala Ala Gln Leu
20 25 30
His Asp Tyr Phe Arg Lys Met Gly Phe Thr Ala Val Leu Arg His
35 40 45
Arg Ser Arg Pro Ile Thr Val Tyr Arg Gln Gly Gly Val Asn Phe
50 55 60
Leu Leu Asn Glu Asp Pro Asp Ser Phe Ala Ala Asp Phe Ala Ala
65 70 75
Ala His Gly Pro Cys Ala Cys Gly Phe Ala Ile Arg Phe Arg Thr
80 85 90
Pro Ala Asp Thr Val Leu Gln Thr Val Leu Gly Asn Gly Gly Glu
95 100 105
Ala Val Gln Lys Lys Pro Asp Met Arg Ala Val Pro Ala Pro Val
110 115 120
Val Lys Gly Ile Gly Asp Cys Met Leu Tyr Leu Val Asp Arg Tyr
125 130 135
Gly Glu Ala Gly Ser Ile Tyr Asp Ala Asp Tyr Glu Ala Ile Glu
140 145 150
Gly Ala Asp Gln His Pro Ala Gly Phe Gly Leu Thr Phe Ile Asp
155 160 165
His Leu Thr His Asn Leu Tyr Phe Gly Asn Met Gln Gln Trp Ser
170 175 180
Asp Tyr Tyr Glu Arg Leu Phe Asn Phe Arg Glu Ile Arg Tyr Phe
185 190 195
Asp Ile Lys Gly Ala Lys Thr Gly Leu Val Ser Lys Ala Met Thr
200 205 210
Ala Pro Asp Gly Ile Val Arg Ile Pro Leu Asn Glu Ser Ser Asp
215 220 225
Pro Lys Ser Gln Ile Asn Glu Tyr Leu Asp Ala Tyr Gln Gly Glu
230 235 240
Gly Ile Gln His Ile Ala Cys Phe Thr Asp Asp Ile Tyr Thr Ser
245 250 255
Val Glu Arg Met Arg Ala Ala Gly Val Thr Phe Leu Asp Thr Pro
260 265 270
Asp Thr Tyr Phe Asp Val Val Asp Leu Arg Ile Pro Asp His Gly
275 280 285
Glu Asp Val Glu Arg Leu Arg Arg Asn Lys Ile Leu Ile Asp Ala
290 295 300
Asp Val Asp Thr Lys Gln Arg Lys Leu Leu Gln Ile Phe Thr Thr
305 310 315
Asn Cys Ile Gly Pro Ile Phe Phe Glu Ile Ile Gln Arg Lys Gly
320 325 330
Asn Glu Gly Phe Gly Glu Gly Asn Phe Gln Ala Leu Phe Glu Ser
335 340 345
Ile Glu Arg Asp Gln Met Lys Arg Gly Val Leu
350 355
XC_0450基因序列表
序列1：DNA序列
TAGCGTGGAGAAACGACGATGAGCGCACAACCGAACACCACTGCAACGCGCCCGGACCCG 60
GGCATGCAGGTCACCACCTTCGAAAATCCGATGGGCATCGACGGGTTCGAATTCGTCGAA 120
TTCGCCGCCCCCGCCGGCCAGGCCGCGCAGTTGCACGACTACTTCCGCAAGATGGGCTTC 180
ACCGCGGTGCTGCGCCATCGCAGCCGCCCGATCACCGTGTATCGCCAGGGCGGGGTGAAC 240
TTTCTGCTCAACGAAGACCCGGATTCGTTCGCGGCCGATTTCGCCGCCGCCCACGGCCCG 300
TGCGCCTGCGGTTTTGCGATCCGCTTCCGCACCCCGGCCGACACCGTGCTGCAGACCGTG 360
CTCGGCAACGGCGGCGAAGCCGTGCAGAAGAAGCCCGACATGCGCGCGGTGCCGGCGCCG 420
GTGGTCAAGGGCATTGGCGATTGCATGCTGTACCTGGTGGACCGCTACGGCGAGGCGGGG 480
AGCATCTACGACGCCGACTACGAGGCAATCGAAGGCGCCGACCAGCACCCGGCCGGCTTC 540
GGGCTCACCTTCATCGACCACCTGACCCACAACCTGTACTTCGGCAACATGCAGCAGTGG 600
TCGGATTACTACGAGCGGCTGTTCAACTTCCGCGAGATCCGCTACTTCGACATCAAGGGC 660
GCCAAGACCGGTTTGGTGTCCAAGGCGATGACTGCCCCGGACGGCATTGTGCGCATTCCG 720
CTCAATGAGTCTTCCGACCCGAAGAGCCAGATCAACGAATACCTGGACGCGTATCAGGGC 780
GAAGGCATTCAGCACATCGCCTGCTTCACCGACGACATCTACACCTCGGTGGAACGGATG 840
CGCGCTGCCGGCGTCACATTCCTGGACACGCCGGACACCTATTTCGACGTGGTGGACCTG 900
CGCATTCCCGATCATGGTGAAGACGTCGAGCGCCTGCGTCGCAACAAGATCCTGATCGAC 960
GCCGACGTGGACACCAAACAGCGCAAGTTGCTGCAGATCTTCACCACCAACTGCATCGGC 1020
CCGATCTTCTTCGAGATCATCCAGCGCAAGGGCAATGAAGGCTTCGGCGAAGGCAACTTC 1080
CAGGCCTTGTTCGAAAGCATCGAGCGCGATCAGATGAAGCGTGGGGTGCTTTGATAGCCG 1140
GGATGGGTGATTCGCTACTCGGGAT 1165
序列2：蛋白质序列
Met Gln Val Thr Thr Phe Glu Asn Pro Met Gly Ile Asp Gly Phe
5 10 15
Glu Phe Val Glu Phe Ala Ala Pro Ala Gly Gln Ala Ala Gln Leu
20 25 30
His Asp Tyr Phe Arg Lys Met Gly Phe Thr Ala Val Leu Arg His
35 40 45
Arg Ser Arg Pro Ile Thr Val Tyr Arg Gln Gly Gly Val Asn Phe
50 55 60
Leu Leu Asn Glu Asp Pro Asp Ser Phe Ala Ala Asp Phe Ala Ala
65 70 75
Ala His Gly Pro Cys Ala Cys Gly Phe Ala Ile Arg Phe Arg Thr
80 85 90
Pro Ala Asp Thr Val Leu Gln Thr Val Leu Gly Asn Gly Gly Glu
95 100 105
Ala Val Gln Lys Lys Pro Asp Met Arg Ala Val Pro Ala Pro Val
110 115 120
Val Lys Gly Ile Gly Asp Cys Met Leu Tyr Leu Val Asp Arg Tyr
125 130 135
Gly Glu Ala Gly Ser Ile Tyr Asp Ala Asp Tyr Glu Ala Ile Glu
140 145 150
Gly Ala Asp Gln His Pro Ala Gly Phe Gly Leu Thr PheIle Asp
155 160 165
His Leu Thr His Asn Leu Tyr Phe Gly Asn Met Gln Gln Trp Ser
170 175 180
Asp Tyr Tyr Glu Arg Leu Phe Asn Phe Arg Glu Ile Arg Tyr Phe
185 190 195
Asp Ile Lys Gly Ala Lys Thr Gly Leu Val Ser Lys Ala Met Thr
200 205 210
Ala Pro Asp Gly Ile Val Arg Ile Pro Leu Asn Glu Ser Ser Asp
215 220 225
Pro Lys Ser Gln Ile Asn Glu Tyr Leu Asp Ala Tyr Gln Gly Glu
230 235 240
Gly Ile Gln His Ile Ala Cys Phe Thr Asp Asp Ile Tyr Thr Ser
245 250 255
Val Glu Arg Met Arg Ala Ala Gly Val Thr Phe Leu Asp Thr Pro
260 265 270
Asp Thr Tyr Phe Asp Val Val Asp Leu Arg Ile Pro Asp His Gly
275 280 285
Glu Asp Val Glu Arg Leu Arg Arg Asn Lys Ile Leu Ile Asp Ala
290 295 300
Asp Val Asp Thr Lys Gln Arg Lys Leu Leu Gln Ile Phe Thr Thr
305 310 315
Asn Cys Ile Gly Pro Ile Phe Phe Glu Ile Ile Gln Arg Lys Gly
320 325 330
Asn Glu Gly Phe Gly Glu Gly Asn Phe Gln Ala Leu Phe Glu Ser
335 340 345
Ile Glu Arg Asp Gln Met Lys Arg Gly Val Leu
350 355
Claims (5)
1.一种编码4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的基因在黄原胶生产中的应用，所述基因是序列表中序列1的DNA序列；所述基因用于构建及选育黄原胶高产的基因工程菌；所述基因工程菌的获得方法包括：利用所述基因构建该基因的重组质粒或多拷贝的重组质粒，并导入野油菜黄单胞菌野油菜变种Xcc的野生型菌株8004中。
2.按照权利要求1所述的编码4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的基因在黄原胶生产中的应用，其特征在于，在所述基因工程菌的获得方法中，采用三亲本接合法将所述重组质粒或所述多拷贝的重组质粒导入所述Xcc野生型菌株8004中。
3.按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于，
所述序列1的DNA序列是所述Xcc野生菌株8004的基因组中的一段DNA序列，由1071个核苷酸组成，是含完整的所述编码4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的基因，自5′端的第64～第1131位核苷酸为该基因的开放阅读框(ORF)，自5′端的第64～第66位核苷酸为该基因的起始密码子ATG，自5′端的第1132～第1134位核苷酸为该基因的终止密码子TAG。
4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，
在序列表中序列2的蛋白质是所述基因编码的4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的氨基酸序列，由356个氨基酸组成；所述蛋白质预测分子量为39968.10道尔顿，等电点为4.99。
5.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，含有所述基因的表达载体为所述基因的重组质粒。
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| 陆光涛等.野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中一个与EPS合成有关的新基因的鉴定.《生物工程学报》.2003,第19卷(第6期),661-667. * |
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